专利名称：稳定的免疫调节寡核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、免疫学和医学领域。更具体地，本发明涉及免疫刺激性寡核苷酸及其在治疗中的应用。
背景技术：
免疫系统已进化为特异性识别含有未甲基化的CpG 二核苷酸基序的DNA，所述的基序在病原微生物如细菌和病毒的DNA中广泛存在。结果，含有未甲基化CpG的 DNA成为脊椎动物免疫系统的有效刺激剂。通过DNA免疫刺激的第一个报道来自应用细菌DNA和含有回文序列的DNA小片段的研究，所述的DNA都是具有磷酸二酯骨架的双链结构。Tokunaga, T 等(J. Natl. Cancer Inst. 72 :955_962 (1984))报道了分离自牛分枝杆菌(Mycocacterium bovis)BCG 的 DNA 有效的抗肿瘤活性。Kataoka, T 等·，(Jpn. J. Cancer Res. 83 :244_247(1992))、Hartmann等· (European Journal of Immunology 33: 1673-1641 (2003))'Marshall 等(Journal of Leukocyte Biology73 781-792 (2003)显示了合成的脱氧寡核苷酸的相似类型的抗肿瘤活性，所述合成的脱氧寡核苷酸的设计基于牛分枝杆菌BCG cDNA序列。Sato，Y，等(Science 273 :352_354 (1996))显示了含有 CpG 的 DNA 在 DNA 疫苗应用中的重要性(也参见 Gurunathan S.，等(Annu. Rev. Immunol. 18 :927_974(2000))。 Pisetsky, D.S.,等(Mol. Biol. Rep. 18 :217_221 (1993))和 Krieg, A. M.,等·，(Nature 374 =546-549(1995))显示，在特定序列的环境中含有未甲基化的CpG-二核苷酸的DNA (CpG DNA)激活脊椎动物的免疫系统，导致B细胞增殖，并且激活巨噬细胞、单核细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)和树突细胞。出于对CpG DNA激活的应答，免疫细胞分泌大量的细胞因子，包括IL-12、IFN- Y , INF-a、IL-6和TNF-α，并且表达几个共刺激分子(例如，参见 Pisetsky, D. S.,等和 Krieg, A. M.,等，见前文)Kandimalla, E. R.，等(Curr· Opin. Mol. Ther. 4122-129(2002))指出 CpG- 二核 苷酸的存在和位置以及其侧翼的序列对于其免疫刺激活性是关键的。Agrawal，S.，等 (Current Cancer Drug Targets I 197-209 (2001))公开了由于 CpG 寡核苷酸的侧翼序列中的核糖修饰而产生的重大影响。这些影响取决于取代基的位置和性质，包括2’ -O-甲氧基乙氧基和 2’-或 3’ -O-甲基。Yu，D·，等(Bioorg. Med. Chem. 9 =2803-2808 (2001))证明了磷酸盐修饰因修饰位点不同也能增高或降低免疫刺激活性。Yu D.，等(Bioorg. Med. Chem. Lett. 11 =2263-2267 (2001))和 Yu D.，等(Bioorg. Med. Chem. 11 459-464 (2003)) 公开了通过缺失某些核苷酸碱基能增加活性。此外Yu D.,等(Bioorg. Med. Chem. 11 : 459-464 (2003))公开了通过用非核苷酸连接体取代某些侧翼核苷酸可增加免疫刺激活性。Yu D.，等(Bioorg. Med. Chem. Lett. 10 :2585_2588 (2000))，Yu D.，等(Nucleic AcidsRes.30 :4460_4469 (2002)), Yu D.,等(Biochem. Biophys. Res. Commun. 297 : 83-90 (2002)), Bhagat L.,等(Biochem. Biophys. Res. Commun. 300 853-861 (2003))以及 Kandimalla Ε· R.，等(Nucleic Acids Res. 31 =2393-2400 (2003))先前已经显示 5’-末端参与了受体的识别，该末端的易接近性对于活性是关键的。Kandimalla E. R.,等(Bioconj. Chem. 13 =966-974(2002))公开了 5’ -末端连接比荧光素大的配基或5’ -5’连接的二核苷酸使免疫刺激活性损失。由于3’ -连接无影响，因此摄取上的改变不是所述结果的原因 (同上)。然而，没有任何系统的研究以阐明DNA的二级结构在引起的免疫应答中的作用。 本发明在这里通过具有5’或3’ -发夹环或能形成双链体的粘性末端的免疫刺激性DNA提供了免疫刺激的信息。免疫刺激性DNA诱导Thl细胞因子产生和促进增加免疫球蛋白产生的CTL应答的能力已经用于治疗广谱的疾病适应症，其包括癌症、病毒及细菌感染、炎症性疾病以及作为免疫治疗中的佐剂。因此提高或调节免疫刺激性DNA活性的益处是显而易见的，而且在本技术领域中存在开发改进的免疫刺激性核酸的需求。
发明内容
