专利名称：生产蛋白质含量提高的水稻种子的新方法
技术领域：
本发明属于作物育种领域，具体地说，本发明涉及蛋白质含量提高的水稻种子的生产方法。
背景技术：
在水稻品质中，食味品质是一个非常重要的方面。Capamang等人(Capampang，C.B.等，Sci.Fd.Agri，1973，241589-1594；Juliano，B.O.，Cereal Sci.Today，1971，16334-338，340，360；Khush，G.S.等，Chemical Aspects of Rice Grain Quality，197921-32)曾提出评价稻米食味品质的几项指标直链淀粉含量、糊化温度和胶稠度等。在评价稻米食味品质的多项指标中，直链淀粉含量的高低是一项最重要的指标。稻米直链淀粉含量越高，米煮饭胀性大，饭干松而色淡，冷后质硬，食味越差；低直链淀粉含量的米煮饭胀性小，饭较湿粘、软而有光泽，食味相对较好。
蛋白质是生命的基础，它对人体有着极其重要的作用。由于发展不平衡，不同地区的人们膳食结构差异很大。在难以从动物性食物补充蛋白质、而又以稻米为主食的贫困地区，人们食物中的蛋白质来源就只能取自于稻米；在经济发展较快的大城市，虽然已不存在蛋白质摄取不足的问题，但大城市日益增多的糖尿病患者们需要高蛋白、低碳水化合物主食；对于有些不能食用动物蛋白的特殊疾病患者，也需要市场能够提供优质的植物蛋白。
水稻营养品质的主要指标是稻米蛋白质含量。椐报道普通稻米蛋白质含量虽然较低，一般仅为8％左右(Juliano等，Cereal Science Today，1968299-313；Juliano等，Journalofthe Science of Food and Agri-culture，1973，24(1)295-306；Boulter等，Nucleic Acidsand Proteins in Plants I，Berlin，Springer-Verlag，1982；甄海等，华南农业大学学报，1997，18(14)16-20)，但与小麦、大麦、玉米等主要谷类作物相比，稻米蛋白质中的氨基酸组成比较平衡，蛋白价较高，易于被人体消化吸收，属于优良蛋白质(宋文昌等，特种稻栽培与利用，科学出版社，199719-20；闵绍揩等，水稻育种学，中国农业出版社，1996，322-354；熊振民等，水稻文摘，1992，12(3)1-6)。因此，从生产优质植物蛋白质角度考虑，有必要进行高蛋白水稻的育种。
水稻高蛋白育种在国内和国际上一直受到很大重视。在20世纪70-80年代，日本学者曾采用辐射诱变及化学试剂处理试图提高稻米蛋白质含量。20世纪90年代有人采用高蛋白物种的总DNA直接导入等技术培育高蛋白水稻。随着水稻转基因技术的完善，在1999年日本京都大学的学者成功地将一个大豆贮藏蛋白基因导入水稻，在对转基因后代检测中显示稻米蛋白质含量比对照提高20％(Momma K等，BiosciBiotechnol Biochem，1999，63(2)314-318)。
虽然这些前人的研究在提高稻米蛋白质含量上应该还是具有一定的效果的，但是据报道，种子蛋白质是由多基因编码的性状，如只采用导入单一基因的方式，可能很难实现大幅度、全面均衡地提高稻米蛋白质含量的目的。
因此，本领域中仍然需要有新的蛋白质含量提高的水稻的生产方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种生产蛋白质含量提高的水稻种子的方法。
本发明提供了一种生产蛋白质含量提高的水稻种子的方法，该方法包括a)用含有水稻蜡质基因反义序列的表达载体转化水稻，b)使步骤a)获得的水稻生长并收获后代水稻；c)鉴定出蛋白质含量提高的后代水稻种子。
本发明者通过研究惊奇地发现，通过将含有水稻蜡质基因反义序列的表达载体转化到水稻中，不仅能够降低稻米直链淀粉的含量，同时的确还可以提高稻米的蛋白质含量，从而实现了通过采用导入单一基因的方式来实现大幅度、全面均衡地提高稻米蛋白质含量的目的，为改良水稻稻米营养品质和食味品质提供了新的思路。
