一种调控肿瘤细胞转移的新靶点及其应用
【专利摘要】本发明提供一种调控肿瘤细胞转移的新靶点及其应用，所述应用是针对DcR3的抑制剂在制备降低或消除肿瘤细胞转移的药物中的应用。本发明揭示DcR3调控肿瘤转移的新机制，进而明确了DcR3可作为抗肿瘤迁移靶点；本发明研究表明DcR3可以调控EMT发生过程中一个至关重要的分子E?钙黏着蛋白的表达，促进肿瘤细胞骨架重塑，进而促进了肿瘤细胞的迁移。总体而言，本发明所述应用可降低或减轻恶性肿瘤转移，从而起到了提高肿瘤治疗效果的作用。
【专利说明】
-种调控肿瘤细胞转移的新卽点及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学和肿瘤防治领域，更具体而言，本发明设及预测、诊断和治 疗肿瘤细胞转移领域。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是危害人类健康的一类疾病，化疗是目前治疗恶性肿瘤的主要手段之 一。然而，恶性肿瘤转移往往导致肿瘤化疗失败。因此，对恶性肿瘤转移发生机制的研究和 寻找开发降低或消除恶性肿瘤转移的药物是当前肿瘤防治研究领域的重点和难点。
[0003] 肿瘤细胞的转移是一个极其复杂过程，例如包括细胞外基质化MC)的降解和细胞 移动，癌细胞的浸润和转移过程中会遇到一系列的组织迸屏障，运些屏障的ECM由基底膜及 间质基质所组成，其主要成分包括：各型胶原、层粘蛋白（laminin, Ln)、纤维连接蛋白 (fibronectin.F'n)、弹力蛋白（elastin)及蛋白聚糖（proteoglycans)等，肿瘤细胞通过其 表面受体与ECM成分粘附后激活和释出各种蛋白溶解酶来降解(degradation)基质成分，为 肿瘤细胞的移动形成通道。另外，肿瘤细胞能对多种不同的刺激物起反应而移动，包括肿瘤 细胞本身分秘的因子（自分泌移动因子）、宿主细胞分泌的因子(旁分泌移动因子)及ECM的 成分等。此外，上皮细胞向间质细胞转移(EMT)过程在原发性浸润和继发性转移中起着重要 的作用，因而，研究EMT的发生和调控机制，对于寻找预防、诊断和治疗恶性肿瘤特别是肿瘤 细胞的转移有重要意义。
[0004] DcR3是一种诱骗雙体，也是一种特殊的细胞调亡抑制剂，能和肿瘤坏死因子超家 族成员化S配体、LIGHTW及化1A相结合，对它们介导的细胞调亡起负调控作用，如下图1所 示，DcR3可与化S配体、LIGHTW及化1A相结合，抑制其诱导调亡的信号通路，在肿瘤免疫、自 身免疫、移植免疫和抗病毒免疫中发挥着重要的作用化in WW，Hsieh SL.Decoy receptor 3:A pleiotropic immunomodulator and biomarker for inflammatory diseases， autoimmune diseases and cancer .Biochem Pharmacol ,2011，81:838-847.)。已有石开究表 明，DcR3在多种肿瘤组织和自身免疫病中高表达，现有技术对其抑制肿瘤细胞调亡的原理 研究的比较深入，研究结果表明化R3主要是通过"诱骗"功能竞争结合其相应配体，抑制肿 瘤细胞的正常调亡。然而，关于DcR3在细胞粘附和细胞迁移，尤其是其与肿瘤转移方面的机 制作用所知甚少。
[0005] 为了降低或消除肿瘤细胞的转移，提高化疗效果，本领域需要通过多种方式研究 肿瘤细胞转移的机制，肿瘤细胞转移的关键基因祀点，并根据运些祀点设计治疗降低或消 除肿瘤细胞转移的新药。
【发明内容】
