专利名称：干扰ev71病毒的新靶点及其小干扰rna和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于EV71病毒复制抑制技术领域，涉及干扰EV71病毒的新靶点及其小干扰RNA和应用。
背景技术：
肠道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒属成员，其感染性强，致病性高，已经在世界范围内有过十几次大的爆发和流行，且引起越来越严重的中枢神经系统症状，严重危害婴幼儿的生命健康，被喻为21世纪的脊髓灰质炎。目前临床缺乏抑制病毒的特异性药物，寻求新的药物治疗手段已成为世界范围内关注的热点。病毒为严格活细胞内寄生的微生物，故抗病毒药物必须进入细胞，并能选择性作用于病毒，但实际上，病毒的复制过程与宿主细胞的生物合成过程相似，两者难以区分，故很难获得能杀死或抑制病毒而又不影响细胞的药物。·RNA干扰技术的出现对选择毒性提出了可能，为抗病毒研究提供了新思路。RNA干扰是RNA序列特异性转录后基因沉默现象。由小干扰RNA(small interfering RNA, si RNA)的反义链指导形成的RNA介导的沉默复合物在siRNA引导下与互补的mRNA结合，降解靶基因mRNA，有效特异性的抑制靶基因的表达。与以往抗病毒治疗的手段相比，RNA干扰技术具有显著的优势RNA干扰介导的抗病毒效应具有高度的特异性，对非同源基因表达几乎没有影响，因此可将不良反应降到最小；RNA干扰能高效抑制病毒复制，少量的siRNA就可达到降低病毒表达产物的作用；RNA干扰可以针对病毒基因组保守区域发挥作用，从而在一定程度上限制了病毒产生逃避突变株的能力。因此，RNA干扰所具有的对靶基因沉默作用特异性、高效性、稳定性以及不改变宿主基因组等特性，为RNA干扰在抗病毒治疗中的应用提供了可能，并决定了其用于治疗疾病时可以出现药效强、不良反应小的特性。设计合成靶向EV71病毒基因组的siRNAs将可能成为抑制EV71病毒感染的有效途径。EV71病毒基因组是由约7408个核苷酸组成的单股正链RNA，基因组RNA也是翻译前蛋白的mRNA模板，因此特别适合RNA干扰的治疗。选择合适的siRNA靶点是抗病毒治疗关键一步。在RNA干扰治疗EV71病毒的国内外研究中，几个实验室使用RNA干扰有效地阻止了病毒的复制，报道了 EV71病毒基因组中VP1、3D、3C、2C、3’ -非翻译区的有效靶序列。
发明内容
本发明解决的问题在于提供干扰EV71病毒的新靶点及其小干扰RNA和应用，在EV71病毒基因组保守的5’-非翻译区寻找出新的靶点，并针对该靶点设计小干扰RNA，可应用于EV71病毒复制的抑制。本发明是通过以下技术方案来实现用于干扰EV71病毒复制的靶点，包括下列区域EV71病毒基因组5’ -非翻译区的第115 133nt的区域；EV71病毒基因组5’ -非翻译区的第648 666nt的区域。
所述的用于干扰EV71病毒复制的靶点，其特征在于，所述的第115 133nt的核苷酸序列为cagcaaacca cgatcaata ;所述的第648 666nt的核苷酸序列为cagagcaattgtttaccta。所述的用于干扰EV71病毒复制的靶点作为设计小干扰RNA所针对的靶点的应用。所述小干扰RNA用于抑制EV71病毒复制，包括针对两个区域其中之一小干扰RNA或者为两者的混合。一种干扰EV71病毒复制的小干扰RNA，包括正义链和反义链，其正义链序列为cagcaaacca cgaucaauat t,反义链序列为uauugaucgu gguuugcugt t ；或者其正义链序列为cagagcaauu guuuaccuat t,反义链序列为uagguaaacaauugcucugt t。所述的干扰EV71病毒复制的小干扰RNA对抑制EV71病毒复制的应用。 所述的干扰EV71病毒复制的小干扰RNA在制备抑制EV71病毒复制的药物的制备的应用。