专利名称：稳定的免疫调节寡核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、免疫学和医学领域。更具体地，本发明涉及免疫刺激性寡核苷酸及其在治疗中的应用。
背景技术：
免疫系统已进化为特异性识别含有未甲基化的CpG二核苷酸基序的DNA，所述的基序在病原微生物如细菌和病毒的DNA中广泛存在。结果，含有未甲基化CpG的DNA成为脊椎动物免疫系统的有效刺激剂。通过DNA免疫刺激的第一个报道来自应用细菌DNA和含有回文序列的DNA小片段的研究，所述的DNA都是具有磷酸二酯骨架的双链结构。Tokunaga，T等(J.Natl.Cancer Inst.72955-962(1984))报道了分离自牛分枝杆菌(Mycocacterium bovis)BCG的DNA有效的抗肿瘤活性。Kataoka，T等.，(Jpn.J.Cancer Res.83244-247(1992))、Hartmann等.(European Journal ofImmunology 331673-1641(2003))、Marshall等(Journal of Leukocyte Biology73781-792(2003)显示了合成的脱氧寡核苷酸的相似类型的抗肿瘤活性，所述合成的脱氧寡核苷酸的设计基于牛分枝杆菌BCG cDNA序列。
Sato，Y，等(Science 273352-354(1996))显示了含有CpG的DNA在DNA疫苗应用中的重要性(也参见Gurunathan S.，等(Annu.Rev.Immunol.18927-974(2000))。Pisetsky，D.S.，等(Mol.Biol.Rep.18217-221(1993))和Krieg，A.M.，等.，(Nature 374546-549(1995))显示，在特定序列的环境中含有未甲基化的CpG-二核苷酸的DNA(CpG DNA)激活脊椎动物的免疫系统，导致B细胞增殖，并且激活巨噬细胞、单核细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)和树突细胞。出于对CpG DNA激活的应答，免疫细胞分泌大量的细胞因子，包括IL-12、IFN-γ、INF-α、IL-6和TNF-α，并且表达几个共刺激分子(例如，参见Pisetsky，D.S.，等和Krieg，A.M.，等，见前文)Kandimalla，E.R.，等(Curr.Opin.Mol.Ther.4 122-129(2002))指出CpG-二核苷酸的存在和位置以及其侧翼的序列对于其免疫刺激活性是关键的。Agrawal，S.，等(Current Cancer Drug Targets 1197-209(2001))公开了由于CpG寡核苷酸的侧翼序列中的核糖修饰而产生的重大影响。这些影响取决于取代基的位置和性质，包括2’-O-甲氧基乙氧基和2’-或3’-O-甲基。Yu，D.，等(Bioorg.Med.Chem.92803-2808(2001))证明了磷酸盐修饰因修饰位点不同也能增高或降低免疫刺激活性。Yu D.，等(Bioorg.Med.Chem.Lett.112263-2267(2001))和Yu D.，等(Bioorg.Med.Chem.11459-464(2003))公开了通过缺失某些核苷酸碱基能增加活性。此外Yu D.，等(Bioorg.Med.Chem.11459-464(2003))公开了通过用非核苷酸连接体取代某些侧翼核苷酸可增加免疫刺激活性。
Yu D.，等(Bioorg.Med.Chem.Lett.102585-2588(2000))，Yu D.，等(Nucleic Acids Res.304460-4469(2002))，Yu D.，等(Biochem.Biophys.Res.Commun.29783-90(2002))，Bhagat L.，等(Biochem.Biophys.Res.Commun.300853-861(2003))以及Kandimalla E.R.，等(Nucleic Acids Res.312393-2400(2003))先前已经显示5’-末端参与了受体的识别，该末端的易接近性对于活性是关键的。Kandimalla E.R.，等(Bioconj.Chem.13966-974(2002))公开了5’-末端连接比荧光素大的配基或5’-5’连接的二核苷酸使免疫刺激活性损失。由于3’-连接无影响，因此摄取上的改变不是所述结果的原因(同上)。然而，没有任何系统的研究以阐明DNA的二级结构在引起的免疫应答中的作用。本发明在这里通过具有5’或3’-发夹环或能形成双链体的粘性末端的免疫刺激性DNA提供了免疫刺激的信息。
免疫刺激性DNA诱导Th1细胞因子产生和促进增加免疫球蛋白产生的CTL应答的能力已经用于治疗广谱的疾病适应症，其包括癌症、病毒及细菌感染、炎症性疾病以及作为免疫治疗中的佐剂。因此提高或调节免疫刺激性DNA活性的益处是显而易见的，而且在本技术领域中存在开发改进的免疫刺激性核酸的需求。
发明内容
本发明提供了包括具有增强或降低的免疫刺激性特性的免疫刺激性寡核苷酸的物质的新型组合物。本发明也提供了可进行具有增强或降低的免疫刺激性特性的或具有增加的代谢稳定性的免疫刺激性寡核苷酸的设计的方法。发明人令人惊讶地发现在免疫刺激性寡核苷酸的3’-端或5’-端引入二级结构可以明显影响这些寡核苷酸的免疫刺激活性和稳定性。
第一方面，本发明提供了免疫刺激性核酸。该免疫刺激性核酸包含寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列至少包含一个二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中，C是胞苷或2’-脱氧胞苷，G是鸟苷或2’-脱氧鸟苷C*是胞苷、2′-脱氧胸苷、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’-双脱氧-5-卤代胞苷、2’-双脱氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2′-脱氧-2′-取代阿糖胞苷、2′-O-取代阿糖胞苷、2′-脱氧-5-羟基胞苷、2′-脱氧-N4-烷基-胞苷、2′-脱氧-4-硫代尿苷或其它嘧啶核苷类似物，G*是2′脱氧-7-脱氮-鸟苷、2′-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2′-脱氧-2′取代-阿糖鸟苷、2′-O-取代-阿糖鸟苷、2′-脱氧肌苷或其它嘌呤核苷类似物，p是核苷之间的连接体，其选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在一些优选的实施方案中，寡核苷酸序列在该寡核苷酸序列的3’-末端有二级结构。在一些优选的实施方案中，所述的免疫刺激性二核苷酸不是CpG。
在一些实施方案中，免疫刺激性核酸长度为约2-约50个核苷酸。在一些实施方案中免疫刺激性核酸长度为约12-约26个核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸每个具有约3-约35个核苷残基，优选约4-约30个核苷残基，更优选约4-约20个核苷残基。在一些实施方案中，所述的寡核苷酸具有约5-约18个或约5-约14个核苷残基。如在这里应用的，术语“约”意味着确切的数字并不重要。因而在所述寡核苷酸中核苷残基的数目并不重要，具有1或2个较少的核苷残基的寡核苷酸或者有一个到几个额外核苷残基的寡核苷酸，预期作为前述的每个实施方案的相等物。在一些实施方案中，有一个或多个寡核苷酸有11个核苷酸。
在一些实施方案中，免疫刺激性核酸具有3’-末端茎环二级结构。在一些实施方案中，免疫刺激性核酸通过与互补序列氢键结合的方式在3’-末端具有二级结构。在一些实施方案中，免疫刺激性核酸选自SEQ ID NOS2，3，4，9，12，13，14，18，19，20，21，24，25，26，27，28，29，30，32，33，34，35，36，37或38。
第二方面，本发明提供了具有降低的免疫刺激活性的核酸。在此方面，所述的核酸包含寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列至少包含一个二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中，C是胞苷或2’-脱氧胞苷，G是鸟苷或2’-脱氧鸟苷，C*是2′-脱氧胸苷、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’-双脱氧-5-卤代胞苷、2’-双脱氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2′-脱氧-2′-取代阿糖胞苷、2′-O-取代阿糖胞苷、2′-脱氧-5-羟基胞苷、2′-脱氧-N4-烷基-胞苷、2′-脱氧-4-硫代尿苷，或者其它嘧啶核苷类似物；G*是2′脱氧-7-脱氮鸟苷、2′-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2′-脱氧-2′取代-阿糖鸟苷、2′-O-取代-阿糖鸟苷、2′-脱氧肌苷，或其它嘌呤核苷类似物，p是核苷之间的连接体，选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在一些优选的实施方案中，寡核苷酸序列在该寡核苷酸序列的3’-端具有二级结构。在一些优选的实施方案中，所述的免疫刺激性二核苷酸不是CpG。
在一些实施方案中，所述免疫刺激性核酸是长度为约2-约50个核苷酸的寡核苷酸序列。在一些实施方案中，所述免疫刺激性核酸是长度为约12-约26个核苷酸的寡核苷酸序列。
在一些实施方案中，具有降低的免疫刺激活性的核酸形成5’-端茎环二级结构。在一些实施方案中，具有降低的免疫刺激活性的核酸通过与互补序列氢键结合的方式在5’-端具有二级结构。在一些实施方案中，具有降低的免疫刺激活性的核酸选自SEQ ID NOS5，6，7，10，15，16或17。