本发明提供了包括具有增强或降低的免疫刺激性特性的免疫刺激性寡核苷酸的物质的新型组合物。本发明也提供了可进行具有增强或降低的免疫刺激性特性的或具有增加的代谢稳定性的免疫刺激性寡核苷酸的设计的方法。发明人令人惊讶地发现在免疫刺激性寡核苷酸的3’ -端或5’ -端引入二级结构可以明显影响这些寡核苷酸的免疫刺激活性和稳定性。第一方面，本发明提供了免疫刺激性核酸。该免疫刺激性核酸包含寡核苷酸序列， 该寡核苷酸序列至少包含一个二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG, CfpG*或CpG%其中，C 是胞苷或2’ -脱氧胞苷，G是鸟苷或2’ -脱氧鸟苷Cf是胞苷、2' _脱氧胸苷、I-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2_氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’ -双脱氧-5-卤代胞苷、 2’-双脱氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2'-脱氧-2'-取代阿糖胞苷、2' -O-取代阿糖胞苷、2' _脱氧-5-轻基胞苷、2' _脱氧-Ν4-烧基-胞苷、2' _脱氧-4-硫代尿苷或其它喃唳核苷类似物，G*是2'脱氧-7-脱氮-鸟苷、2' _脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2'-脱氧-2'取代-阿糖鸟苷、2' -O-取代-阿糖鸟苷、2'-脱氧肌苷或其它嘌呤核苷类似物， P是核苷之间的连接体，其选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在一些优选的实施方案中，寡核苷酸序列在该寡核苷酸序列的3’ -末端有二级结构。在一些优选的实施方案中，所述的免疫刺激性二核苷酸不是CpG。在一些实施方案中，免疫刺激性核酸长度为约2-约50个核苷酸。在一些实施方案中免疫刺激性核酸长度为约12-约26个核苷酸。在一些实施方案中,所述寡核苷酸每个具有约3-约35个核苷残基，优选约4-约30个核苷残基，更优选约4-约20个核苷残基。在一些实施方案中，所述的寡核苷酸具有约5-约18个或约5-约14个核苷残基。如在这里应用的，术语“约”意味着确切的数字并不重要。因而在所述寡核苷酸中核苷残基的数目并不重要，具有I或2个较少的核苷残基的寡核苷酸或者有一个到几个额外核苷残基的寡核苷酸，预期作为前述的每个实施方案的相等物。在一些实施方案中，有一个或多个寡核苷酸有11个核苷酸。在一些实施方案中，免疫刺激性核酸具有3’ -末端茎环二级结构。在一些实施方案中，免疫刺激性核酸通过与互补序列氢键结合的方式在3’ -末端具有二级结构。在一些实施方案中，免疫刺激性核酸选自 SEQ ID NOS 2, 3,4,9,12,13,14,18,19, 20, 21, 24, 25, 26，27，28，29，30，32，33，34，35，36，37 或 38。第二方面，本发明提供了具有降低的免疫刺激活性的核酸。在此方面，所述的核酸包含寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列至少包含一个二核苷酸，该二核苷酸选自CpG, C*pG, C*pG*或CpG%其中，C是胞苷或2’ -脱氧胞苷，G是鸟苷或2’ -脱氧鸟苷，Cf是2'-脱氧胸苷、1-(2/ -脱氧-β -D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’-双脱氧-5-卤代胞苷、2’ -双脱氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2'-脱氧-2'-取代阿糖胞苷、2' -O-取代阿糖胞苷、2' _脱氧-5-轻基胞苷、2' _脱氧-Ν4-烧基-胞苷、2' _脱氧-4-硫代尿苷，或者其它嘧啶核苷类似物；G*是2'脱氧-7-脱氮鸟苷、2'-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2'-脱氧-2'取代-阿糖鸟苷、2' -O-取代-阿糖鸟苷、2'-脱氧肌苷，或其它嘌呤核苷类似物，P是核苷之间的连接体，选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在一些优选的实施方案中，寡核苷酸序列在该寡核苷酸序列的3’ -端具有二级结构。在一些优选的实施方案中，所述的免疫刺激性二核苷酸不是CpG。在一些实施方案中，所述免疫刺激性核酸是长度为约2-约50个核苷酸的寡核苷酸序列。在一些实施方案中，所述免疫刺激性核酸是长度为约12-约26个核苷酸的寡核苷酸序列。在一些实施方案中，具有降低的免疫刺激活性的核酸形成5’ -端茎环二级结构。 在一些实施方案中，具有降低的免疫刺激活性的核酸通过与互补序列氢键结合的方式在 5’-端具有二级结构。在一些实施方案中，具有降低的免疫刺激活性的核酸选自SEQ ID NOS :5，6，7，10，15，16 或 17。第三方面，本发明提供了包含至少2个寡核苷酸的免疫刺激性核酸，其中该免疫刺激性核酸有二级结构。在这个方面，该免疫刺激性核酸包含如公式(I)详细描述的结构结构域A-结构域B-结构域C (I)结构域的长度可为约2-约12个核苷酸。结构域A可以是5’ -3’或3’ -5或 2’ -5’ DNA、RNA、RNA-DNA、DNA-RNA，它们具有或不具有回文区域或自我互补区域，该区域包含或不包含至少一个二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG, CfpG*或CpG%其中，C是胞苷或 2’_脱氧胞苷，G是鸟苷或2’脱氧鸟苷,Cf是2' _脱氧胸苷、I-(2' _脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’-双脱氧-5-齒代胞苷、2’_双脱氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2'-脱氧-2'-取代阿糖胞苷、2' -O-取代阿糖胞苷、2'-脱氧-5-羟基胞苷、2' _脱氧-Ν4-烧基-胞苷、2' _脱氧-4-硫代尿苷,或者其它喃唳核苷类似物；G-是鸟苷或2'脱氧鸟苷、2'脱氧-7-脱氮鸟苷、2'-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2'-脱氧-2'取代-阿糖鸟苷、2' -O-取代-阿糖鸟苷、2'-脱氧肌苷或其它嘌呤核苷类似物。