所述的干扰EV71病毒复制的小干扰RNA是在经过修饰或结合于转运载体之后应用于抑制EV71病毒复制的药物的制备，所述的修饰包括核糖修饰、磷酸骨架修饰、碱基修饰；所述的转运载体包括细胞穿透性多肽、细胞靶向性配体、纳米颗粒。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明提供的用于干扰EV71病毒复制的靶点，是EV71病毒基因组5’ -非翻译区的两个新的有效靶点，由于5’ -非翻译区在病毒复制中的重要性和其高度保守的特性，使其可能具有更广谱及有效的抗病毒作用，而且5’ -非翻译区靶点的提供及针对其设计的小干扰RNA，使得与针对基因组编码区设计的其他有效siRNAs联合应用抑制可能存在的病毒新的突变株或多株EV71成为可能。进一步，本发明针对两个新的靶点分别提供了小干扰RNA，转染到EV71敏感的RD细胞后，接种EV71病毒，于感染后不同时间点倒置显微镜观察细胞病变，结果表明两对靶向EV71病毒基因组5’ -非翻译区的siRNAs能够延缓及减轻EV71病毒感染致细胞病变效应(Cytopathic effect, CPE)。同时这两对小干扰RNA能够显著降低感染细胞EV71 mRNA的转录水平，能够显著降低感染细胞释放子代病毒。另外，随着siRNA转染浓度的增加，抑制EV71病毒感染和复制作用逐渐增强。针对所提供的新的靶点设计的siRNAs能够抑制EV71病毒的复制，既表明了所筛选的靶点的有效性又表明了所设计的siRNAs具有针对病毒基因组的分子治疗的前景，而且所设计的小干扰RNA具有高效、特异、低毒及具有量效关系的特性，从而可应用于抑制病毒复制的药物的制备。当然也不排除针对所提供的靶点进行RNA干扰，设计出其他形式的siRNA或shRNA等对抑制病毒所具有的效果。
图I是荧光及流式细胞仪检测不同浓度的siRNA的转染。图2是siRNA对培养细胞的毒性分析图。图3是siRNA对EV71病毒感染致CPE的抑制作用。
图4是siRNA对感染细胞EV71 mRNA的转录水平影响。图5-1是siRNA对EV71感染细胞上清空斑形成的影响；图5-2是不同浓度siRNA对EV71感染细胞上清病毒滴度的影响。
具体实施例方式下面结合具体的实施方式对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。I、细胞培养和病毒株来源人横纹肌肉瘤细胞(Rhabdomyosarcoma，RD)为EV71敏感的宿主细胞，由西安市疾病控制中心惠赠，常规生长在含10%胎牛血清(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)的DMEM 培养基中。EV71病毒株来自临床分离样本(GenBank accession No. HM003207. I),由西安市疾病控制中心惠赠，病毒在RD细胞上增殖，-80°C保存。2、靶向EV71病毒基因组5’ -非翻译区的siRNA序列的设计选择合适的siRNA靶点是抗病毒治疗关键一步。EV71病毒基因组中5’ -非翻译区含有约742个核苷酸(其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示)，它通常折叠成多个特异性的空间结构，这些结构通过与宿主细胞蛋白因子的结合在起始病毒基因组mRNA的合成以及病毒蛋白翻译过程中发挥重要作用。此外，5’ -非翻译区还涉及病毒基因的宿主范围以及毒力等多个方面的功能。尤其重要的是，5’ -非翻译区在不同的EV71病毒株中高度保守。鉴于5’ -非翻译区的保守性及在病毒复制中的重要作用，针对5’ -非翻译区的siRNAs可能具有更广谱及有效的抗病毒作用，故以5’ -非翻译区作为靶点的筛选区域。另外，EV71病毒感染周期短，RNA干扰不必要长期发生作用，以免发生非特异性不利影响，化学合成的siRNA用于抑制EV71病毒复制是一个很好的策略，且siRNA简单，适合进一步化学修饰应用于体内。