第三方面，本发明提供了包含至少2个寡核苷酸的免疫刺激性核酸，其中该免疫刺激性核酸有二级结构。在这个方面，该免疫刺激性核酸包含如公式(I)详细描述的结构结构域A-结构域B-结构域C (I)结构域的长度可为约2-约12个核苷酸。结构域A可以是5’-3’或3’-5或2’-5’DNA、RNA、RNA-DNA、DNA-RNA，它们具有或不具有回文区域或自我互补区域，该区域包含或不包含至少一个二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中，C是胞苷或2’-脱氧胞苷，G是鸟苷或2’脱氧鸟苷，C*是2′-脱氧胸苷、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’-双脱氧-5-卤代胞苷、2’-双脱氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2′-脱氧-2′-取代阿糖胞苷、2′-O-取代阿糖胞苷、2′-脱氧-5-羟基胞苷、2′-脱氧-N4-烷基-胞苷、2′-脱氧-4-硫代尿苷，或者其它嘧啶核苷类似物；G-是鸟苷或2′脱氧鸟苷、2′脱氧-7-脱氮鸟苷、2′-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2′-脱氧-2′取代-阿糖鸟苷、2′-O-取代-阿糖鸟苷、2′-脱氧肌苷或其它嘌呤核苷类似物。在一些实施方案中，结构域A具有一个以上二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*。
结构域B，如下文图示的“X”，是一个连接结构域A和结构域C的连接体，其可以是一个3’-5’连接、2’-5’连接、3’-3’连接，可以是磷酸基团、核苷，或者非核苷连接体，所述的非核苷连接体可以是脂肪族的、芳香族的、芳基的、环状的，手性、非手性的，可以是肽，碳水化合物、脂类、脂肪酸、单-、三-或六聚乙二醇，或者杂环部分。在一些实施方案中，结构域B优选非核苷酸连接体，其连接结构域A和结构域C的寡核苷酸，它们被称为“免疫子(immunomer)”。
结构域C可以是5’-3’或3’-5’、2’-5’DNA、RNA、RNA-DNA，DNA-RNAPoly I-Poly C，它们具有或不具有回文序列或自我互补序列，该序列具有或不具有二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中C是胞苷或2’-脱氧胞苷，G是鸟苷或是2’-脱氧鸟苷，C*是2′-脱氧胸苷，1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤，阿糖胞苷，2′-脱氧-2′-取代阿糖胞苷，2′-O-取代阿糖胞苷，2′-脱氧-5-羟基胞苷，2′-脱氧-N4-烷基-胞苷，2′-脱氧-4-硫代尿苷，或者其它嘧啶核苷类似物，G*是2′-脱氧-7-脱氮鸟苷，2′-脱氧-6-硫代鸟苷，阿糖鸟苷，2′-脱氧-2′-取代-阿糖鸟苷，2′-O-取代-阿糖鸟苷，2′-脱氧肌苷，或其它嘌呤核苷类似物，p是核苷之间的连接体，其选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在一些优选的实施方案中，免疫刺激性二核苷酸不是CpG。在一些优选的实施方案中，结构域C没有二核苷酸CpG，C*pG，C*pG*或CpG*。
在一些实施方案中，公式(I)中所包括的寡核苷酸长度为约2-约50个核苷酸。在一些实施方案中，公式(I)中所包括的寡核苷酸长度为约12-约26个核苷酸。
通过非限制性实施例的方式，在该方面的一些实施方案中，免疫刺激性核酸会有如公式(II)详细描述的结构。
该领域的技术人员会识别出，在该分子的3’端有分子内茎环形式的二级结构元件。
通过非限制性实施例的方式，在该方面的一些实施方案中，免疫刺激性核酸会有如公式(III)详细描述的结构。
此处由公式(III)描述的结构被称为“末端二聚体”，因为两个分子的3’端由于两个3’端序列互补允许分子间氢键结合而封闭。另外，结构域A和A’区可以等同也可以不等同，结构域B和B’区可以等同也可以不等同，结构域C和C’区可以等同也可以不等同。
通过非限制性实施例的方式，在该方面的一些实施方案中，免疫刺激性核酸会有如公式(IV)详细描述的结构。
该领域的技术人员会识别出，在所描述的分子的3’端有二级结构，由于其3’端的互补序列通过氢键结合在这个区域。
在一些实施方案中，本发明的免疫刺激性核酸具有选自SEQ ID NOS1-38的序列。在一些实施方案中，本发明的免疫刺激性核酸具有选自SEQ IDNOS39-68的序列。
第四方面，本发明提供了降低或去除寡核苷酸的免疫刺激活性的方法。该方法包括在该寡核苷酸的5’-端引入包含二级结构的核酸序列。在该方面一些实施方案中，所述的二级结构是茎-环结构。在该方面一些实施方案中，所述的二级结构是通过在所述寡核苷酸序列的5’-端氢键结合互补序列而获得的。
第五方面，本发明提供了提高免疫刺激性寡核苷酸稳定性的方法。该方法包括在免疫刺激性寡核苷酸的3’-端引入含二级结构的核酸序列。在该方面的一些实施方案中，该二级结构是茎环结构。在该方面的一些实施方案中，该二级结构是通过在所述寡核苷酸序列的3’-端氢键结合互补序列而获得的。
第六方面，本发明提供了调节免疫刺激性寡核苷酸的免疫刺激活性的方法。该方法包括在免疫刺激性寡核苷酸的3’-端或5’-端引入含二级结构的核酸序列。在该方面的一些实施方案中，该二级结构是茎环结构。在该方面的一些实施方案中，该二级结构是通过在所述寡核苷酸的3’-端或5’-端氢键结合互补序列而获得的。
第七方面，本发明提供了药物组合物。这些组合物包括单独或组合在本发明第一、二、三、四、五、六方面公开的任何一种组合物，以及可药用的载体。
图1A是一个示意图，其显示在BALB/c小鼠脾细胞培养物中，由寡核苷酸1，2，和5在浓度为1.0μg/mL时诱导的细胞增殖。
图1B是一个示意图，其显示通过将寡核苷酸1，2，和5以5mg/kg的剂量向BALB/c小鼠腹膜内给药诱导的脾肿大。
图2是一个示意图，其显示在BALB/c小鼠脾细胞培养物中，与寡核苷酸1-7在浓度为3μg/mL温育24小时后，诱导细胞因子IL-12和IL-6的情况。
图3是一个示意图，其显示在BALB/c小鼠脾细胞培养物中，与寡核苷酸8-10在浓度为3μg/mL温育24小时后，诱导细胞因子IL-12和IL-6的情况。
图4显示，用10μg/mL的寡核苷酸1-8在刺激1小时后，J774巨噬细胞中的NF-κB途径的激活。M代表用培养基处理的对照，C是用非-CpG寡核苷酸处理的细胞。
图5是一个示意图，其显示在J774巨噬细胞培养物中，寡核苷酸1-7在浓度为10μg/mL时，诱导细胞因子IL-12和IL-6。M代表用PBS处理的对照，ND是指没有检测到。
图6是一个示意图，其显示暴露在浓度为10μg/ml的寡核苷酸11，12，14，15和17之后，浆细胞样树突状细胞中α-干扰素(IFN-α)的诱导。
图7是一个示意图，其显示暴露在浓度为10μg/ml的寡核苷酸18，19，20和21之后，浆细胞样树突状细胞中α-干扰素(IFN-α)的诱导。
图8是一个示意图，其显示暴露在浓度为10μg/ml的寡核苷酸41，44和45之后，浆细胞样树突状细胞中α-干扰素(IFN-α)的诱导。
图9是平行合成本发明的免疫子(immunomer)的合成方案。DMTr＝4，4′二甲氧基三苯甲基，CE＝氰乙基。
图10描述一组有代表性的，适合线性合成本发明的免疫子的小分子连接体。
图11是线性合成本发明的免疫子的合成方案。DMTr＝4，4′二甲氧基三苯甲基，CE＝氰乙基。
图12描述一组有代表性的，适合平行合成本发明免疫子的小分子连接体。
图13自我稳定的CpG DNA(A)通过人pDC诱导IFN-α分泌及(B)诱导人B-细胞在培养物中的增殖。(A)pDC从5-8个健康捐献者的人PBMC中分离，用浓度为10μg/mL的CpG DNA刺激24小时，并通过ELISA检测上清液的IFN-α分泌。(B)B细胞从4-7个健康捐献者的人PBMC中分离，用浓度为1μg/mL的CpG DNA刺激72小时，检测[3H]-胸苷摄取。符号代表从每个捐献者获取的数据，而加号代表两个图面中所有捐献者的平均值。
图14人B细胞增殖对CpG DNA浓度的依赖性。B细胞从4-6个健康捐献者的人PBMC中分离，用不同浓度的CpG DNA刺激72小时。数据显示的是平均值±SD图15(A)CpG基序以及二级结构的存在对于通过人pDC诱导IFN-α分泌来说是必需的。显示的数据是6-8个人捐献者在CpG DNA浓度为10μg/mL的平均值±SD。(B)人B-细胞增殖需要DNA中有CpG刺激基序的存在而不是二级结构。数据显示的是5-8个捐献者在CpG DNA浓度为1μg/mL的平均值±SD。
图16发夹二级结构中的2’-O-甲基核糖核苷酸片段(A)对于通过人pDC分泌IFN-α的影响和(B)对于人B-细胞增殖的影响。显示的数据是在pDC培养物中在10μg/mL的CpG DNA浓度6-8个人捐献者的平均值±SD和在B细胞培养物中在1μg/mL的CpG DNA浓度5-8个捐献者的平均值±SD。
发明详述本发明提供了包括具有增强或降低的免疫刺激性特性的免疫刺激性寡核苷酸的物质的新型组合物。本发明也提供了得以设计具有增强或降低的免疫刺激性特性的或具有增加的代谢稳定性的免疫刺激性寡核苷酸的方法。发明人令人惊讶地发现在免疫刺激性寡核苷酸的3’-端或5’-端引入二级结构可以明显影响这些寡核苷酸的免疫刺激活性或稳定性。
本文所引用的已发布专利、专利申请、参考文献都被纳入本文以同等程度作参考，如同每一个都被具体地、个别地标明被纳入以作参考。如果在本文中引用的任何参考文献的任何教导与本说明书有矛盾，为了本发明目的，优先适用后者。
在第一个方面，本发明提供了免疫刺激性核酸。该免疫刺激性核酸包含寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列至少包括一个二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中C是胞苷或2’-脱氧胞苷，G是鸟苷或2’-脱氧鸟苷，C*是2′-脱氧胸苷、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’-双脱氧-5-卤代胞苷、2’-双脱氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2′-脱氧-2′-取代阿糖胞苷、2′-O-取代阿糖胞苷、2′-脱氧-5-羟基胞苷、2′-脱氧-N4-烷基-胞苷、2′-脱氧-4-硫代尿苷，或者其它嘧啶核苷类似物；G*是2′-脱氧-7-脱氮鸟苷、2′-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2′-脱氧-2′取代-阿糖鸟苷、2′-O-取代-阿糖鸟苷、2′-脱氧肌苷，或其它嘌呤核苷类似物，p是核苷之间的连接体，选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，而且其中，在所述寡核苷酸序列的3’-端有二级结构。在一些优选的实施方案中，所述免疫刺激性二核苷酸不是CpG。