在一些实施方案中，结构域A具有一个以上二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG, CfpG*或 CpG*。结构域B，如下文图示的“X”，是一个连接结构域A和结构域C的连接体，其可以是一个3’ -5’连接、2’ -5’连接、3’ -3’连接，可以是磷酸基团、核苷，或者非核苷连接体，所述的非核苷连接体可以是脂肪族的、芳香族的、芳基的、环状的，手性、非手性的，可以是肽， 碳水化合物、脂类、脂肪酸、单_、三-或六聚乙二醇，或者杂环部分。在一些实施方案中，结构域B优选非核苷酸连接体，其连接结构域A和结构域C的寡核苷酸，它们被称为“免疫子 (immunomer) ”。结构域C 可以是 5，-3，或 3，-5，、2，_5，DNA,RNA,RNA-DNA,DNA-RNAPoIy I-Poly C，它们具有或不具有回文序列或自我互补序列，该序列具有或不具有二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG, C*pG*或CpG%其中C是胞苷或2’ -脱氧胞苷，G是鸟苷或是2’ -脱氧鸟苷，Cf是2'-脱氧胸苷，I-(2'-脱氧_β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤，阿糖胞苷，2'-脱氧-2'-取代阿糖胞苷，2' -O-取代阿糖胞苷，2'-脱氧-5-羟基胞苷，2' _脱氧-Ν4-烧基-胞苷,2' _脱氧-4-硫代尿苷,或者其它喃唳核苷类似物，G* 是2' _脱氧-7-脱氮鸟苷,2' _脱氧-6-硫代鸟苷,阿糖鸟苷,2' _脱氧-2' _取代-阿糖鸟苷，2' -O-取代-阿糖鸟苷，2'-脱氧肌苷，或其它嘌呤核苷类似物，P是核苷之间的连接体，其选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在一些优选的实施方案中，免疫刺激性二核苷酸不是CpG。在一些优选的实施方案中，结构域C没有二核苷酸CpG，CfpG,CfpG* 或 CpG*ο在一些实施方案中，公式(I)中所包括的寡核苷酸长度为约2-约50个核苷酸。在一些实施方案中，公式(I)中所包括的寡核苷酸长度为约12-约26个核苷酸。通过非限制性实施例的方式，在该方面的一些实施方案中，免疫刺激性核酸会有如图17公式(II)详细描述的结构。该领域的技术人员会识别出，在该分子的3’端有分子内茎环形式的二级结构元件。通过非限制性实施例的方式，在该方面的一些实施方案中，免疫刺激性核酸会有如图17公式(III)详细描述的结构。此处由公式(III)描述的结构被称为“末端二聚体”，因为两个分子的3’端由于两个3’端序列互补允许分子间氢键结合而封闭。另外，结构域A和A’区可以等同也可以不等同，结构域B和B’区可以等同也可以不等同，结构域C和C’区可以等同也可以不等同。通过非限制性实施例的方式，在该方面的一些实施方案中，免疫刺激性核酸会有如图17公式(IV)详细描述的结构。该领域的技术人员会识别出，在所描述的分子的3’端有二级结构，由于其3’端的互补序列通过氢键结合在这个区域。在一些实施方案中，本发明的免疫刺激性核酸具有选自SEQ ID N0S:1_38的序列。 在一些实施方案中，本发明的免疫刺激性核酸具有选自SEQ ID NOS 39-68的序列。
第四方面，本发明提供了降低或去除寡核苷酸的免疫刺激活性的方法。该方法包括在该寡核苷酸的5’ -端引入包含二级结构的核酸序列。在该方面一些实施方案中，所述的二级结构是茎-环结构。在该方面一些实施方案中，所述的二级结构是通过在所述寡核苷酸序列的5’ -端氢键结合互补序列而获得的。第五方面，本发明提供了提高免疫刺激性寡核苷酸稳定性的方法。该方法包括在免疫刺激性寡核苷酸的3’ -端引入含二级结构的核酸序列。在该方面的一些实施方案中， 该二级结构是茎环结构。在该方面的一些实施方案中，该二级结构是通过在所述寡核苷酸序列的3’ -端氢键结合互补序列而获得的。第六方面，本发明提供了调节免疫刺激性寡核苷酸的免疫刺激活性的方法。该方法包括在免疫刺激性寡核苷酸的3’ -端或5’ -端引入含二级结构的核酸序列。在该方面的一些实施方案中，该二级结构是茎环结构。在该方面的一些实施方案中，该二级结构是通过在所述寡核苷酸的3’ -端或5’ -端氢键结合互补序列而获得的。第七方面，本发明提供了药物组合物。这些组合物包括单独或组合在本发明第一、 二、三、四、五、六方面公开的任何一种组合物，以及可药用的载体。
图I中，A是一个示意图，其显示在BALB/c小鼠脾细胞培养物中，由寡核苷酸I，2， 和5在浓度为I. O μ g/mL时诱导的细胞增殖；B是一个示意图，其显示通过将寡核苷酸I，2， 和5以5mg/kg的剂量向BALB/c小鼠腹膜内给药诱导的脾肿大。图2是一个示意图，其显示在BALB/c小鼠脾细胞培养物中，与寡核苷酸1_7在浓度为3 μ g/mL温育24小时后，诱导细胞因子IL-12和IL-6的情况。图3是一个示意图，其显示在BALB/c小鼠脾细胞培养物中，与寡核苷酸8-10在浓度为3 μ g/mL温育24小时后，诱导细胞因子IL-12和IL-6的情况。图4显示，用10 μ g/mL的寡核苷酸1_8在刺激I小时后，J774巨噬细胞中的 NF- K B途径的激活。M代表用培养基处理的对照，C是用非-CpG寡核苷酸处理的细胞。图5是一个示意图，其显示在J774巨噬细胞培养物中，寡核苷酸1_7在浓度为 10 μ g/mL时，诱导细胞因子IL-12和IL_6。M代表用PBS处理的对照，ND是指没有检测到。图6是一个示意图，其显示暴露在浓度为10 μ g/ml的寡核苷酸11，12，14，15和17 之后，浆细胞样树突状细胞中α-干扰素(IFN-α)的诱导。图7是一个示意图，其显示暴露在浓度为10 μ g/ml的寡核苷酸18，19，20和21之后，衆细胞样树突状细胞中α-干扰素(IFN-a)的诱导。图8是一个示意图，其显示暴露在浓度为10 μ g/ml的寡核苷酸41，44和45之后， 浆细胞样树突状细胞中α-干扰素(IFN-a)的诱导。图9是平行合成本发明的免疫子(immunomer)的合成方案。DMTr = 4,4' 二甲氧