图1显示了双元载体p13W4 T-DNA区结构图，其中232Wx-pro、232Int.1水稻232 Waxy基因的启动子和内含子1；Wx frag水稻232 Waxy基因的反义DNA片段(756bp)；LB、RBT-DNA的左右边界；Nos-terNos基因终止子；35S-pro、35S-terCaMV 35S基因启动子和终止子；GUSβ-葡萄糖醛酸糖苷酶基因；HPT潮霉素抗性基因；XhXhoI；EEcoRI，SaSacI；BBamHI；XXbaI；SSalI；PPstI；HHindIII。
具体实施例方式
本发明提供了一种生产蛋白质含量提高的水稻种子的方法，该方法包括a)用含有水稻蜡质基因反义序列的表达载体转化水稻；
b)使步骤a)获得的水稻生长并收获后代水稻；d)鉴定出蛋白质含量提高的后代水稻种子。
在上述方案中，所用水稻不局限于任何特定的品种(系)。在一个较佳的实施方案中，所用的水稻为超2-10粳稻品系。
本发明所用的水稻蜡质基因(waxy基因)在水稻第3号染色体上，它控制着胚乳中直链淀粉的合成(Khush等，1984，Genetics，107141-167)。该基因只在水稻的花粉、胚乳与胚囊中高效表达，因此它是时空专一性表达的基因。关于用含水稻蜡质基因反义序列的表达载体(如p13W4)转化水稻的具体方案，可参见专利申请出版物CN1298021A，该文全部纳入本文作为参考。
本发明所用的表达载体并不局限于任何特定的表达载体。构建本发明的表达载体的技术也是本领域普通技术人员所熟知的，并可在诸如Sambrook等人(1989年，《分子克隆实验指南》)的参考文献中找到。
转化方法是本领域中熟知的。在一个较佳的实例中，可按照例如Hiei等人(1994)Plant J，6271-6282中描述的方法，利用根癌农杆菌法进行转化。
在将含水稻蜡质基因反义序列的表达载体转化入水稻后，可用常规方法使水稻生长并栽培获得其后代，然后鉴定出水稻种子蛋白质含量提高的水稻单株。关于蛋白质含量的测定可采用本领域中的常规技术，如微量凯氏定氮法(朱展才，稻麦质量分析，中国食品出版社，1988)。
下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。
实施例本实施例是将能够降低稻米直链淀粉含量的反义蜡质基因导入水稻，从转基因后代中选出部分单株进行稻米直链淀粉含量和蛋白质含量测定。
1.试验材料由上海市农业科学院作物所陆家安副研究员提供的超2-10粳稻；农杆菌菌株EHA105及双元载体p13W4，由中科院上海植物生理与生态研究所王宗阳研究员提供。该载体是在pCAMBIA1300的多克隆位点上插入Waxy-GUS融合基因。该质粒上有唯一的BamHI限制性酶切位点，它位于Waxy基因启动区与GUS基因编码区之间。在该位点上还插入了一段756bp反向的waxy基因BamHI片段(来自籼稻品种232)(如图1所示)。
2.试验方法根癌农杆菌的培养、水稻转化及抗性愈伤组织的筛选及植株再生主要参照刘巧泉的方法(刘巧泉等，植物生理学报，1998，24(3)259-271)进行。
1)水稻幼胚愈伤组织的诱导及培养取开花授粉后12～15天的未成熟种子(带壳)用70％乙醇浸泡2分钟后用无菌水漂洗，再用2.5％NaClO3消毒90分钟，用无菌水冲洗4～5次，用解剖刀挑取幼胚于N6D2培养基上诱导愈伤组织，26℃，暗培养，4-6天后可用于农杆菌感染。
2)根癌农杆菌的培养及水稻转化自YEB平板上挑取一根癌农杆菌单菌落于5ml YEB(Km 50μg/ml)液体培养基于28℃振摇(100rpm)培养过夜。第2天从中吸取0.5ml，转接入50ml AB(Km 25μlg/ml)液体培养基于28℃振摇(190～200rpm)培养过夜。第3天将菌液于4000rpm离心15分钟，倒去上清液，重悬于3/5体积的AAM(AS100μM)液体培养基中，使最终菌液OD600值为0.45左右，用于水稻的遗传转化。