靶向EV71病毒基因组5’ -非翻译区的siRNA序列设计综合考虑RNA靶点可行性、双链siRNA热力学特性、siRNA设计原则等，应用siRNA设计软件及二级结构预测软件(http://sfold. wadsworth. org/cgi-bin/sirna.pi and http://www. genebee. msu.su/services/na2_reduced. html),同时考虑针对 HM003207. I 设计的 siRNA 与 GenBank 数据库中近5年来发布的具有全基因序列的中国流行的EV71病毒株对应序列的核苷酸同源性，应用DNAStar program进行比对,筛选出EV71基因组5’ -非翻译区的两个祀点区域EV71病毒基因组5’ -非翻译区的第115 133nt的区域；EV71病毒基因组5’ -非翻译区的第648 666nt的区域。并分别针对这两个区域合成两对siRNA (siRNA-U siRNA_2)，其中siRNA_l针对第115 133nt的区域,其双链序列如下正义链序列为 :cagcaaacca cgaucaauat t，反义链序列为uauugaucgugguuugcugt t ;siRNA_2 针对第 648 666nt 的区域，其双链序列如下正义链序列为cagagcaauu guuuaccuat t,反义链序列为 uagguaaaca auugcucugt t ；
将siRNA-2序列打乱,设计scrambled-siRNA(scr)作为阴性对照。同时将siRNA_2进行FAM标记(si-2FAM)了解转染情况,优化转染条件。所有siRNAs均用BLAST (www. ncbi.nlm. nih. gov/BLAST)确认其特异性，排除与人及鼠基因的同源性。上述所有的siRNAs均按序列合成，具体委托上海吉玛制药技术有限公司合成。3、SiRNA转染RD细胞条件的优化利用荧光检测及流式细胞仪分析技术，以带有FAM标记的si_2FAM来了解转染情况，优化转染条件，测定转染效率。RD细胞以细胞数为3. 2 X IO5/孔接种于6孔板，24小时后待细胞生长达70 80%时进行 siRNA 的转染。将不同浓度(25、50、100nM)的 si_2FAM 和 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)转染 RD 细胞，具体操作按 Lipofectamine 2000 使用说明书进行。另外设仅用si-2FAM处理，未加入Lipofectamine 2000的RD细胞作为对照。 在siRNA转染后5h，换2%胎牛血清的DMEM培养基，转染后6h细胞用PBS洗两次，荧光显微镜观察si-2FAM的位置及浓度不同所引起的荧光变化。荧光观察完成后，用0. 25%胰酶消化RD细胞，制备单细胞悬液，0. 5ml固定液固定后流式细胞仪检测荧光标记细胞的比例以精确测定转染效率。结果表明，转染后6h，FAM标记的si_2FAM在RD细胞浆中可见，随着si_2FAM浓度的增加，si-2FAM在RD细胞中的量相应增加；而未加入Lipofectamine 2000，仅用si_2FAM处理的对照组未观察到荧光(荧光观察结果如图I中的A部分所示)。这表明在无转染试剂的存在下siRNA不能单独转染到RD细胞中，siRNA成功转染到RD细胞需要转染试剂的参与。流式细胞仪检测结果如图I中的B部分所示，RD细胞转染25nM、50nM、IOOnM的si-2FAM,转染效率分别为 79. 47±1. 79%,87. 73±2. 67%,97. 17±0. 86%。故选择 50nM 和IOOnM siRNA 用于 RNA 干扰。4、siRNA对培养细胞的毒性RD细胞以细胞数为I. 6 X IO4/孔接种于96孔板，24h后待细胞生长达70 80%时转染IOOnM浓度的siRNA-1、siRNA-2，转染后24h、48h、72h显微镜下观察RD细胞的形态学变化，然后每孔加入 MTT 溶液(5mg/ml; Sigma, St. Louis, Mo, USA) 20ul, 37°C孵育 4h 后,小心吸弃孔内上清，每孔加入150ulDMS0，振荡lOmin，选择570nm波长检测吸光值。