在一些实施方案中，免疫刺激性核酸的长度为约2-约50个核苷酸。在一些实施方案中，免疫刺激性核酸的长度为约12-约26个核苷酸。在一些实施方案中，每个寡核苷酸具有约3-约35个核苷残基，优选约4-约30个核苷残基，更优选约4-约20个核苷残基。在一些实施方案中，所述的寡核苷酸具有约5-约18或约5-约14个核苷残基。如在这里应用的，术语“约”意味着确切的数字并不重要。因而在所述的寡核苷酸中核苷残基的数目并不重要，具有1或2个较少的核苷残基的寡核苷酸或者有一个到几个额外核苷残基的寡核苷酸，预期作为前述的每个实施方案的相等物。在一些实施方案中，一个或多个寡核苷酸有11个核苷酸。
在一些实施方案中，免疫刺激性核酸在3’-末端有茎环二级结构。在一些实施方案中，免疫刺激性核酸通过与互补序列氢键结合的方式在3’-端具有二级结构。在一些实施方案中，免疫刺激性核酸选自SEQ ID NOS2，3，4，9，12，13，14，18，19，20，21，24，25，26，27，28，29，30，32，33，34，35，36，37或38。
为了本发明的目的，术语“寡核苷酸”是指由大量的连接的核苷单位组成的多聚核苷。这样的寡核苷酸可以从现有的核酸来源获得，包括基因组核酸或cDNA，但是优选通过合成方法产生。在优选的实施方案中，每个核苷单位包括杂环碱基和呋喃戊糖基(pentofuranosyl)，2’-脱氧呋喃戊糖基(2’-deoxypentfuranosyl)，海藻糖(trehalose)，阿拉伯糖(arabinose)，2’-脱氧-2’-取代阿拉伯糖(2’-deoxy-2’-substituted arabinose)，2’-O-取代阿拉伯糖(2’-O-substituted arabinose)或己糖基团(hexose sugar group)。核苷残基可通过大量已知的核苷之间的连接中的任一种彼此偶联。这样的核苷间连接包括，但不限于磷酸二酯(phosphodiester)，硫代磷酸酯(phosphorothioate)，二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)，烷基膦酸酯(alkylphosphonate)，烷基硫代磷酸酯(alkylphosphonothioate)，磷酸三酯(phosphotriester)，氨基磷酸酯(phosphoramidate)，硅氧烷(siloxane)，碳酸酯(carbonate)，烷氧羰基(carboalkoxy)，乙酰胺化物(acetamidate)，氨基甲酸酯(carbamate)，吗啉代(morpholino)，硼烷(borano)，硫醚(thioether)，桥连氨基磷酸酯(bridgedphosphoramidate)，桥连亚甲基膦酸酯(bridged methylene phosphonate)，桥连硫代磷酸酯(bridged phosphorothioate)和砜(sulfone)核苷间连接。术语“寡核苷酸”也包括具有一个或多个立体特异性的核苷间连接的多聚核苷(例如，(RP)-或(SP)-硫代磷酸酯，烷基膦酸酯或磷酸三酯连接)。如本文应用的，术语“寡核苷酸”和“二核苷酸”明显地旨在包括具有任意上述核苷间连接的多聚核苷和二核苷，而不管该连接是否包含磷酸基团。在一些优选实施方案中，这些核苷间连接可以是磷酸二酯，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯连接，或其组合。
术语“寡核苷酸”也包括含有额外的取代基的多聚核苷，所述的取代基包括，但不限于，蛋白基团，亲脂基团，嵌入剂，二元胺(diamine)，叶酸，胆固醇和金刚烷。术语“寡核苷酸”也包括任何其它含有聚合物的核苷酸碱基，所述的聚合物包括，但不限于，肽核酸(PNA)，具有磷酸基团的肽核酸(PHONA)，封闭的核酸(LNA)，吗啉代-骨架寡核苷酸和具有带烷基连接体或氨基连接体的骨架部分的寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸可以包括天然存在的核苷，经修饰的核苷或其混合物。如本文所应用的，术语“经修饰的核苷”是指包括经修饰的杂环碱基，经修饰的糖基部分，或其组合的核苷。在一些实施方案中，经修饰的核苷是如本文所描述的非-天然的嘧啶或嘌呤核苷。在一些实施方案中，经修饰的核苷是2′-取代核糖核苷，阿拉伯糖核苷或2’-脱氧-2’-取代阿拉伯糖苷。
为了本发明目的，术语“2′-取代核糖核苷”或“2’-取代阿拉伯糖苷”包括核糖核苷或者阿拉伯糖核苷，其中在该戊糖部分的2′位置的羟基被取代而产生2′-取代或2′-O-取代核糖核苷。优选地，这样的取代是以含有1-6个饱和的或不饱和的碳原子的低级烷基，或者以具有6-10个碳原子的芳基取代，其中，所述的烷基或芳基可以是未取代的也可以是取代的，例如以卤基(halo)，羟基，三氟甲基(trifluoromethyl)，氰基(cyano)，硝基(nitro)，酰基(acyl)，酰氧基(acyloxy)，烷氧基(alkoxy)，羧基(carboxyl)，烷氧羰基(carboalkoxy)或氨基取代。2′-O-取代核糖核苷或2′-O-取代-阿拉伯糖苷的实例包括，但不限于2′-O-甲基核糖核苷，2′-O-甲基阿拉伯糖苷，和2′-O-甲氧基乙氧基核糖核苷(2′-O-methoxyethoxyribonucleoside)或2′-O-甲氧基乙氧基阿拉伯糖苷(2’-O-methoxyethoxyarabinoside)。
术语“2′-取代核糖核苷”或“2′-取代阿拉伯糖苷”也包括其中2′-羟基被含有1-6个饱和或不饱和碳原子的低级烷基所取代或被氨基或卤素基团取代的核糖核苷或阿拉伯糖苷。所述的2′-取代核糖核苷或2′-取代阿拉伯糖苷的实例包括，但不限于，2’-氨基，2’-氟(2’-fluoro)，2’-烯丙基(2’-allyl)和2’-炔丙基(2’-propargyl)核糖核苷或阿拉伯糖苷。
术语“寡核苷酸”包括杂合(hybrid)寡核苷酸和嵌合(chimeric)寡核苷酸。“嵌合寡核苷酸”是具有一个以上类型的核苷间连接的寡核苷酸。所述的嵌合寡核苷酸的一个优选实例是包含硫代磷酸酯，磷酸二酯或二硫代磷酸酯区域和非-离子键例如烷基膦酸酯或烷基硫代膦酸酯连接的嵌合寡核苷酸(参见，例如Pederson等.U.S.专利No.5,635,377和5,366,878)。
“杂合寡核苷酸”是具有一个以上类型核苷的寡核苷酸。所述的杂合寡核苷酸的一个优选实例是包含核糖核苷酸或2′取代核糖核苷酸区域，和脱氧核糖核苷酸区域(参见，例如Metelev和Agrawal，美国专利No.5,652,355，6,346,614和6,143,881)。
如本文应用的，所述的术语“二级结构”是指分子内和分子间的氢键结合。分子内氢键结合导致茎-环结构的形成，分子间氢键结合导致双链体核酸分子的形成。
如本文应用的，所述的术语“大约”意味着精确的数字并不重要。因此，寡核苷酸中的核苷残基数不重要，为了本发明之目的，具有一个或两个较少的核苷残基，或一个到几个附加的核苷残基的寡核苷酸，预期作为前述的每个实施方案的相等物。
如本文应用的，所述的术语“互补”是指具有与核酸杂交的能力。所述的杂交通常是在互补链之间经氢键结合的结果，优选形成Watson-Crick或Hoogsteen碱基对，尽管氢键的其它模式以及碱基堆积也能导致杂交。
第二方面，本发明提供了具有降低的免疫刺激活性的核酸。在该方面所述的核酸包含寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列至少含有一个二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中C是胞苷或2’-脱氧胞苷，G是鸟苷或2’-脱氧鸟苷，C*是2′-脱氧胸苷、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’-双脱氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2′-脱氧-2′-取代阿糖胞苷、2′-O-取代阿糖胞苷、2′-脱氧-5-羟基胞苷、2′-脱氧-N4-烷基-胞苷、2′-脱氧-4-硫代尿苷，或者其它嘧啶核苷类似物，G*是2′-脱氧-7-脱氮鸟苷、2′-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2′-脱氧-2′取代-阿糖鸟苷、2′-O-取代-阿糖鸟苷、2′-脱氧肌苷，或其它嘌呤核苷类似物，p是核苷之间的连接体，选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。其中寡核苷酸序列在该寡核苷酸序列的5’-端具有二级结构。在一些优选实施方案中，所述的免疫刺激性二核苷酸不是CpG。
在一些实施方案中，免疫刺激性核酸是长度为约2-约50个核苷酸的寡核苷酸序列。在一些实施方案中，免疫刺激性核酸是长度为约12-约26个核苷酸的寡核苷酸序列。在一些实施方案中，每个寡核苷酸具有约3-约35个核苷残基，优选约4-约30个核苷残基，更优选约4-约20个核苷残基。在一些实施方案中，寡核苷酸具有约5-约18，或约5-约14个核苷残基。如本文应用的，术语“约”意味着精确的数字并不重要。因此，寡核苷酸中核苷残基数目不重要，并且具有一个或两个更少的核苷残基，或一个到几个附加核苷残基的寡核苷酸，预期作为前述的每个实施方案的相等物。在一些实施方案中，1个或多个寡核苷酸有11个核苷酸。
在一些实施方案中，具有降低的免疫刺激活性的核酸形成5’-端茎环二级结构。在一些实施方案中，所述具有降低的免疫刺激活性的核酸在5’-端通过与互补序列氢键结合具有二级结构。在一些实施方案中，具有降低的免疫刺激活性的核酸选自SEQ ID NOS5，6，7，10，15，16和17。