准备好N6D2C转化培养基，在平板上垫一层无菌滤纸。将幼胚愈伤挑入Φ6cm培养皿中，用AAM重悬的菌液浸泡，其间不时摇动。20分钟后将愈伤挑出，用无菌纸吸干，转移到上述N6D2C共培养基上于26℃共培养3天。
共培养时，除特殊处理外，在共培养基AAM中添加100μM的乙酰丁香酮(AS)作为农杆菌Vir基因的活化诱导物。
3)抗性愈伤组织的筛选及植株再生幼胚与农杆菌共培养3天后，转入筛选培养基S1进行筛选(幼胚去胚根)，2周后转入继代筛选培养基S2，4周后选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到分化培养基MSRCH上分化(光照12小时/天)；再生的小苗在生根培养基1/2MS0H上生根壮苗，随后移入温室盆栽，直至形成T1代水稻种子。
利用PCR和Southern杂交鉴定转基因水稻(Sambrook J等，分子克隆实验指南第二版，北京科学出版社，1992)，再通过T1和T2代稻米GUS显色(Jefferson RA.，Plant Mol Biol Rep，1987，5387-405)结果选出部分反义-Waxy纯合的T2代种子，然后通过对纯合单株种子(糙米)进行蛋白质含量和直链淀粉含量的分析，筛选出蛋白质含量提高的单株。
稻米蛋白质含量采用微量凯氏定氮法(朱展才，稻麦质量分析，中国食品出版社，1988)进行分析。稻米直链淀粉含量分析参照中华人民共和国农业部颁发标准“NY147-88米质测定法”的改进简化法进行(中华人民共和国农业部标准，中国标准出版社，1988，北京，1-10)。
经检测对照稻米直链淀粉平均含量为13.4％，蛋白质平均含量为9.5％。在16个被检测的转反义蜡质基因超2-10粳稻后代中，有7个单株稻米在直链淀粉含量降低的同时，稻米蛋白质含量提高程度明显。其中有一单株稻米直链淀粉含量降低明显，为11.4％，而它的蛋白质含量也相对最高，为13.5％，比对照提高42.11％。
日本京都大学的学者在1999年曾将一个大豆贮藏蛋白基因导入水稻，转基因后代检测显示稻米蛋白质含量比对照提高20％(Momma K等，Biosci Biotechnol Biochem，1999，63(2)314-318)。在本发明试验中通过导入转反义蜡质基因，纯合的T2代稻米蛋白质含量提高的幅度明显超过Momma K等人的研究，从而实现了通过降低稻米内某种成分，如直链淀粉含量，来提高稻米蛋白质含量的目的。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
权利要求
1.一种生产蛋白质含量提高的水稻种子的方法，其特征在于，该方法包括a)用含有水稻蜡质基因反义序列的表达载体转化水稻；b)使步骤a)获得的水稻生长并收获后代水稻；c)鉴定出蛋白质含量提高的后代水稻种子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水稻为粳稻超2-10品系。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达载体通过根癌农杆菌法转化水稻。
全文摘要
本发明提供了一种生产蛋白质含量提高的水稻种子的新方法该方法包括a)用含有水稻蜡质基因反义序列的表达载体转化水稻；b)使步骤a)获得的水稻生长并收获后代水稻；c)鉴定出蛋白质含量提高的后代水稻种子。本发明的方法为改良水稻稻米营养品质和食味品质提供了新思路。
文档编号A01H1/00GK1552874SQ0312900
公开日2004年12月8日 申请日期2003年6月2日 优先权日2003年6月2日
发明者李建粤, 范士靖, 吕英海, 毛万霞, 徐丽 申请人:上海师范大学