基三苯甲基，CE =氰乙基。图10描述一组有代表性的，适合线性合成本发明的免疫子的小分子连接体。图11是线性合成本发明的免疫子的合成方案。DMTr = 4，4' 二甲氧基三苯甲基， CE =氰乙基。图12描述一组有代表性的，适合平行合成本发明免疫子的小分子连接体。
图13自我稳定的CpG DNA (A)通过人pDC诱导IFN- α分泌及⑶诱导人B-细胞在培养物中的增殖。(A)pDC从5-8个健康捐献者的人PBMC中分离，用浓度为10 μ g/mL 的CpG DNA刺激24小时，并通过ELISA检测上清液的IFN- α分泌。⑶B细胞从4_7个健康捐献者的人PBMC中分离，用浓度为I μ g/mL的CpG DNA刺激72小时，检测[3H]-胸苷摄取。符号代表从每个捐献者获取的数据，而加号代表两个图面中所有捐献者的平均值。图14人B细胞增殖对CpG DNA浓度的依赖性。B细胞从4_6个健康捐献者的人 PBMC中分离，用不同浓度的CpG DNA刺激72小时。数据显示的是平均值土SD图15 (A) CpG基序以及二级结构的存在对于通过人pDC诱导IFN- α分泌来说是必需的。显示的数据是6-8个人捐献者在CpG DNA浓度为10 μ g/mL的平均值土SD。⑶人 B-细胞增殖需要DNA中有CpG刺激基序的存在而不是二级结构。数据显示的是5-8个捐献者在CpG DNA浓度为I μ g/mL的平均值土 SD。图16发夹二级结构中的2’ -O-甲基核糖核苷酸片段㈧对于通过人pDC分泌 IFN-α的影响和(B)对于人B-细胞增殖的影响。显示的数据是在pDC培养物中在10 μ g/ mL的CpG DNA浓度6_8个人捐献者的平均值土SD和在B细胞培养物中在I μ g/mL的CpG DNA浓度5-8个捐献者的平均值土 SD。
图17描述免疫刺激性核酸公式(II)、(II)和(IV)的结构。
图18描述CpG DNA的示意图、序列、二级结构和Tm。发明详述本发明提供了包括具有增强或降低的免疫刺激性特性的免疫刺激性寡核苷酸的物质的新型组合物。本发明也提供了得以设计具有增强或降低的免疫刺激性特性的或具有增加的代谢稳定性的免疫刺激性寡核苷酸的方法。发明人令人惊讶地发现在免疫刺激性寡核苷酸的3’ -端或5’ -端引入二级结构可以明显影响这些寡核苷酸的免疫刺激活性或稳定性。本文所引用的已发布专利、专利申请、参考文献都被纳入本文以同等程度作参考， 如同每一个都被具体地、个别地标明被纳入以作参考。如果在本文中引用的任何参考文献的任何教导与本说明书有矛盾，为了本发明目的，优先适用后者。在第一个方面，本发明提供了免疫刺激性核酸。该免疫刺激性核酸包含寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列至少包括一个二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG, C*pG*或CpG%其中C是胞苷或2’ -脱氧胞苷,G是鸟苷或2’ -脱氧鸟苷,Cf是2' _脱氧胸苷、I-(2'-脱氧-β -D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2 ’ -双脱氧-5-卤代胞苷、2 ’ -双脱氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2'-脱氧-2'-取代阿糖胞苷、2' -O-取代阿糖胞苷、 2' _脱氧-5-轻基胞苷、2' _脱氧-Ν4-烧基-胞苷、2' _脱氧-4-硫代尿苷,或者其它喃啶核苷类似物；G*是2'-脱氧-7-脱氮鸟苷、2'-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2'-脱氧-2'取代-阿糖鸟苷、2' -O-取代-阿糖鸟苷、2'-脱氧肌苷，或其它嘌呤核苷类似物， P是核苷之间的连接体，选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，而且其中，在所述寡核苷酸序列的3’ -端有二级结构。在一些优选的实施方案中，所述免疫刺激性二核苷酸不是 CpG。在一些实施方案中，免疫刺激性核酸的长度为约2-约50个核苷酸。在一些实施方案中，免疫刺激性核酸的长度为约12-约26个核苷酸。在一些实施方案中，每个寡核苷酸具有约3-约35个核苷残基，优选约4-约30个核苷残基，更优选约4-约20个核苷残基。 在一些实施方案中，所述的寡核苷酸具有约5-约18或约5-约14个核苷残基。如在这里应用的，术语“约”意味着确切的数字并不重要。因而在所述的寡核苷酸中核苷残基的数目并不重要，具有I或2个较少的核苷残基的寡核苷酸或者有一个到几个额外核苷残基的寡核苷酸，预期作为前述的每个实施方案的相等物。在一些实施方案中，一个或多个寡核苷酸有11个核苷酸。在一些实施方案中，免疫刺激性核酸在3’ -末端有茎环二级结构。在一些实施方案中，免疫刺激性核酸通过与互补序列氢键结合的方式在3’ -端具有二级结构。在一些实施方案中，免疫刺激性核酸选自 SEQ ID NOS 2, 3,4,9,12,13,14,18,19, 20, 21, 24, 25, 26, 27，28，29，30，32，33，34，35，36，37 或 38。为了本发明的目的，术语“寡核苷酸”是指由大量的连接的核苷单位组成的多聚核苷。这样的寡核苷酸可以从现有的核酸来源获得，包括基因组核酸或cDNA，但是优选通过合成方法产生。在优选的实施方案中，每个核苷单位包括杂环碱基和呋喃戊糖基 (pentofuranosyl) ,2，-脱氧呋喃戍糖基(2’_deoxypentfuranosyl)，海藻糖(trehalose)， 阿拉伯糖(arabinose) ,2’ -脱氧 _2，_ 取代阿拉伯糖(2，-deoxy-2’ -substituted arabinose), 2’ -O-取代阿拉伯糖(2，-O-substituted arabinose)或己糖基团(hexose sugar group)。