第三方面，本发明提供了包含至少2个寡核苷酸的免疫刺激性核酸，其中该免疫刺激性核酸具有二级结构。在该方面，该免疫刺激性核酸包含一个如公式(I)详细描述的结构。
结构域A-结构域B-结构域C (I)结构域的长度可为约2-约12个核苷酸。结构域A可以是5’-3’或3’-5’或2’-5’DNA、RNA、RNA-DNA、DNA-RNA，它们具有或不具有回文区域或自我互补区域，该区域包含或不包含至少一个二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中C是胞苷或2’-脱氧胞苷，G是鸟苷或2’脱氧鸟苷，C*是2′-脱氧胸苷、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’-双脱氧-5-卤代胞苷、2’-双脱氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2′-脱氧-2′-取代阿糖胞苷、2′-O-取代阿糖胞苷、2′-脱氧-5-羟基胞苷、2′-脱氧-N4-烷基-胞苷、2′-脱氧-4-硫代尿苷，或者其它嘧啶核苷类似物；G*-是2′-脱氧-7-脱氮鸟苷、2′-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2′-脱氧-2′-取代-阿糖鸟苷、2′-O-取代-阿糖鸟苷、2′-脱氧肌苷或其它嘌呤核苷类似物。p是核苷之间的连接体，其选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在一些优选实施方案中，所述的免疫刺激性二核苷酸不是CpG。
在一些实施方案中，结构域A将具有一个以上二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*。
结构域B，即下文图示的“X”，是连接结构域A和结构域C的连接体，其可以是3’-5’连接、2’-5’连接、3’-3’连接，可以是磷酸基团、核苷，或者非核苷连接体，所述的连接体可以是脂肪族的、芳香族的、芳基的、环状的，手性的、非手性的，可以是肽，碳水化合物、脂类、脂肪酸、单-、三-或六聚乙二醇，或者杂环部分。
结构域C可以是5’-3’或3’-5’、2’-5’DNA、RNA、RNA-DNA、DNA-RNAPoly I-Poly C，它们具有或是不具有一个回文序列或自我互补序列，该序列可具有或不具有二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中C是胞苷或2’-脱氧胞苷，G是鸟苷或是2’-脱氧鸟苷，C*是2′-脱氧胸苷，1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤，2’-双脱氧-5-卤代胞苷，2’-双脱氧-5-卤代胞苷，阿糖胞苷，2′-脱氧-2′-取代阿糖胞苷，2′-O-取代阿糖胞苷，2′-脱氧-5-羟基胞苷，2′-脱氧-N4-烷基-胞苷，2′-脱氧-4-硫代尿苷，其它嘧啶核苷类似物，G*是2′-脱氧-7-脱氮鸟苷，2′-脱氧-6-硫代鸟苷，阿糖鸟苷，2′-脱氧-2′-取代-阿糖鸟苷，2′-O-取代-阿糖鸟苷，2′-脱氧肌苷，或其它嘌呤核苷类似物，p是核苷之间的连接体，选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在一些优选实施方案中，所述的免疫刺激性二核苷酸不是CpG。在一些优选的实施方案中，结构域B优选是连接结构域A和结构域C的寡核苷酸的非-核苷连接体，其被称为“免疫子”。在一些优选实施方案中，结构域C不具有二核苷酸CpG，C*pG，C*pG*或CpG*。
在一些实施方案中，公式(I)中含有的寡核苷酸的长度是约2-约50个核苷酸。在一些实施方案中，公式(I)中含有的寡核苷酸的长度是约12-约26个核苷酸。在一些实施方案中，每个寡核苷酸具有约3-约35个核苷残基，优选约4-约30个核苷残基，更优选约4-约20个核苷残基。在一些实施方案中，寡核苷酸具有约5-约18，或约5-约14个核苷残基。本文所述的术语“约”意味着精确的数字不是重要的。因此，寡核苷酸中核苷残基数目不是重要的，并且具有一个或两个更少的核苷残基，或具有一个到几个附加核苷残基的寡核苷酸，预期作为前述的每个实施方案的相等物。在一些实施方案中，一个或多个寡核苷酸有11个核苷酸。
通过非限制性实施例的方式，在该方面的一些实施方案中，免疫刺激性核酸会有如公式(II)详细描述的结构。
该领域的技术人员识别出，在该分子的3’端有分子内茎环形式的二级结构元件。
通过非限制性实施例的方式，在该方面的一些实施方案中，免疫刺激性核酸会有如公式(III)详细描述的结构。
此处由公式(III)描述的结构被称为“末端二聚体”，因为两个分子的3’端由于两3’端序列互补允许分子间氢键结合而封闭。另外，结构域A和A’区可以相同也可以不相同，结构域B和B’区可以相同也可以不相同，结构域C和C’区可以相同也可以不相同。
通过非限制性实施例的方式，在该方面的一些实施方案中，免疫刺激性核酸会有如公式(IV)详细描述的结构。
该领域的技术人员会识别出，在所描述的分子的3’端有二级结构，由于其3’端的互补序列通过氢键结合在这个区域。在一些实施方案中，分子例如配体结合在3’-端以利于细胞的摄取或改善分子的稳定性。
本发明的一些核酸的非限制性的实例列于表1中。
表1
*大写-PS；小写-PO；粗体-2’-O-甲基核糖核苷酸(在26和27中)；G-2’-脱氧-7-脱氮-G(在28中)；G-araG(在29中)；X-C3-连接体(在37和38中)。
可选地，本发明的核酸分子可以是通过非核苷酸连接体连接的两个免疫子。表2中列出了这些分子的非限制的代表性实例。
表2
*大写-PS；小写-PO；X-C3-连接体，Y-四乙二醇连接体(tetraethyleneglycol)；Z-六乙二醇连接体(hexaethyleneglycol)；粗体-2’-O-甲基核糖核苷酸(methylribonucleotides)(在44和57中)；G-2’-脱氧-7-脱氮-G(在45中)。
在一些实施方案中，本发明的免疫刺激性核酸具有选自SEQ ID NOS1-38的序列。在一些实施方案中，本发明的免疫刺激性核酸具有选自SEQ IDNOS39-68的序列。
在本发明的一些实施方案中，至少本发明的一个免疫刺激性寡核苷酸包含式5′-Pyr-Pur-3′的免疫刺激性二核苷酸，其中Pyr是天然的嘧啶核苷或其类似物。Pur是天然嘌呤核苷或其类似物。如本文应用的，术语“嘧啶核苷”是指一种核苷，其中所述核苷的碱基组成是嘧啶碱基。类似地，术语“嘌呤核苷”是指一种核苷，其中所述核苷的碱基组成是嘌呤碱基。为了本发明目的，“合成的”嘧啶或嘌呤核苷包括非天然存在的嘧啶或嘌呤碱基，非天然存在的糖部分，或其组合。
在本发明的方法中应用的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子中优选的嘧啶核苷，具有结构(I) 其中D是氢键供体；D′选自氢、氢键供体、氢键受体、亲水基团、憎水基团、吸电子基团或给电子基团。
A是氢键受体或亲水基团；A’选自氢键受体、亲水基团、憎水基团、吸电子基团和给电子基团；X是碳或氮；和S′是戊糖环或己糖环或非-天然存在的糖。
优选糖环是用磷酸部分、修饰的磷酸部分或其它适于将所述的嘧啶核苷与其它核苷或核苷类似物连接的连接体部分衍生的。
优选的氢键供体包括，但不限于，-NH-，-NH2，-SH和-OH。优选的氢键受体包括，但不限于，C＝O，C＝S，和芳香杂环中的环氮原子，例如，胞嘧啶的N3。
在一些实施方案中，(I)中的碱基部分是非天然存在的嘧啶碱基。优选非天然存在的嘧啶碱基的实例包括，但不限于，5-羟基胞嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶，N4-烷基胞嘧啶(N4-alky cytosine)，优选N4-乙基胞嘧啶(N4-ethyl cytosine)和4-硫尿嘧啶(4-thiouracil)。在一些实施方案中，(I)中的糖部分S′是非天然存在的糖部分。为了本发明之目的，“天然存在的糖部分”是天然作为核酸的一部分存在的糖基，例如，核糖和2′-脱氧核糖，而且“非天然存在的糖部分”是任何不天然作为核酸的一部分存在的糖基，但其可以用作寡核苷酸的骨架，例如，己糖。阿拉伯糖或阿拉伯糖衍生物是优选糖部分的实例。
本发明的方法中应用的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子中优选的嘌呤核苷类似物具有结构(II) 其中D是氢键供体；D’选自氢、氢键供体和亲水基团；A是氢键受体或亲水基团；X是碳或氮；每个L独立地选自C，O，N或S；和S′是戊糖环或己糖环，或非-天然存在的糖。
优选地，糖环是用磷酸部分、修饰的磷酸部分或其它适于将所述的嘧啶核苷与其它核苷或核苷类似物连接的连接体部分衍生的。
优选的氢键供体包括，但不限于，-NH-，-NH2，-SH和-OH。优选的氢键受体包括，但不限于，C＝O，C＝S，和芳香杂环中的环氮原子，例如，鸟嘌呤的N1。
在一些实施方案中，(VI)中的碱基部分是非天然存在的嘌呤碱基。优选非天然存在的嘌呤碱基的实例包括，但不限于，6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine)和7-脱氮鸟嘌呤(7-deazaguanine)，在一些实施方案中，(II)中的糖部分S′是天然存在的糖部分，如前面的结构(I)所述。
第四方面，本发明提供了降低或去除寡核苷酸的免疫刺激活性的方法。该方法包括在含CpG的寡核苷酸的5’-端引入包含二级结构的核酸序列。在该方面的一些实施方案中，二级结构是茎环结构。在该方面一些实施方案中，该二级结构是通过在所述寡核苷酸序列的5’-端氢键结合互补序列而获得的。
第五方面，本发明提供了提高免疫刺激性寡核苷酸稳定性的方法。该方法包括在免疫刺激性寡核苷酸的3’-端引入含二级结构的核酸序列。在该方面的一些实施方案中，该二级结构是茎环结构。在该方面的一些实施方案中，该二级结构是通过在所述寡核苷酸序列的3’-端氢键结合互补序列而获得的。
第六方面，本发明提供了调节免疫刺激性寡核苷酸的免疫刺激活性的方法。该方法包括在免疫刺激性寡核苷酸的3’-端或5’-端引入含二级结构的核酸序列。在该方面的一些实施方案中，该二级结构是茎环结构。在该方面的一些实施方案中，该二级结构是通过在所述寡核苷酸序列的3’-端或5’-端氢键结合互补序列而获得的。