[0006] 本发明的主要目的在于寻找肿瘤转移的新祀点，研究该祀点的在肿瘤转移方面的 机制作用，W更好地提高治疗肿瘤的效果。
[0007] 本发明掲示了 DcR3是调控肿瘤细胞转移的新祀点，具体地，本发明研究表明DcR3 可W调控EMT发生过程中一个至关重要的分子E-巧黏着蛋白化-ca化erin)的表达，促进肿 瘤细胞骨架重塑，进而促进了肿瘤细胞的迁移。
[0008] 发明人在研究中发现体外培养的肿瘤细胞在化R3处理的条件下，细胞形态和细胞 骨架发生了明显的变化，细胞生成大量的突触。在发现DcR3处理可W影响细胞形态和细胞 骨架的前提条件下，发明人进一步检测了 EMT标志分子E-ca化erin的表达变化，实验结果表 明，DcR3的处理可W明显降低化pG2细胞中E-ca化erin mRNA和蛋白水平的表达;此外，发明 人进一步向细胞中转染表达化R3的质粒进行检测，同样发现化R3的表达可W降低细胞内E- ca化erin的表达，上述结果提示化R3是一个促进肿瘤细胞EMT发生的因子。
[0009] 此外，本发明通过免疫组化检测了病人肝脏组织中DcR3的表达情况，结果显示同 正常肝组织相比，肝癌患者的肝脏组织中化R3的表达明显升高，提示化R3是肿瘤相关抗原。 为了验证体内DcR3与E-ca化erin表达确实存在相反的关系，发明人检测了肝脏组织当中E- ca化erin的表达，结果显示同正常肝脏组织相比，肝癌组织当中E-ca化erin的表达明显下 调。上述结果进一步证实了化R3调控E-ca化er in表达的可行性。
[0010]进一步地，发明人探索了DcR3敲低的情况下肿瘤细胞的迁移能力，Wound healing 实验结果表明，DcR3的处理可W明显增强化pG2肿瘤细胞的迁移能力；同时化answell实验 表明化R3的降低可W明显抑制HepG2肿瘤细胞的迁移。
[0011] 从而，一方面，本发明提供了一种针对DcR3的抑制剂在制备降低或消除肿瘤细胞 转移的药物中的应用。
[0012] 作为一【具体实施方式】，本发明的所述应用是指针对化R3的抑制剂在制备通过升高 E-巧黏着蛋白化-cadherin)来降低或消除肿瘤细胞转移的药物中的应用。
[0013] 作为一【具体实施方式】，本发明的所述应用是指针对化R3的抑制剂在制备通过升高 EMT过程中E-巧黏着蛋白化-ca化erin)来降低或消除肿瘤细胞转移的药物中的应用。
[0014] 本发明中所述针对化R3的括抗剂为任何可降低化R3的表达水平和/或括抗DcR3作 用的试剂。具有运样功能的试剂例如可包括例如抗化R3的抗体、针对化R3编码序列的RNA干 扰分子或反义寡核巧酸、小分子抑制剂、siRNA。运样的试剂对于本领域技术人员而言可根 据现有技术获得，可W是现有技术中已知的任何可降低DcR3的表达水平和/或括抗DcR3作 用的括抗剂本身，也可是基于该分子式进行修饰、改构后仍具有降低化R3的表达水平和/或 括抗DcR3作用的功能的试剂。在本发明的一具体实施方案，所述针对DcR3的括抗剂为抗 DcR3的抗体，例如，该抗体为人DCR3/TNFRSF6B抗体化uman DCR3/TNFRSF6B Antibody，可商 够自R&D systems);所述siRNA的正义链的序列如SEQ ID N0:5所示，反义链的序列如SEQ ID NO:6所示。
[0015] 作为一【具体实施方式】，在本发明前述应用中，所述肿瘤选自肝癌、乳腺癌、胶质瘤、 结肠癌、子宫颈癌、肺癌、膜腺癌、胃癌或膀脫癌，优选肝癌。