MTT法检测吸光值，结果如图2所示，在不同的时间点(24h、48h、72h)，两对靶向EV71病毒基因组5’ -非翻译区的siRNAs转染组MTT检测获得的吸光值均与未转染siRNA的对照组(mock)没有明显差别，表明siRNA转染组的活细胞数与未转染siRNA的mock组没有明显差别，即高剂量的siRNA未影响细胞的生长及生存，对培养细胞无明显毒性。5、SiRNA转染和病毒感染RD细胞于37°C，5%C02培养箱中培养至80%_90%，胰酶消化后加含10%胎牛血清、无抗生素的DMEM培养基，以细胞数为8 X IO4/孔接种于24孔板，24小时后待细胞生长达70 80%时进行转染。转染前将培养基换为500ml Opti-MElVf' (Gibco BRL, Grand Island, NY，USA)，然后不同量的siRNA (30pmol、60pmol)分别稀释于50ul的Opti-IVIEIVTv，在另一只试管中Iul的Lipofectamine 2000也稀释于50ul的Opti-MEMK'中，室温下孵育5分钟后，将两种溶液轻轻混合，室温下孵育20分钟,使siRNA:LipofectamineTM2000复合物形成,后每孔加IOOul的混合物，通过轻柔前后摇晃培养板混和摇均，使最终siRNA的浓度为50nM或lOOnM。scr 组转染 scrambled-siRNA。mock 组除未加 siRNA,—切同前。转染后5h，每孔接种EV71病毒稀释液(MOI=O. 01)，吸附I小时后弃病毒稀释液，加入500ul含2%胎牛血清的DMEM培养基，置于培养箱中，于感染后不同时间点连续观察细胞病变，注意有无胞体圆缩、折光特性改变、间隙明显、聚集、脱落等病毒感染特征。收集细胞裂解物及上清，-80°C保存备检。感染后24小时，未转染SiRNA的mock组细胞及scr转染组细胞出现CPE，表现为细胞圆缩、折光度增强；siRNA-l、siRNA-2转染组细胞未出现CPE。感染后36小时，50nM浓度的siRNA-1转染组细胞表现出轻微的CPE。感染后48小时的观察结果如图3所示，IOOnM的siRNA-1、siRNA-2转染组细胞表现出减轻或轻微的CPE，而mock组细胞及scr转染组细胞出现完全的CPE，表现为细胞圆缩、折光度增强、间隙明显、聚集、脱落。siRNA-1能够延缓EV71病毒感染致CPE至感染后36小时。siRNA_2能够延缓EV71·病毒感染致CPE至感染后48小时。两对靶向EV71病毒基因组5’-非翻译区的siRNAs作用持续时间均达感染后72小时。siRNA-2对EV71病毒感染致CPE的抑制作用强于siRNA-1。另外，随着siRNA转染浓度的增加，EV71病毒感染致CPE明显减轻。两对靶向EV71病毒基因组5’ -非翻译区的siRNA能够延缓及减轻EV71病毒感染致CPE。6、siRNA对感染细胞EV71mRNA的转录水平影响6. IRNA的提取及定量EV71感染后36h，24孔板中各组细胞用PBS洗后，每孔加入150ulCelLytic MCell Lysis Reagent (Sigma, St. Louis, Mo, USA),收集样本后米用Ql Aamplv Viral RNAMini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)提取病毒 RNA。