如本文应用的，术语“调制”或“调节”意思是指相对于亲代免疫刺激性核酸，提高或降低免疫刺激性核酸的免疫刺激活性。
第七方面，本发明提供了药物组合物。这些组合物包括在本发明第一、二、三方面单独或共同公开的任何一种组合物，以及可药用的载体。
如本文应用的，术语“生理可接受的”意思是指一种物质，其不干扰本发明第一、二、三方面的组合物的有效性，并且与生物学系统如细胞、细胞培养物、组织或生物体相适合。优选地，生物学系统是活的生物体，例如脊椎动物。
如本文应用的，术语“载体”包含任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂、脂类，或者本领域中公知用于药物制剂的其它物质。可以理解，对于一个具体的应用来说，这些载体、赋形剂或稀释剂的特性依赖于给药途径。制备含有这些物质的可药用的制剂在，例如，Remington’sPharmaceutical Sciences，18th Edition，ed.A.Gennaro，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990，ISBN0-912734-04-3中描述。
本发明的药物组合物也可包含癌疫苗，包含选自EFG、抗个体基因型的癌疫苗、Gp75抗原、GMK黑色素瘤疫苗、MGV神经节苷脂结合疫苗、Her2/new、Ovarex、M-Vax、O-Vax、L-Vax、STn-KHL theratope、BLP25(MUC-1)、脂质体个体基因型疫苗、黑素瘤疫苗(Melacine)，肽抗原疫苗、毒素/抗原疫苗、MVA-vased疫苗、PACIS、BCG疫苗、TA-HPV、TA-CIN、DISC-病毒和ImmunCyst/TheraCys的癌疫苗。
在本发明不同的实施方案中，本发明第一、二、三、四、五、或六方面的组合物可以与抗原共价连接或与抗原以另外的方式可操作地连接。如本文应用的，术语“可操作地连接”是指能保持本发明第一、二、或三方面的组合物和抗原的活性的任何连接。所述可操作的连接的非限制性实例包括作为同一脂质体的一部分或者其它所述的运载工具(delivery vehicle)或试剂。在本发明第一、二、或三方面组合物与抗原共价连接的一些实施方案中，所述的共价连接优选在本发明第一、二、三方面组合物上免疫刺激性寡核苷酸的可接近的5′端之外的任何位置。例如，抗原可以附着在核苷间连接上，或附着在非核苷酸的连接体。可选地，抗原本身可为非核苷酸的连接体。
在本发明的各种实施方案中，本发明的第一、二、三、四、五、或六方面的组合物可以包括具有反义活性的寡核苷酸。如本文应用的，“反义活性”是指当把寡核苷酸导入细胞或动物时，会引起互补的基因表达的减少。
在本发明的各种实施方案中，本发明的第一、二、三、四、五、或六方面的组合物可以包括适体(aptamer)的寡核苷酸序列。适体是依据它们结合其它分子的能力选自于随机池(random pool)中的核酸分子。选择的适体结合核酸、蛋白、小分子有机化合物，以及甚至整个生物体。这些新的分子在医学和技术中有许多潜在的用途(参见，例如，Burgstaller P.，等Curr Opin DrugDiscov Devel. 5690-700(2002))。
本发明的药物组合物可通过任何合适的途径给药，包括，但不限于，胃肠外、口服、舌下、经皮、局部、鼻内、喷雾、眼内、气管内、直肠内、阴道、通过基因枪、皮肤贴片或滴眼剂或漱口水形式。这些药物组合物可以应用已知的方法以有效获得理想疗效的剂量和时间输送，例如，治疗癌症，治疗感染和治疗自身免疫性疾病。当系统地给药时，所述药物组合物优选以足够剂量给药以使本发明的第一、第二和/或第三方面的组合物的血药浓度达到约0.0001微摩尔到大约10微摩尔。对于局部给药，远远低于此的浓度是有效的，而高得多的浓度是可以耐受的。优选地，免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子的总剂量范围为每位病人每天约0.0001毫克到每公斤体重每天约200毫克。需要同时或顺序地将有效量的本发明的一种或多种治疗的组合物给予个人作为单个治疗阶段。
此外，当免疫刺激性寡核苷酸作为免疫子产生时，下列方案可用于合成。本发明的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子可方便地应用自动化合成仪和亚磷酰胺方法合成，如图9和图11示意地描绘。在一些实施方案中，所述的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子通过线性合成方法合成(参见图9)。该合成的代表性连接体在图10中列出。如本文应用的，术语“线性合成”是指由免疫子的一个末端开始呈线性进行到另一末端的合成。线性合成允许将相同的或不相同的(就长度、碱基组成和/或掺入的化学修饰而言)单体单元并入免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子。
合成免疫子的可选择的模式是“平行合成”，其中合成从中心的连接体部分向外进行(参见图11)。该合成方法代表性的连接体在图12中列出。如美国专利No.5,912,332所述，附着于固体支持物的连接体可以用于平行合成。可选地，可应用通用的固体支持物，如有磷酸盐附着的可控孔度玻璃支持物。
免疫子的平行合成比线性合成具有几个优势(1)平行合成允许掺入相同的单体单位；(2)与线性合成不同，两个(或所有)单体单位同时合成，因而合成的步骤数和合成所需要的时间与单体单位相同；并且(3)减少合成步骤会提高最终免疫子产物的纯度和收率。
通过线性合成或平行合成方案，在合成的最后阶段，本发明的免疫刺激性寡核苷酸或免疫子可方便地用浓缩的氨水脱保护，或如果掺入修饰的核苷如亚磷酰胺供应商的推荐。产物免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子优选用反相HPLC纯化、脱三苯甲基、脱盐和透析。
CpG DNA 18-21的刺激性区域在5’-末端包含人特异性的‘GTCGTT’基序。在结构性结构域中，形成7、11、15或19碱基对(bp)发夹茎-环结构的互补序列被掺入以与刺激性结构域的3’-端相邻(表3)。设计自我稳定的CpGDNA以使刺激性结构域不包含任何结构基序(碱基对)，结构性结构域不存在CpG刺激性基序。CpG DNA中的刺激性基序和二级结构是pDC激活所需要的。CpG DNA诱导培养物中的人B细胞的强的浓度依赖性增殖。但是，B-细胞增殖不依赖发夹双链体的长度。自我稳定的CpG DNA激活pDC和B细胞的能力可允许开发治疗试剂用于抗癌、哮喘、过敏和感染性疾病，并且作为比刺激B细胞或pDC的那些更有效的佐剂。
序列22具有刺激性区域，但是不包含在其3’-端(结构性结构域)形成发夹结构所必需的互补序列。正相反，CpG DNA 30形成发夹结构(结构性结构域)，但没有刺激性基序(表3)。序列69，是序列19的类似物，在发夹序列的一条链中含有2’-O-甲基-核糖核苷酸。
通过热溶解(表3)和EMSA研究证实通过CpG DNA形成稳定的发夹结构。如预期的，与不同长度寡核苷酸的标记物相比，CpG DNA 18-21在非变性聚丙烯酰胺凝胶上显示出具有必需的移动性(mobility)条带和结构得以确认的发夹结构的形成(数据未显示)。
人pDCs表达TLR9，且被认为是CpG DNA诱导的IFN-α的主要来源。CpG DNA 18-21诱导IFN-α在人pDC培养物中产生，如图13所示。IFN-α分泌的水平依赖发夹双链体结构的长度。形成19-bp双链体的CpG DNA 21诱导最高水平的IFN-α(图13)。尽管所述的应答随供体不同而变化，CpGDNA中的趋势是一致的(图13)。CpG DNA 70，其为含聚(dG)序列的回文CpG寡核苷酸，并已知刺激人pDC，被用作阳性对照。
所有的四种CpG DNA诱导人B细胞在培养物中强的浓度依赖性增殖(图14)。但是，B-细胞增殖不依赖于所述发夹双链体的长度(图13)。
研究了通过CpG DNAs 18，19，22和30激活人pDC以诱导IFN-α分泌如前述实验所示，序列18和19都诱导IFN-α的产生(图15)。具有刺激性基序，但无二级结构的序列22和无刺激性基序、但有二级结构的序列30不能在pDC培养物中诱导IFN-α产生(图15)。这些结果说明CpG DNA中的刺激性基序和二级结构对于pDC激活是必需的。
列于图4B中的B-细胞增殖的数据显示，形成二级结构的CpG DNA 18和19，以及不能形成二级结构的22，诱导强的B细胞增殖。没有刺激性基序的序列30诱导最小的增殖，这说明CpG基序对活性是必需的，而二级结构则不是。
TLR9特异地识别CpG DNA而不是RNA。但是2’-O-烷基核糖核苷酸远端位点特异性掺入在侧翼序列中的CpG二核苷酸是容许的。我们合成了CpG DNA 19的类似物，其中靠近含有环区的3’-端的茎序列，被2’-O-甲基核糖核苷酸所取代。CpG DNA 69和19诱导相似水平的IFN-α在人pDC培养物中的分泌(图16)和在人B-细胞培养物中的增殖(图16)。这些结果显示通过这些取代而产生的2’-O-甲基核糖核苷酸取代或构象变化不干扰pDC或B-细胞活化。
Toll-like受体9(TLR9)识别未甲基化的CpG DNA并激活几个信号途径，包括压力激酶(stress kinase)和NF-κB途径，导致在体外和体内分泌大量的趋化因子和细胞因子包括IFN-α/β、IFN-γ、IL-12，IL-6和TNF-α。但是还没有建立CpG DNA和它的受体TLR9之间直接的相互作用。的替换受体或共受体(co-receptor)在CpG DNA免疫刺激中的可能的作用已经被提出。具有不同的骨架、序列和结构的CpG DNA以细胞特异的但是以依赖TLR9的方式激活免疫系统。
二级结构在CpG DNA 3’-端的最优布置可以诱导不同的细胞因子谱(profile)。具有人特异性基序的CpG DNA结构在人pDC培养物中诱导高水平的IFN-α，这说明二级结构对于pDC激活可为必需的(数据未发表)。