[0016] 另一方面，本发明提供一种降低或消除肿瘤细胞转移的SiRNA,所述SiRNA的正义 链的序列如SEQ ID NO:5所示，反义链的序列如SEQ ID NO:6所示。
[0017] 另一方面，本发明提供一种降低或消除肿瘤细胞转移的药物组合物，其中，该药物 组合物包含有效剂量的本发明所述的SiRNA。
[0018] 另一方面，本发明提供一种抑制肿瘤细胞EMT的方法，所述方法包括调控DcR3祀 点，所述调控化R3祀点包括降低化R3的表达水平和/或括抗化R3作用的途径。
[0019] 另一方面，本发明提供升高肿瘤细胞中E-巧黏着蛋白化-cadherin)的方法，所述 方法包括调控化R3祀点，所述调控化R3祀点包括降低化R3的表达水平和/或括抗DcR3作用 的途径。
[0020] 另一方面，本发明还提供一种筛选降低或消除肿瘤细胞转移药物的方法，所述方 法包括：
[0021] (a)提供表达DcR3的肿瘤细胞系、肿瘤培养物或荷肿瘤动物；
[0022] (b)将候选药物与步骤(a)中提供的肿瘤细胞系、肿瘤培养物或荷肿瘤动物接触， 作为给药组；
[0023] (C)检测给药组中E-巧黏着蛋白化-cadherin)的表达水平，并与未给予候选药物 的对照肿瘤细胞系、肿瘤培养物或荷肿瘤动物中的E-巧黏着蛋白化-ca化erin)的表达水平 进行比较；
[0024] 如果检测结果显示，给药组的E-巧黏着蛋白化-ca化erin)的表达水平高于对照 组，则表明该候选化合物为降低或消除肿瘤细胞的治疗药物。
[0025] 本发所述"高于"通常是指与对照组相比，给药组实验结果具有显著性差异。
[0026] 作为本发明筛选方法的【具体实施方式】，所述肿瘤选自肝癌、乳腺癌、胶质瘤、结肠 癌、子宫颈癌、肺癌、膜腺癌、胃癌或膀脫癌。优选地，所述肿瘤为肝癌。
[0027] 本发明的有益效果：
[0028] (1)本发明掲示DcR3调控肿瘤转移的新机制，进而明确了化R3可作为抗肿瘤迁移 祀点。具体地，本发明研究表明DcR3可W调控EMT发生过程中一个至关重要的分子E- ca化erin的表达，促进肿瘤细胞骨架重塑，进而促进了肿瘤细胞的迁移。
[0029] (2)提供了通过抑制化R3及其相关信号传导途径来降低或减轻恶性肿瘤转移的新 方法，从而起到了提高肿瘤治疗效果的作用。
【附图说明】
[0030] 图1为化R3与化S配体、LIGHTW及化1A相结合抑制其诱导调亡的信号通路的示意 图。
[0031] 图2为化R3抑制化pG2细胞聚集生长图。
[0032] 图3为化R3导致细胞骨架形态的变化图。
[0033] 图4为化R3促进肿瘤细胞化pG2细胞骨架变化图。
[0034] 图5为化R3的刺激降低E-ca化erin mRNA的表达实验结果图。
[0035] 图6为化R3的刺激降低E-ca化erin蛋白水平的表达实验结果图。
[0036] 图7为化R3的表达降低E-ca化erin蛋白水平的表达实验结果图。
[0037] 图8为正常组织和肝癌组织中化R3的表达对照图。
[0038] 图9为正常组织和肝癌组织当中E-ca化erin的表达对照图。
[0039] 图10 DcR3促进肿瘤细胞的迁移(wound healing assay)实验结果图。
[0040] 图11为化R3的减少抑制肿瘤细胞的迁移化answell实验结果整体图。
[0041 ] 图12为Transwell实验检测化R3对细胞迁移的影响实验局部放大图片。
【具体实施方式】