核苷残基可通过大量已知的核苷之间的连接中的任一种彼此偶联。这样的核苷间连接包括，但不限于磷酸二酯(phosphodiester),硫代磷酸酯(phosphorothioate), 二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)，烧基膦酸酯(alkyIphosphonate)，烧基硫代憐酸酯(alkyIphosphonothioate)，憐酸三酯(phosphotriester)，氨基憐酸酯 (phosphoramidate)，娃氧烧(siIoxane)，碳酸酯(carbonate)，烧氧羰基(carboalkoxy)， 乙酰胺化物(acetamidate),氨基甲酸酯(carbamate),吗啉代(morpholino),硼烧 (borano),硫醚(thioether)，桥连氨基磷酸酯(bridged phosphoramidate)，桥连亚甲基膦酸酯(bridged methylene phosphonate),桥连硫代憐酸酯(bridged phosphorothioate) 和砜(sulfone)核苷间连接。术语“寡核苷酸”也包括具有一个或多个立体特异性的核苷间连接的多聚核苷(例如，(RP)-或(SP)-硫代磷酸酯，烷基膦酸酯或磷酸三酯连接)。如本文应用的，术语“寡核苷酸”和“二核苷酸”明显地旨在包括具有任意上述核苷间连接的多聚核苷和二核苷，而不管该连接是否包含磷酸基团。在一些优选实施方案中，这些核苷间连接可以是磷酸二酯，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯连接，或其组合。术语“寡核苷酸”也包括含有额外的取代基的多聚核苷，所述的取代基包括，但不限于，蛋白基团，亲脂基团，嵌入剂，二元胺(diamine)，叶酸，胆固醇和金刚烷。术语“寡核苷酸”也包括任何其它含有聚合物的核苷酸碱基，所述的聚合物包括，但不限于，肽核酸 (PNA)，具有磷酸基团的肽核酸(PHONA)，封闭的核酸(LNA)，吗啉代-骨架寡核苷酸和具有带烷基连接体或氨基连接体的骨架部分的寡核苷酸。本发明的寡核苷酸可以包括天然存在的核苷，经修饰的核苷或其混合物。如本文所应用的，术语“经修饰的核苷”是指包括经修饰的杂环碱基，经修饰的糖基部分，或其组合的核苷。在一些实施方案中，经修饰的核苷是如本文所描述的非-天然的嘧啶或嘌呤核苷。 在一些实施方案中，经修饰的核苷是2,-取代核糖核苷，阿拉伯糖核苷或2’-脱氧-2’-取代阿拉伯糖苷。
为了本发明目的，术语“2'-取代核糖核苷”或“2’ -取代阿拉伯糖苷”包括核糖核苷或者阿拉伯糖核苷，其中在该戊糖部分的2'位置的羟基被取代而产生2'-取代或 2' -O-取代核糖核苷。优选地，这样的取代是以含有1-6个饱和的或不饱和的碳原子的低级烷基，或者以具有6-10个碳原子的芳基取代，其中，所述的烷基或芳基可以是未取代的也可以是取代的，例如以齒基(halo),轻基,三氟甲基(trif Iuoromethyl),氰基(cyano), 硝基(nitro),酰基(acyl),酰氧基(acyloxy),烧氧基(alkoxy),羧基(carboxyl),烧氧羰基(carboalkoxy)或氨基取代。2' _0_取代核糖核苷或2' _0_取代-阿拉伯糖苷的实例包括，但不限于2' -O-甲基核糖核苷，2' -O-甲基阿拉伯糖苷，和2' -O-甲氧基乙氧基核糖核苷(2' -0-methoxyethoxyribonucIeoside)或2' -O-甲氧基乙氧基阿拉伯糖苷( 2’ -O-methoxyethoxyarabinoside)。术语“2'-取代核糖核苷”或“2'-取代阿拉伯糖苷”也包括其中2'-羟基被含有1-6个饱和或不饱和碳原子的低级烷基所取代或被氨基或齒素基团取代的核糖核苷或阿拉伯糖苷。所述的2'-取代核糖核苷或2'-取代阿拉伯糖苷的实例包括，但不限于， 2’ -氛基，2’ -氣(2，-f Iuoro), 2’ -稀丙基(2，-allyl)和 2’ -块丙基(2，-propargyl) 核糖核苷或阿拉伯糖苷。术语“寡核苷酸”包括杂合(hybrid)寡核苷酸和嵌合(chimeric)寡核苷酸。“嵌合寡核苷酸”是具有一个以上类型的核苷间连接的寡核苷酸。所述的嵌合寡核苷酸的一个优选实例是包含硫代磷酸酯，磷酸二酯或二硫代磷酸酯区域和非-离子键例如烷基膦酸酯或烷基硫代膦酸酯连接的嵌合寡核苷酸(参见，例如Pederson等.U. S.专利No. 5，635，377 和 5，366，878)。“杂合寡核苷酸”是具有一个以上类型核苷的寡核苷酸。所述的杂合寡核苷酸的一个优选实例是包含核糖核苷酸或2'取代核糖核苷酸区域，和脱氧核糖核苷酸区域(参见， 例如 Metelev 和 Agrawal，美国专利 No. 5，652，355，6，346，614 和 6，143，881)。如本文应用的，所述的术语“二级结构”是指分子内和分子间的氢键结合。分子内氢键结合导致茎-环结构的形成，分子间氢键结合导致双链体核酸分子的形成。如本文应用的，所述的术语“大约”意味着精确的数字并不重要。因此，寡核苷酸中的核苷残基数不重要，为了本发明之目的，具有一个或两个较少的核苷残基，或一个到几个附加的核苷残基的寡核苷酸，预期作为前述的每个实施方案的相等物。如本文应用的，所述的术语“互补”是指具有与核酸杂交的能力。所述的杂交通常是在互补链之间经氢键结合的结果，优选形成Watson-Crick或Hoogsteen碱基对,尽管氢键的其它模式以及碱基堆积也能导致杂交。第二方面，本发明提供了具有降低的免疫刺激活性的核酸。