本发明的CpG DNAs被设计成包括2个不同的结构域，在5’端具有CpG-基序的刺激性结构域，和在3’端含有允许形成发夹双链体的序列的结构性结构域。这些CpG DNAs形成分子内二级结构的能力提供了额外的抗普遍存在的3’-核酸酶的稳定性，因此被命名为自我稳定的CpG DNA。自我稳定的CpG DNA与早期报道的回文序列CpG DNA不同，回文序列CpGDNA形成分子间二级结构，而在结构性结构域不具有CpG基序。
包含CpG二核苷酸的回文序列激活免疫细胞以产生IFN-α/β和IFN-γ。本文描述的自我稳定的CpG DNA允许我们分解被人B细胞和pDC都识别的CpG DNA的刺激性和结构性特点。CpG DNA 18-21以发夹双链体长度依赖性的方式激活pDC。无结构性结构域的控制DNA分子22和无刺激性区域的30都不能诱导IFN-α分泌，这说明刺激性结构域和结构性结构域对于pDC激活都是必需的。与其相反，B-细胞激活只需要刺激性结构域，而不需要结构性结构域。CpG DNA 20和21的低活性显示CpG DNA中的二级结构可干扰B-细胞激活。事实上，没有结构性结构域，且核苷酸长度与CpG DNA18相同的CpG DNA 30激活B细胞的水平和19相当，这说明单链DNA优选用于B-细胞激活。用30观察到的B细胞的较低激活可能与非特异性活性相关。
应用CpG DNA 69的本结果显示DNA/RNA杂合异源双链体不阻碍pDC或B细胞激活。这些结果显示在结构性结构域区域由2’-O-甲基核糖核苷酸取代所造成的B到A的构像变化对于免疫刺激影响很小或无影响。因此在这些位置允许取代。
综上所述，在这些研究中，为了人免疫细胞的TLR9-阳性子集pDC和B细胞的最佳激活，我们提出合理组合CpG DNA中的刺激性结构域和结构性结构域。此处显示的研究允许我们确定激活pDC和B细胞所必需的CpGDNA的特异性特征。CpG刺激性基序对于激活人B细胞是必需的，而刺激性基序和附加的结构性结构域对于人pDC激活都是必需的。不清楚为什么同样的TLR9受体对于在两类不同的细胞群中的刺激需要其配体的不同的结构特征。这些事实可能说明涉及到pDC和B细胞中TLR9信号传导中的不同的适配分子。自我稳定的CpG DNA激活pDC和B细胞的能力允许开发治疗剂用于抗癌、哮喘、过敏和感染性疾病，并作为比刺激B细胞或pDC的那些更有效的佐剂。
表3 CpG DNA的示意图a、序列、二级结构和Tm
a新型的CpGDNA设计的示意图(方框)显示重要的刺激性结构域和结构性结构域。刺激性结构域而不是结构性结构域含有适当CpG基序b除去70之外，所有的序列均为硫代磷酸酯修饰的。69中以斜体显示的核苷酸表示2’-O-甲基核糖核苷酸，70中加下划线的核苷酸表示磷酸二酯骨架；cND-未检测到。
以下的实施例旨在进一步阐明本发明一些优选地实施方案，但无意限制本发明的范围。
实施例实施例1寡核苷酸的合成、纯化和热溶解谱在PerSeptive Biosystem的8909 Expedite DNA合成仪(PerSeptiveBiosystem，Boston，MA)上用β-氰乙基亚磷酰胺以1-2微摩尔的规模合成CpG寡核苷酸。dA，dG，dC和T的亚磷酰胺获自PE Biosystems(Foster City，CA)。如Iyer R.P.，等(J.Am.Chem.Soc.1121253-1254(1990))所述，用碘氧化试剂获得所述的硫代磷酸酯骨架修饰。所有的寡核苷酸用标准程序脱保护，用HPLC纯化，通过以USP标准的无菌水透析用于冲洗。将所述寡核苷酸冻干并在蒸馏水中重新溶解，通过260nm UV吸收值测定浓度。以CGE和MALDI-TOF质谱(Applied Biosystem’s Voyager-DETM STRBiospectrometryTM Workstation)对所有寡核苷酸的纯度和分子量分别进行表征。全长寡核苷酸的纯度范围是90-96％，其余则为通过CGE和/或变性PAGE确定的短1-2个核苷酸(n-1和n-2)。所有寡核苷酸包含经Limulus实验(Bio-Whittaker，现在称为Cambrex Bio Science Walkersville，Inc.，Walkersville，MD)确定的低于0.1EU/mL的内毒素。
热溶解研究在1mL 10mM磷酸氢二钠溶液中进行，其pH 7.2±0.2，含150mM NaCl和2mM MgCl2。将该溶液加热到95℃10分钟，且允许在4℃过夜贮存之前缓慢达到室温。寡核苷酸链的终浓度为2.0μM。UV热溶解测定在连接于peltier温控装置和个人计算机的Perkin-Elmer Lambda 20分光光度计上，用1cm通道长度石英比色杯以0.5℃/分钟的加热速度的在260nm进行。将一半解离的温度视为熔解温度(Tm)，并由第一次衍生图获得。每个Tm值是二或三个独立实验的平均值，而且该值在±1.0℃之内。
17-元(17-mer)的包含‘GACGTT’六聚体基序的硫代磷酸酯寡核苷酸(1)被用做阳性对照(表1)。寡核苷酸2-7包含与1的部分互补的5-、11-或17个核苷酸的附加序列。延伸在3’-端(2-4)或5’-端(5-7)连接，并包含如Hirao，I.，等(Nucleic Acids Res.22576-582(1994))所述的允许形成稳定茎-环的GAA三聚体。通过UV热溶解试验确定2-7的发夹结构的形成。在含150mM NaCl和2mM MgCl2，pH7.2的10mM磷酸钠中，40-66℃的Tm值显示，在暴露于10μg/ml的寡核苷酸18、19、20和21之后在浆细胞样树突状细胞中α干扰素(IFN-α)的实验条件下，2-7形成了稳定的二级结构(表1)。
实施例2细胞培养条件和试剂来自4-8周大的BALB/c、C57BL/6或C3H/HeJ小鼠的脾细胞在如Zhao，Q.等(Biochem Pharmacol.51173-182(1996))和Branda，R.F.，等(Biochem.Pharmacol.452037-2043(1993))所述的RPMI完全培养基中培养。小鼠J774巨噬细胞(American Type Culture Collection，Manassas，VA)在加入10％(v/v)胎牛血清和抗生素(100IU/mL青霉素G/链霉素)的Dulbecco’s改良Eagles培养基中培养。所有其它培养试剂购自Mediatech(Gaithersburg，MD)。
实施例3脾细胞增殖实验通常，小鼠(Balb-C)脾细胞与浓度为0.1，1.0和10.0μg/ml的CpG寡核苷酸一起培养48小时，并用3H-尿嘧啶核苷掺入来测定细胞增殖，如Zhao，Q.，等(Biochem Pharmacol.51173-182(1996))所述。
起初，检测寡核苷酸1，2和5在培养物中诱导BALB/c小鼠脾细胞增殖的能力。寡核苷酸1和2诱导剂量依赖性的脾细胞增殖。没有茎-环结构的亲代寡核苷酸1在1.0μg/mL的浓度显示增殖指数为6.0±0.3(图1A)。在其3’-端形成茎-环结构的寡核苷酸2在同样浓度下得到增殖指数为9.0±2.5。然而，在其5’-端形成茎-环结构的寡核苷酸5在同样浓度下显示出较低的增殖指数1.5±0.3，这与PBS对照近似(图1A)。
实施例4细胞因子诱导实验小鼠脾细胞或J774细胞分别以5×106或1×106个细胞/mL铺入24孔板中。将溶解在TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA)的CpG寡核苷酸加入细胞培养物中分别至0.03，0.1，0.3，1.0，3.0或10.0μg/mL的终浓度。然后将细胞在37℃温育24小时，收集上清进行ELISA实验。每个CpG寡核苷酸进行2到3次实验，并且每个浓度重复3次。IL-12和IL-6的分泌通过夹心ELISA进行测定，如Bhagat L.，等(Biochem.Biophys.Res.Commun.300853-861(2003))所述。所需要的试剂，包括细胞因子抗体和标准物购自BD Biosciences Pharmingen(San Diego，CA)。
CpG寡核苷酸诱导大量的细胞因子，包括IL-12和IL-6。在BALB/c小鼠脾细胞培养物中，测试化合物1和2通过浓度-依赖机制诱导IL-12和IL-6。亲代寡核苷酸1在3.0μg/mL的浓度，诱导1514±113pg/mL的IL-12和7681±839pg/mL的IL-6(图2)。包含3’-发夹的寡核苷酸2诱导稍多的IL-12(1771±286pg/mL)和较少的IL-6(2582±300pg/mL)。但是具有5’-发夹的寡核苷酸5不能诱导细胞因子分泌。这些结果显示5’-端而不是3’-端的稳定发夹环封闭了免疫刺激活性。
CpG DNA 3和4具有延伸至GACGTT基序或者一直到达5’-端的3’-发夹茎。结果，它们含有2个CpG基序，上端链中含有GACGTT，在底部是它的互补序列AACGTC(表1)。寡核苷酸6和7具有近似的长5’-发夹。尽管具有2个CpG基序，与寡核苷酸1相比，CpG DNA 3和4诱导较低水平的IL-12，诱导最少的或不诱导IL-6(图2)。具有5’-发夹的寡核苷酸6和7在同样的实验条件下都不能诱导细胞因子分泌。寡核苷酸4诱导最少的细胞因子显示茎结构延伸至5’-端是有害的，并且可能干扰识别和后续的免疫刺激。这些结果说明延伸至5’-端的双链体茎结构干扰免疫刺激。
由于在寡核苷酸4的5’-端的碱基-配对抑制了免疫刺激，用CpG DNA8-10来研究在两个末端的双链体的形成。寡核苷酸8包含18个核苷酸，和与寡核苷酸1一样的GACGTT基序。寡核苷酸9和10中自我互补的3’-或5’-端延伸作为粘性末端以形成8个碱基对的二聚体(表1)。这些双链体含有磷酸二酯键以减少对于免疫刺激的任何长度-依赖性的硫代磷酸酯效应。寡核苷酸9在3’-端二聚化并且显示与亲代寡核苷酸8相似的IL-12和IL-6诱导(图3)。然而，形成5’-双链体的寡核苷酸10诱导最少的IL-12和IL-6(图3)。因此，形成5’-双链体的特性与免疫刺激的损失高度相关。这些结果说明在5’-而不是在3’-端的双链体干扰免疫刺激。
也检测了寡核苷酸1-7在J774细胞培养物诱导细胞因子分泌的能力。在寡核苷酸浓度为10μg/mL时获得的IL-12和IL-6数据补充了来自脾细胞培养物试验中得到的结果(图5)。这些结果进一步证实了受体从其5’-端阅读CpG DNA序列，可接近的5’-端对于CpG DNA活性是必需的。在CpG寡核苷酸中存在延伸至5’-端的二级结构可干扰受体阅读，并由此干扰免疫刺激活性。