具体操作如下a、吸取 560ul 含有carrier RNA的buffer AVL至1.5ml离心管中；b、将离心后样本加入至装有bufferAVL-carrier RNA的离心管中，充分混匀，室温(15°C _25°C)放置lOmin，后瞬时离心；c、样本中加入560ul无水乙醇，充分混匀，后瞬时离心；d、吸取630ul上步中的液体小心的加入到column (已放入2ml收集管中),盖上盖子，8000rpm离心lmin,将column放入新的2ml收集管中，弃去旧的收集管；e、小心打开column的盖子,重复第6步；f、小心打开column的盖子，加入500ul buffer AWl,盖上盖子,8000rpm离心lmin,将column放入新的2ml收集管中，弃去旧的收集管；g、小心打开column的盖子,加入500ul buffer AW2,盖上盖子，14000rpm离心3min ;h、将column放入新的2ml收集管中，弃去旧的收集管，14000rpm离心lmin ;i、将column放入I. 5ml离心管中，弃去旧的收集管,小心的打开column,加入60ul室温的buffer AVE,盖上盖子，室温放置lmin，8000rpm离心lmin洗脱病毒RNA。RNA定量时将提取的RNA用DEPC处理水进行稀释，紫外分光光度仪测定0D260、0D280值，计算RNA浓度。6. 2逆转录、PCR扩增米用肠道病毒71型核酸扩增检测试剂盒(Suoao BiomedtechCo. Ltd. , Beijing, China)进行逆转录及 PCR 扩增。试剂盒中包含
上游引物5'-GCAGCCCAAAAGAACTTCACT-3' (2366-2386)下游引物5'-ATCTGCCACCCTATCTCCCT-3' (2436-2455)及TaqMan probe 5 ' -FAM-TGCAAGGATGCTAGTGATATCCTGC-TAMRA-3，(2396-2420)。根据说明书，向反应管中每管加入7ul EV71-RT MIX、2ul RNA、lul逆转录酶，IOOOOrpm瞬时离心30秒，将各反应管放入PCR仪器的反应槽中，在PCR仪上进行以下逆转录操作42°C 30min,后98°C 5min灭活逆转录酶。接下来进行PCR扩增。向反应管中每管加入20ul EV71-PCR MIX、2ul Taq酶系、3ul处理后样本或10倍系列稀释EV71-阳性定量标准品，IOOOOrpm瞬时离心30秒，将各反应管放入PCR仪器的反应槽中，循环条件94°C 2min,后93°C 30s, 55°C 45s, 40个循环。利用10倍系列稀释EV71-阳性定量标准品建立的标准曲线定量EV71 RNA。50nM、IOOnM浓度的siRNA-1转染组与未转染siRNA的mock组相比，感染细胞EV71 RNA 水平为 29. 72±1. 72%、17. 64±2. 03% (图 4)。50nM、IOOnM 浓度的 siRNA-2 转染组与mock 组相比，感染细胞 EV71 RNA 水平仅为 16. 84±2. 30%、6. 80± I. 04% (图 4)。siRNA-2抑制感染细胞EV71 RNA的作用优于siRNA-1 (图4)。随着siRNA转染浓度的增加，感染细胞EV71RNA水平明显下降(#p〈0. 05)(图4)。两对靶向EV71病毒基因组5’-非翻译区的siRNA能够显著降低感染细胞EV71 mRNA的转录水平(± p<0. 05)(图4)。7、空斑形成实验
为了解SiRNA介导的细胞内抑制EV71病毒的复制是否影响子代病毒的释放，病毒感染48小时后收集各组细胞上清，稀释至10_4进行空斑形成实验，测定病毒滴度。RD细胞在6孔板中生长成单层，每孔加入500ul稀释至10_4的各组细胞上清，吸附I小时后弃孔内稀释液，每孔加入3ml含1%甲基纤维素的DMEM维持液，37°C培养3天后小心吸弃孔内液体，福尔马林固定后，1%结晶紫溶液染色，计数空斑。siRNA-l、siRNA_2转染组与未转染SiRNA的mock组相比，能够明显减少空斑形成，而且siRNA-2作用优于siRNA-1，结果如图5_1所示。随着siRNA转染浓度的增加，病毒滴度降低(#P〈0. 05)，两对靶向EV71病毒基因组5’ -非翻译区的siRNAs能够减少感染细胞释放子代病毒，抑制空斑形成，显著降低感染细胞上清病毒滴度(* P<0. 05)，结果如图5-2所示。空斑形成实验结果与siRNAs对感染细胞EV71 mRNA的转录水平影响一致。