在该方面所述的核酸包含寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列至少含有一个二核苷酸，该二核苷酸选自CpG, C*pG, C*pG*或CpG%其中C是胞苷或2’ -脱氧胞苷，G是鸟苷或2’ -脱氧鸟苷，C*是2'-脱氧胸苷、I- (2'-脱氧-β -D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’ -双脱氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2'-脱氧-2'-取代阿糖胞苷、2' -O-取代阿糖胞苷、2'-脱氧-5-羟基胞苷、2' _脱氧-Ν4-烧基-胞苷、2' _脱氧-4-硫代尿苷,或者其它喃唳核苷类似物,G* 是2' _脱氧-7-脱氮鸟苷、2' _脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2' _脱氧-2'取代-阿糖鸟苷、2' -O-取代-阿糖鸟苷、2'-脱氧肌苷，或其它嘌呤核苷类似物，P是核苷之间的连接体，选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。其中寡核苷酸序列在该寡核苷酸序列的5’ -端具有二级结构。在一些优选实施方案中，所述的免疫刺激性二核苷酸不是CpG。在一些实施方案中，免疫刺激性核酸是长度为约2-约50个核苷酸的寡核苷酸序列。在一些实施方案中，免疫刺激性核酸是长度为约12-约26个核苷酸的寡核苷酸序列。 在一些实施方案中，每个寡核苷酸具有约3-约35个核苷残基,优选约4-约30个核苷残基， 更优选约4-约20个核苷残基。在一些实施方案中，寡核苷酸具有约5-约18,或约5-约 14个核苷残基。如本文应用的，术语“约”意味着精确的数字并不重要。因此，寡核苷酸中核苷残基数目不重要，并且具有一个或两个更少的核苷残基，或一个到几个附加核苷残基的寡核苷酸，预期作为前述的每个实施方案的相等物。在一些实施方案中，I个或多个寡核苷酸有11个核苷酸。在一些实施方案中，具有降低的免疫刺激活性的核酸形成5’ -端茎环二级结构。 在一些实施方案中，所述具有降低的免疫刺激活性的核酸在5’ -端通过与互补序列氢键结合具有二级结构。在一些实施方案中，具有降低的免疫刺激活性的核酸选自SEQ ID NOS 5,6,7,10，15，16 和 17。第三方面，本发明提供了包含至少2个寡核苷酸的免疫刺激性核酸，其中该免疫刺激性核酸具有二级结构。在该方面，该免疫刺激性核酸包含一个如公式(I)详细描述的结构。结构域A-结构域B-结构域C (I)结构域的长度可为约2-约12个核苷酸。结构域A可以是5’ -3’或3’ -5’或 2’ -5’ DNA、RNA、RNA-DNA、DNA-RNA，它们具有或不具有回文区域或自我互补区域，该区域包含或不包含至少一个二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG, CfpG*或CpG%其中C是胞苷或 2’_脱氧胞苷，G是鸟苷或2’脱氧鸟苷,Cf是2' _脱氧胸苷、I-(2' _脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’ -双脱氧-5-齒代胞苷、2’ -双脱氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2'-脱氧-2'-取代阿糖胞苷、2' -O-取代阿糖胞苷、2'-脱氧-5-羟基胞苷、2' _脱氧-Ν4-烧基-胞苷、2' _脱氧-4-硫代尿苷,或者其它喃唳核苷类似物； G*-是2 ' _脱氧-7-脱氮鸟苷、2 ' _脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2' _脱氧-2'-取代-阿糖鸟苷、2' -O-取代-阿糖鸟苷、2'-脱氧肌苷或其它嘌呤核苷类似物。P是核苷之间的连接体，其选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在一些优选实施方案中，所述的免疫刺激性二核苷酸不是CpG。在一些实施方案中，结构域A将具有一个以上二核苷酸,该二核苷酸选自CpG, CfpG，C*pG* 或 CpG'结构域B，即下文图示的“X”，是连接结构域A和结构域C的连接体，其可以是 3’ -5’连接、2’ -5’连接、3’ -3’连接，可以是磷酸基团、核苷，或者非核苷连接体，所述的连接体可以是脂肪族的、芳香族的、芳基的、环状的，手性的、非手性的，可以是肽，碳水化合物、脂类、脂肪酸、单_、三-或六聚乙二醇，或者杂环部分。结构域C 可以是 5’ -3’ 或 3’ -5’、2’ -5’ DNA、RNA、RNA_DNA、DNA-RNAPoly I-Poly C，它们具有或是不具有一个回文序列或自我互补序列，该序列可具有或不具有二核苷酸， 该二核苷酸选自CpG，C*pG, C*pG*或CpG%其中C是胞苷或2’ -脱氧胞苷，G是鸟苷或是 2’_脱氧鸟苷，Cf是2 ' _脱氧胸苷，I-(2' _脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤，2’-双脱氧-5-齒代胞苷，2’-双脱氧-5-齒代胞苷，阿糖胞苷,2'-脱氧-2'-取代阿糖胞苷，2' -O-取代阿糖胞苷，2'-脱氧-5-羟基胞苷，2'-脱氧-N4-烷基-胞苷，2' _脱氧-4-硫代尿苷,其它喃唳核苷类似物，G*是2' _脱氧-7-脱氮鸟苷, 2，-脱氧-6-硫代鸟苷，阿糖鸟苷，2'-脱氧-2'-取代-阿糖鸟苷，2' -O-取代-阿糖鸟苷，2'-脱氧肌苷，或其它嘌呤核苷类似物，P是核苷之间的连接体，选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在一些优选实施方案中，所述的免疫刺激性二核苷酸不是CpG。在一些优选的实施方案中，结构域B优选是连接结构域A和结构域C的寡核苷酸的非-核苷连接体，其被称为“免疫子”。在一些优选实施方案中，结构域C不具有二核苷酸CpG，C*pG, C*pG* 或 CpG'在一些实施方案中，公式(I)中含有的寡核苷酸的长度是约2-约50个核苷酸。