也研究了本发明的寡核苷酸在浆细胞样树突状细胞中诱导α干扰素(INF-α)产生的能力。关于分离和培养这些细胞参考Krug，A.，等(Eur.J.Immunol，312154-2163(2001)。结果显示于图6，7和8。这些数据说明具有3’发夹结构的本发明的核酸分子刺激α干扰素的产生，而5’-端发夹结构则抑制免疫刺激作用，所述的免疫刺激作用即这些分子产生α干扰素。
实施例5小鼠脾肿大实验雌性BALB/c小鼠(4-6周，19-21gm)被分为3组。将CpG寡核苷酸溶解在无菌的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，以5mg/kg的剂量皮下给药(SC)于小鼠。如Zhao，Q等(Biochem Pharmacol.51173-182(1996))和Branda，R.F.，等(Biochem.Pharmacol.452037-2043(1993))所述，48小时后处死小鼠，收获其脾脏并称重。
将寡核苷酸1，2和5以5mg/kg的剂量给药于BALB/c小鼠，以确定它们是否在体内诱导脾脏增大。与注射PBS的对照组的小鼠相比，对寡核苷酸处理应答而致的脾脏重量的增加被认为是CpG寡核苷酸免疫刺激活性的结果(Zhao，Q.，等Biochem Pharmacol.51173-182(1996)；Branda，R.F.，等Biochem.Pharmacol.452037-2043(1993))。体内的研究结果列于图1B。没有茎-环结构的寡核苷酸1和在5’-端具有茎-环形成序列的寡核苷酸5，与接受PBS的对照组相比，分别使脾脏增重大约29％和15％。相比之下，在3’-端具有茎-环结构的寡核苷酸2与对照组相比引起大约48％的脾脏增重。
实施例6NF-κB途径的激活已经显示Toll-like受体9(TLR9)识别细菌、质粒和合成DNA中未甲基化的CpG-二核苷酸(Hemmi H.，等Nature 408740-745(2000))以及激活压力激酶(stress kinase)(Yi A.K.，等J.Immunol.1614493-4497(1998))和NF-κB途径(Stacey K.J.，等J.Immunol.1572116-2122(1996))。在用CpG DNA处理的J774细胞中进行NF-κB激活并通过EMSA分析，如Yu D.，等(Biochem.Biophys.Res.Commun.29783-90(2002))和Bhagat L.，等(Biochem.Biophys.Res.Commun.300853-861(2003))所述。
应用EMSA在小鼠巨噬细胞核提取物中检测寡核苷酸1-7在J774中激活NK-κB途径。图4显示出获得的结果。如复合物的存在所显示，亲代寡核苷酸1和8都激活NF-κB。在3’-端具有环的寡核苷酸2-4如适当的复合物的存在所显示，也激活NF-κB。相比之下，具有5’-端环的寡核苷酸5-7在J774细胞中不能激活转录因子NF-κB(图4)。对照的非CpG寡核苷酸在同样的实验条件下不能激活NF-κB(C道)。这些结果与小鼠脾细胞培养物实验中获得的数据是一致的。
实施例7电泳迁移率变动分析(EMSA)将大约0.2OD的CpG DNA和其它标记物溶解于25μL的100mMNaCl，10mM磷酸钠，pH 7.2的缓冲液中，加热至90℃15分钟，允许回到室温，并保存在4℃直到在凝胶上分析。将制备好的DNA样品与甘油缓冲液混合，并溶解在15％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上。在260nm紫外光下观察凝胶。
实施例8人B细胞和浆细胞样树突状细胞(pDC)的分离来自新鲜抽取的健康志愿者血液的PBMC(CBR Laboratories，Boston，MA)通过Ficoll密度梯度离心法(Histopaque-1077，Sigma)进行分离，而B细胞用CD19细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)按照厂商说明通过阳性选择从PBMC中进行分离。
实施例9B细胞增殖实验总量为1×105B细胞/200μl以0.3，1.0，3.0或10.0μg/mL浓度的CpGDNA刺激64小时，再以0.75μCi的[3H]-胸苷脉冲，8小时后收获。用液体闪烁计数器(liquid scintillation counter)测量放射性的掺入。表4显示6种CpGDNA在终浓度为10.0μg/mL时的B细胞增殖的平均值±SD。
表4人B-细胞增殖实验中的免疫子结构和免疫刺激活性(72小时) 正常状态代表硫代磷酸酯连接，下划线代表2’-O-甲基核糖核苷酸；X代表C3连接体。
实施例10人pDC培养和IFN-αELISA用BDCA-4细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)按照厂商说明从人PBMC中分离pDC。将pDC以1×106细胞/mL，200μL/孔铺于96孔板。将寡核苷酸加入细胞培养物至终浓度为0.3，1.0，3.0或10.0μg/mL，并在37℃温育24小时。然后收集上清，用ELISA试剂盒(PBL)检测α干扰素、IL-6和IL-10。表5A和5B显示6种寡核苷酸在浓度为10.0μg/mL时α干扰素的平均值±SD。
表5A人树突状细胞实验中的免疫子结构和免疫刺激活性(24小时)
正常状态代表硫代磷酸酯连接，下划线代表2’-O-甲基核糖核苷酸，X代表C3连接体R＝2’-脱氧-7-脱氮鸟苷表5B人树突状细胞实验中的免疫子结构和免疫刺激活性(24小时)
正常状态代表硫代磷酸酯连接，斜体代表磷酸二酯连接。
下划线＝2’-OMe-核苷酸R＝2’-脱氧-7-脱氮鸟苷G1＝2’-脱氧-7-脱氮guanoiseX＝甘油连接体实施例11细胞因子分析IFN-2和IL-6在脊椎动物细胞，优选BALB/c小鼠脾细胞或人PBMC中的分泌，通过夹心ELISA测定。所需试剂包括细胞因子抗体和细胞因子标准物购自PharMingen，San Diego，CA。将ELISA板(Costar)在PBSN缓冲液(PBS/0.05％叠氮钠，pH 9.6)中与5μg/mL的适当抗体在4℃温育过夜，然后以PBS/1％ BSA 37℃封闭30分钟。细胞培养物上清和细胞因子标准物用PBS/10％FBS适当稀释，一式三份加入所述的板中，并在25℃温育2小时。将板用1μg/mL适当的生物素化的抗体覆盖，并在25℃温育1.5小时。然后用PBS-T缓冲液(PBS/0.05％吐温20)充分洗涤，加入抗生物素蛋白链菌素结合的过氧化物酶(streptavidin conjugated peroxidase)(Sigma，St.Louis，MO)后再次在25℃温育1.5小时。将所述的板用Sure BlueTM(Kirkegaard and Perry)的显色试剂显影，并通过加入终止溶液(Kirkegaard and Perry)终止所述反应。用Ceres 900 HDI分光光度计(Bio-Tek Instruments)测定颜色变化。
人外周血单核细胞(PBMC)通过Ficoll-Paque密度梯度离心(Histopaque-1077，Sigma，St.Louis，MO)从健康志愿者的外周血中分离。简言之，肝素化血液在锥形离心机中于Histopaque-1077(等体积)上分层，并在室温以400xg离心30分钟。小心分离包含单核细胞的血沉棕黄层(buffy coat)，用等渗的磷酸盐缓冲盐水(PBS)通过250xg离心10分钟洗两次。然后将得到的细胞沉淀重悬于含有L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基(MediaTech，Inc.，Herndon，VA)，并补充10％的热灭活FCS和青霉素-链霉素(100U/ml)。在24孔板中按照1×106细胞/ml/孔在存在或不存在寡核苷酸的情况下将细胞培养不同的时间。在温育期的末尾，收获上清液，并在-70℃冻存，直到通过夹心ELISA对包括IL-6(BD Pharmingen，San Diego，CA)和IFN-α(BioSourceInternational)的不同细胞因子进行检测。结果在下面的表6A和6B中显示。
在所有的实例中，细胞培养物上清中IFN-2和IL-6的水平分别由IFN-2和IL-6在相同实验条件下构建的标准曲线计算而得。
表6A人PBMC实验中的免疫子结构和免疫刺激活性(24小时) 正常状态代表硫代磷酸酯连接，下划线代表2’-OMe-核糖核苷酸，X代表C3-连接体R＝2’-脱氧-7-脱氮鸟苷表6B人PBMC实验中的免疫子结构和免疫刺激活性(24小时)
正常状态代表一个硫代磷酸酯连接，斜体代表一个磷酸二酯连接。
下划线＝2’-OMe-核苷酸R＝2’-脱氧-7-脱氮鸟苷G1＝2’-脱氧-7-脱氮guanoiseX＝甘油连接体实施例12B细胞实验将B细胞以1×106个细胞/mL，200μL/孔铺于96孔板。将寡核苷酸加入细胞培养物至终浓度为0.3，1.0，3.0或10.0μg/mL，并在37℃温育24小时。然后收集上清液并用ELISA试剂盒(由PBL提供)检测IL-6。表7显示供体5-10在寡核苷酸终浓度为10.0μg/mL时的平均值±SD。
表7人B细胞实验中的免疫子结构和免疫刺激活性(24小时) 正常状态代表硫代磷酸酯连接；下划线代表2’-OMe-核糖核苷酸；X代表C3-连接体R＝2’-脱氧-7-脱氮鸟苷流式细胞分析CD69和CD86的细胞表面标记物以Coulter Epics-XL流式细胞仪利用购自BD Pharmingen(San Diego，USA)的抗-人CD69-Fitc和CD86-Fitc进行检测。染色方法简述如下。激活的培养物细胞用10％的人AB血清(Sigma)在染色缓冲液(含1％BSA和0.1％NaN3的PBS)中在40℃封闭1小时，并用所述的抗体在4℃过夜染色。PBMC(4×105)用CD69-Fitc和CD86-Fitc染色，PDC(2×105)用CD86-Fitc染色。用Coulter System II软件获取和分析细胞染色数据。
表8来自人PBMC的BC的免疫子结构和表达(24小时)
正常状态代表硫代磷酸酯连接；斜体代表磷酸二酯连接。
下划线＝2’-OMe-核苷R＝2’-脱氧-7-脱氮乌苷G1＝2’-脱氧-7-脱氮guanoiseX＝甘油连接体表9来自人PBMC的DC的免疫子结构和表达(24小时)