鉴于上述两对siRNAs均能够延缓及减轻EV71病毒所致CPE，能够降低EV71病毒mRNA的转录水平以及减少感染细胞释放子代病毒，抑制病毒的复制，表现出抗病毒作用，那么这两对siRNAs就能够应用于抑制EV71病毒复制、尤其是应用于抑制EV71病毒复制的药物的制备。考虑到药物的制备时制剂的要求，进一步在保留其序列的特异性的基础上对siRNAs进行修饰或结合于转运载体,通过不同形式的修饰或转运达到提高siRNA的稳定性、减少脱靶效应以及免疫刺激反应、提高SiRNA的转运效率，产生更稳定和更强的RNA干扰效果，更好的应用于体内。一般来讲，所述的修饰包括核糖修饰、磷酸骨架修饰、碱基修饰；所述的转运载体包括细胞穿透性多肽、细胞靶向性配体、纳米颗粒。具体的修饰方式或转运载体的选择可根据制剂的要求或效果来确定。进一步，出于对病毒多靶点干扰的考虑，在制备抑制EV71病毒复制的药物时是将siRNA-1、siRNA-2混合，从而达到更广谱的病毒干扰作用。
在上述两对siRNAs对抑制EV71病毒所表现的作用下，由于5’ -非翻译区在病毒复制中的重要性和其高度保守的特性，那么其所针对的两个靶点区域就成为了干扰EV71病毒复制的有效的靶点。
权利要求
1.用于干扰EV71病毒复制的靶点，其特征在于，包括下列区域 EV71病毒基因组5’ -非翻译区的第115 133nt的区域； EV71病毒基因组5’ -非翻译区的第648 666nt的区域。
2.如权利要求I所述的用于干扰EV71病毒复制的靶点，其特征在于，所述的第115 133nt的核苷酸序列为cagcaaacca cgatcaata ;所述的第648 666nt的核苷酸序列为cagagcaatt gtttaccta。
3.权利要求I所述的用于干扰EV71病毒复制的靶点作为设计小干扰RNA所针对的靶点的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述小干扰RNA用于抑制EV71病毒复制，包括针对两个区域其中之一小干扰RNA或者为两者的混合。
5.一种干扰EV71病毒复制的小干扰RNA，其特征在于，包括正义链和反义链，其正义链序列为cagcaaacca cgaucaauat t,反义链序列为uauugaucgu gguuugcugt t ； 或者其正义链序列为cagagcaauu guuuaccuat t,反义链序列为uagguaaacaauugcucugt t。
6.权利要求5所述的干扰EV71病毒复制的小干扰RNA对抑制EV71病毒复制的应用。
7.权利要求5所述的干扰EV71病毒复制的小干扰RNA在制备抑制EV71病毒复制的药物的制备的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的干扰EV71病毒复制的小干扰RNA是在经过修饰或结合于转运载体之后应用于抑制EV71病毒复制的药物的制备，所述的修饰包括核糖修饰、磷酸骨架修饰、碱基修饰；所述的转运载体包括细胞穿透性多肽、细胞靶向性配体、纳米颗粒。
全文摘要
本发明公开了干扰EV71病毒的新靶点及其小干扰RNA和应用，所述的靶点包括下列区域EV71病毒基因组的5’-非翻译区的第115～133nt的区域；EV71病毒基因组的5’-非翻译区的第648～666nt的区域。针对两个新的靶点分别提供了小干扰RNA，对其转染到RD细胞后，接种EV71病毒，于感染后不同时间点倒置显微镜观察细胞病变，结果表明两对靶向EV71基因组5’-非翻译区的siRNAs能够延缓及减轻EV71感染致CPE。由于5’-非翻译区在病毒复制当中的必要性和其高度保守的特性，使得该对靶点具有更广谱及有效的抗病毒作用。
文档编号C12N15/11GK102796734SQ20121016238
公开日2012年11月28日 申请日期2012年5月23日 优先权日2012年5月23日
发明者张国成, 邓军霞, 徐志凯, 雷迎峰, 聂晓晶, 许东亮 申请人:中国人民解放军第四军医大学