在一些实施方案中，公式(I)中含有的寡核苷酸的长度是约12-约26个核苷酸。在一些实施方案中，每个寡核苷酸具有约3-约35个核苷残基,优选约4-约30个核苷残基,更优选约 4-约20个核苷残基。在一些实施方案中，寡核苷酸具有约5-约18,或约5-约14个核苷残基。本文所述的术语“约”意味着精确的数字不是重要的。因此，寡核苷酸中核苷残基数目不是重要的，并且具有一个或两个更少的核苷残基，或具有一个到几个附加核苷残基的寡核苷酸，预期作为前述的每个实施方案的相等物。在一些实施方案中，一个或多个寡核苷酸有11个核苷酸。通过非限制性实施例的方式，在该方面的一些实施方案中，免疫刺激性核酸会有如图17公式(II)详细描述的结构。该领域的技术人员识别出，在该分子的3’端有分子内茎环形式的二级结构元件。通过非限制性实施例的方式，在该方面的一些实施方案中，免疫刺激性核酸会有如图17公式(III)详细描述的结构。此处由公式(III)描述的结构被称为“末端二聚体”，因为两个分子的3’端由于两 3’端序列互补允许分子间氢键结合而封闭。另外，结构域A和A’区可以相同也可以不相同，结构域B和B’区可以相同也可以不相同，结构域C和C’区可以相同也可以不相同。通过非限制性实施例的方式，在该方面的一些实施方案中，免疫刺激性核酸会有如图17公式(IV)详细描述的结构。该领域的技术人员会识别出，在所描述的分子的3’端有二级结构，由于其3’端的互补序列通过氢键结合在这个区域。在一些实施方案中，分子例如配体结合在3’ -端以利于细胞的摄取或改善分子的稳定性。本发明的一些核酸的非限制性的实例列于表I中。表I
权利要求
1.一种免疫刺激性核酸，其包含寡核苷酸序列，该寡核苷酸至少包含一个二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG, C*pG*或CpG%其中，C是胞苷或2’ -脱氧胞苷，G是鸟苷或2’ -脱氧鸟苷，Cf是2'-脱氧胸苷、I- (2'-脱氧-β -D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’双脱氧-5-齒代胞苷、2’双脱氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2' _脱氧-2'-取代阿糖胞苷、2' -O-取代阿糖胞苷、2'-脱氧-5-羟基胞苷、2'-脱氧-Ν4-烷基-胞苷、 2'-脱氧-4-硫代尿苷，或其它非天然嘧啶核苷，G*是2'脱氧-7-脱氮-鸟苷、2'-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2'-脱氧-2'取代-阿糖鸟苷、2' -O-取代-阿糖鸟苷、 2，-脱氧肌苷，或其它非天然嘌呤核苷，P是核苷之间的连接体，其选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，其中所述的寡核苷酸序列在该寡核苷酸序列的3’ -末端有二级结构。
2.权利要求I的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列的长度为约12到约50个核苷酸。
3.权利要求I的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列的长度为约12到约26个核苷酸。
4.权利要求I的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列形成了3’ -端茎环二级结构。
5.权利要求I的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列在3’-端具有回文或互补序列。
6.权利要求I的免疫刺激性核酸选自SEQID NOS :2，3，4，9，12，13，14，18，19，20，21， 24，25，26，27，28，29，30，32，33，34，35，36，37 或 38。
7.一种免疫刺激性核酸，其具有降低的免疫刺激活性，包含寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列包含至少一个二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG, CfpG*或CpG%其中，C是胞苷或 2’_脱氧胞苷，G是鸟苷或2’-脱氧鸟苷,Cf是2' _脱氧胸苷、I-(2' _脱氧-β-D-呋喃核糖基)~2~氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’-双脱氧-5-齒代胞苷、2’_双脱氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2'-脱氧-2'-取代阿糖胞苷、2' -O-取代阿糖胞苷、2'-脱氧-5-羟基胞苷、2' _脱氧-Ν4-烧基-胞苷、2' _脱氧-4-硫代尿苷,或者其它非天然喃唳核苷,G* 是2' _脱氧-7-脱氮鸟苷、2' _脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2' _脱氧-2'取代-阿糖鸟苷、2' -O-取代-阿糖鸟苷、2'-脱氧肌苷，或其它非天然嘌呤核苷，P是核苷之间的连接体，其选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，其中，所述的寡核苷酸序列在该寡核苷酸序列的5’ -端有二级结构。
8.权利要求7的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列的长度为约12到约50个核苷酸。
9.权利要求7的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列的长度为约12到约26个核苷酸。
10.权利要求7的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列形成5’-端的茎环二级结构。