正常状态代表硫代磷酸酯连接，斜体代表磷酸二酯连接。
下划线＝2’-OMe-核苷R＝2’-脱氧-7-脱氮鸟苷G1＝2’-脱氧-7-脱氮guanoise
X＝甘油连接体相等物为了清楚和理解的目的，已经相当详细地描述了上述发明，本领域的技术人员通过阅读此公开可以理解，在不背离本发明和附加的权利要求的真实范围的情况下，可以对形式和细节进行各种不同的改变。
权利要求
1.一种免疫刺激性核酸，其包含寡核苷酸序列，该寡核苷酸至少包含一个二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中，C是胞苷或2，-脱氧胞苷，G是鸟苷或2’-脱氧鸟苷，C*是2′-脱氧胸苷、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’双脱氧-5-卤代胞苷、2’双脱氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2′-脱氧-2′-取代阿糖胞苷、2′-O-取代阿糖胞苷、2′-脱氧-5-羟基胞苷、2′-脱氧-N4-烷基-胞苷、2′-脱氧-4-硫代尿苷，或其它非天然嘧啶核苷，G*是2′脱氧-7-脱氮-鸟苷、2′-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2′-脱氧-2′取代-阿糖鸟苷、2′-O-取代-阿糖鸟苷、2′-脱氧肌苷，或其它非天然嘌呤核苷，p是核苷之间的连接体，其选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，其中所述的寡核苷酸序列在该寡核苷酸序列的3’-末端有二级结构。
2.权利要求1的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列的长度为约12到约50个核苷酸。
3.权利要求1的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列的长度为约12到约26个核苷酸。
4.权利要求1的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列形成了3’-端茎环二级结构。
5.权利要求1的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列在3’-端具有回文或互补序列。
6.权利要求1的免疫刺激性核酸选自SEQ ID NOS2，3，4，9，12，13，14，18，19，20，21，24，25，26，27，28，29，30，32，33，34，35，36，37或38。
7.一种免疫刺激性核酸，其具有降低的免疫刺激活性，包含寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列包含至少一个二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中，C是胞苷或2’-脱氧胞苷，G是鸟苷或2’-脱氧鸟苷，C*是2′-脱氧胸苷、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’-双脱氧-5-卤代胞苷、2’-双脱氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2′-脱氧-2′-取代阿糖胞苷、2′-O-取代阿糖胞苷、2′-脱氧-5-羟基胞苷、2′-脱氧-N4-烷基-胞苷、2′-脱氧-4-硫代尿苷，或者其它非天然嘧啶核苷，G*是2′-脱氧-7-脱氮鸟苷、2′-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2′-脱氧-2′取代-阿糖鸟苷、2′-O-取代-阿糖鸟苷、2′-脱氧肌苷，或其它非天然嘌呤核苷，p是核苷之间的连接体，其选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，其中，所述的寡核苷酸序列在该寡核苷酸序列的5’-端有二级结构。
8.权利要求7的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列的长度为约12到约50个核苷酸。
9.权利要求7的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列的长度为约12到约26个核苷酸。
10.权利要求7的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列形成5’-端的茎环二级结构。
11.权利要求7的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列在5’-端具有回文或互补序列。
12.权利要求7的免疫刺激性核酸选自SEQ ID NOS5，6，7，10，15，16或17。
13.一种降低或去除寡核苷酸的免疫刺激活性的方法，该寡核苷酸具有至少一个选自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*的二核苷酸，其中，C是胞苷或2’-脱氧胞苷，G是鸟苷或2’-脱氧鸟苷，C*是2′-脱氧胸苷、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’-双脱氧-5-卤代胞苷、2’-双脱氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2′-脱氧-2′-取代阿糖胞苷、2′-O-取代阿糖胞苷、2′-脱氧-5-羟基胞苷、2′-脱氧-N4-烷基-胞苷、2′-脱氧-4-硫代尿苷，或者其它非天然嘧啶核苷，G*是2′-脱氧-7-脱氮鸟苷、2′-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2′-脱氧-2′取代-阿糖鸟苷、2′-O-取代-阿糖鸟苷、2′-脱氧肌苷，或其它非天然嘌呤核苷，p是核苷之间的连接体，其选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，该方法包括在寡核苷酸的5’-端引入含二级结构的核酸序列。
14.权利要求13的方法，其中二级结构是茎环结构。
15.权利要求13的方法，其中二级结构是氢键结合至回文序列或互补序列。
16.一种包含权利要求1的免疫刺激性核酸和一种可药用的载体的药物组合物。
17.一种包含权利要求7的免疫刺激性核酸和一种可药用的载体的药物组合物。
18.一种包含至少两个寡核苷酸的免疫刺激性核酸，其中该免疫刺激性核酸具有二级结构，而且该免疫刺激性核酸包含常规结构结构域A-结构域B-结构域C(I)其中结构域A可以是5’-3’或3’-5’或2’-5’DNA、RNA、RNA-DNA、DNA-RNA，它们具有或不具有回文或自我互补结构域，该结构域包含或不包含至少一个二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中，C是胞苷或2’-脱氧胞苷，G是鸟苷或2’-脱氧鸟苷，C*是2′-脱氧胸苷、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’-双脱氧-5-卤代胞苷、2’-双脱氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2′-脱氧-2′-取代阿糖胞苷、2′-O-取代阿糖胞苷、2′-脱氧-5-羟基胞苷、2′-脱氧-N4-烷基-胞苷、2′-脱氧-4-硫代尿苷，或者其它非天然嘧啶核苷，G*是2′-脱氧-7-脱氮鸟苷、2′-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2′-脱氧-2′-取代-阿糖鸟苷、2′-O-取代-阿糖鸟苷、2′-脱氧肌苷或其它非天然嘌呤核苷，而且p是核苷之间的连接体，其选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，结构域B是连接结构域A和C的连接体，可以是3’-5’连接、2’-5’连接、3’-3’连接、磷酸基团、核苷，或者非核苷连接体，所述的非核苷连接体可以是脂肪族的、芳香族的、芳基的、环状的，手性的、非手性的，可以是肽，碳水化合物、脂类、脂肪酸、单-、三-、六聚乙二醇，或者杂环部分，并且结构域C可以是5’-3’或3’-5’、2’-5’DNA、RNA、RNA-DNA，DNA-RNA Poly I-Poly C，它们具有或不具有回文序列或自我互补序列，该序列可以有或没有二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中，C是胞苷或2’-脱氧胞苷，G是鸟苷或是2’-脱氧鸟苷，C*是2′-脱氧胸苷，1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤，2’-双脱氧-5-卤代胞苷，2’-双脱氧-5-硝基胞苷，阿糖胞苷，2′-脱氧-2′-取代阿糖胞苷，2′-O-取代阿糖胞苷，2′-脱氧-5-羟基胞苷，2′-脱氧-N4-烷基-胞苷，2′-脱氧-4-硫代尿苷，或者其它非天然嘧啶核苷，G*是2′-脱氧-7-脱氮鸟苷，2′-脱氧-6-硫代鸟苷，阿糖鸟苷，2′-脱氧-2′-取代-阿糖鸟苷，2′-O-取代-阿糖鸟苷，2′-脱氧肌苷，或其它非天然嘌呤核苷，p是核苷之间的连接体，其选自磷酸二酯或硫代磷酸酯。
19.权利要求18的免疫刺激性核酸，其具有选自SEQ ID NOS1-38的序列。
20.权利要求18的免疫刺激性核酸，其具有选自SEQ ID NOS39-68的序列。
全文摘要
本发明提供了免疫刺激性核苷酸，其含有至少一个CpG二核苷酸和一个在5’－或3’－端的二级结构。这些寡核苷酸具有降低或增强免疫刺激性的特性。本发明确定了5’－端二级结构比3’－端二级结构更显著地影响免疫刺激活性。本发明也提供了增高或降低含有CpG的核酸的免疫刺激活性的方法。
文档编号A01N43/04GK1835963SQ200480023195
公开日2006年9月20日 申请日期2004年6月10日 优先权日2003年6月11日
发明者埃坎巴·R·坎迪马拉, 拉克什米·巴加特, 雷詹德拉·K·潘德伊, 郁东, 萨德希尔·阿格拉沃尔 申请人:艾德拉药物股份有限公司