11.权利要求7的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列在5’-端具有回文或互补序列。
12.权利要求7的免疫刺激性核酸选自SEQID NOS -.5,6,7,10，15，16或17。
13.一种降低或去除寡核苷酸的免疫刺激活性的方法，该寡核苷酸具有至少一个选自 CpG, C*pG, C*pG*或CpG*的二核苷酸，其中，C是胞苷或2’-脱氧胞苷，G是鸟苷或2’-脱氧鸟苷，Cf是2'-脱氧胸苷、I-(2'-脱氧_β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’-双脱氧-5-齒代胞苷、2’ -双脱氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2' _脱氧-2' _取代阿糖胞苷、2' -O-取代阿糖胞苷、2'-脱氧-5-羟基胞苷、2'-脱氧-Ν4-烷基-胞苷、 2，-脱氧-4-硫代尿苷，或者其它非天然嘧啶核苷，G*是2'-脱氧-7-脱氮鸟苷、2'-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2'-脱氧-2'取代-阿糖鸟苷、2' -O-取代-阿糖鸟苷、 2，-脱氧肌苷，或其它非天然嘌呤核苷，P是核苷之间的连接体，其选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，该方法包括在寡核苷酸的5’ -端引入含二级结构的核酸序列。
14.权利要求13的方法，其中二级结构是茎环结构。
15.权利要求13的方法，其中二级结构是氢键结合至回文序列或互补序列。
16.—种包含权利要求I的免疫刺激性核酸和一种可药用的载体的药物组合物。
17.—种包含权利要求7的免疫刺激性核酸和一种可药用的载体的药物组合物。
18.—种包含至少两个寡核苷酸的免疫刺激性核酸，其中该免疫刺激性核酸具有二级结构，而且该免疫刺激性核酸包含常规结构结构域A-结构域B-结构域C (I)其中结构域A可以是5’ -3’或3’ -5’或2’ -5’ DNA、RNA、RNA-DNA、DNA-RNA，它们具有或不具有回文或自我互补结构域，该结构域包含或不包含至少一个二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG, CfpG*或CpG%其中，C是胞苷或2’ -脱氧胞苷，G是鸟苷或2’ -脱氧鸟苷， Cf是2'-脱氧胸苷、1_(2'-脱氧_β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’-双脱氧-5-齒代胞苷、2’-双脱氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2' _脱氧-2' _取代阿糖胞苷、2' -O-取代阿糖胞苷、2'-脱氧-5-羟基胞苷、2'-脱氧-Ν4-烷基-胞苷、 2，-脱氧-4-硫代尿苷，或者其它非天然嘧啶核苷，G*是2'-脱氧-7-脱氮鸟苷、2'-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2'-脱氧-2'-取代-阿糖鸟苷、2' -O-取代-阿糖鸟苷、 2/ -脱氧肌苷或其它非天然嘌呤核苷，而且P是核苷之间的连接体，其选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，结构域B是连接结构域A和C的连接体，可以是3’ -5’连接、 2’ -5’连接、3’ -3’连接、磷酸基团、核苷，或者非核苷连接体，所述的非核苷连接体可以是脂肪族的、芳香族的、芳基的、环状的，手性的、非手性的，可以是肽，碳水化合物、脂类、脂肪酸、单_、三_、六聚乙二醇，或者杂环部分，并且结构域C可以是5’-3’或3’-5’、2’-5’DNA、 RNA> RNA-DNA, DNA-RNA Poly I-Poly C,它们具有或不具有回文序列或自我互补序列，该序列可以有或没有二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，C*pG, C*pG*或CpG%其中，C是胞苷或2’-脱氧胞苷，G是鸟苷或是2’-脱氧鸟苷，Cf是2'-脱氧胸苷，1_(2'-脱氧_β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤，2’ -双脱氧-5-齒代胞苷，2’ -双脱氧-5-硝基胞苷，阿糖胞苷，2'-脱氧-2'-取代阿糖胞苷，2' -O-取代阿糖胞苷，2'-脱氧-5-羟基胞苷，2'-脱氧-Ν4-烷基-胞苷，2'-脱氧-4-硫代尿苷，或者其它非天然嘧啶核苷，G* 是2' _脱氧-7-脱氮鸟苷,2' _脱氧-6-硫代鸟苷,阿糖鸟苷,2' _脱氧-2' _取代-阿糖鸟苷，2' -O-取代-阿糖鸟苷，2'-脱氧肌苷，或其它非天然嘌呤核苷，P是核苷之间的连接体，其选自磷酸二酯或硫代磷酸酯。
19.权利要求18的免疫刺激性核酸，其具有选自SEQID NOS :1_38的序列。
20.权利要求18的免疫刺激性核酸，其具有选自SEQID NOS 39-68的序列。
全文摘要
本发明涉及稳定的免疫调节寡核苷酸。本发明提供了免疫刺激性核苷酸，其含有至少一个CpG二核苷酸和一个在5’-或3’-端的二级结构。这些寡核苷酸具有降低或增强免疫刺激性的特性。本发明确定了5’-端二级结构比3’-端二级结构更显著地影响免疫刺激活性。本发明也提供了增高或降低含有CpG的核酸的免疫刺激活性的方法。
文档编号A01N43/04GK102604957SQ20121001522
公开日2012年7月25日 申请日期2004年6月10日 优先权日2003年6月11日
发明者埃坎巴.R.坎迪马拉, 拉克什米.巴加特, 萨德希尔.阿格拉沃尔, 郁东, 雷詹德拉.K.潘德伊 申请人:艾德拉药物股份有限公司