[0042] 为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施 例及附图对本发明的技术方案进行W下详细说明，应理解运些实例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验 方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
[0043] 实施例1
[0044] (1)体外培养实验
[0045] 本实施例W高糖DMEM(g化ico)+10%FBS(hyclone)为培养基，在6孔板中37°C，5% 0)2体外培养Ξ组化pG2肿瘤细胞72h，其中细胞密度为1 X 105/孔，一组不处理，另外两组分 别向培养基中加入终浓度为化g/ml的I gG巧日化R3-FC。所得结果如图2所示，实验结果表明， 体外培养的肿瘤细胞在DcR3处理的条件下，细胞形态和细胞骨架发生了明显的变化。在细 胞密度较稀的情况下，经过72小时的培养，对照组(不处理组和加 IgGl组)细胞紧凑的结合 在一起形成克隆聚集生长，然而化R3(3μg/ml)处理组的细胞明显变得松散，分散生长，同时 细胞形态和骨架出现明显的变化，细胞生成大量的突触(protrusion),如图3所示，图3中显 示化R3-FC处理组细胞边缘生成了大量的突触，丝状伪足的结构。
[0046] 此外，采用鬼笔环肤染色培养7化后的肿瘤细胞微丝骨架，具体染色步骤为：
[0047] a.细胞爬片生长24-48小时；
[004引b.预溫PBS(37°C)清洗细胞2次，每次10分钟；
[0049 ] C. 4 %多聚甲醒室溫固定5-10分钟，PBS清洗细胞3次;注:也可用3.7%的甲醒溶液 固定，但甲醒中不能含有甲醇，因为在固定过程中甲醇可能会破坏肌动蛋白。
[0050] d.0.1 %Triton X-100/PBS室溫破膜3-5分钟，PBS清洗细胞3次;注:该步骤可W省 略，因为鬼笔环肤（Phalloidin)分子量很小，多聚甲醒固定后细胞膜产生的孔桐足W让 化alloidin进入细胞。且经化iton破膜后，鬼笔环肤(Phalloidin)可能对细胞核有非特异 性染色。
[0化1] θ.5μ1罗丹明-鬼笔环肤(化odamine-化alloidin)胆存液加入15化1 PBS中配成工 液（5μg/ml)并用W染细胞，室溫染色30-60分钟；注：1)罗丹明-鬼笔环肤（Rhodamine- Phalloidin)工作浓度范围为2-50yg/m，一般使用浓度为扣g/ml;2)为降低非特异性染色， 配制罗丹明-鬼笔环肤(化odamine-化alloidin)工作液时，可在PBS中加入1%BSA(牛血清 白蛋白）。或者在染罗丹明-鬼笔环肤(化odamine-化alloidin)前用含1%BSA的PBS液室溫 封闭细胞20-30分钟。3)为防止染色过程中液体的蒸发，最好在密闭的湿盒内进行。
[0化2] f.PBS清洗细胞3次；
[0化3] g.加入DAPI37O染色10分钟，PBS洗涂3次
[0054] h.吸去多余水分，加巧光封片液（中性或偏碱性缓冲液加等量甘油)封片，巧光或 共聚焦显微镜下观察。
[0055] 所得结果如图4所示，图4中左侧仅可见红色鬼笔环肤染色的微丝结构，中间仅可 见蓝色DAPI染色的细胞核结构，右侧既可见红色鬼笔环肤染色的微丝结构亦可见蓝色DAPI 染色的细胞核结构。实验结果同样证实了对照组（不处理组和加 IgGl组)细胞聚集生长，而 化R3-FC处理组细胞则分散生长。
[0056] (2)巧光实时定量PCR、Western Blot实验及质粒转染实验
[0057] 在上述实验发现DcR3处理可W影响细胞形态和细胞骨架的前提条件下，本实验在 上述实验的基础上通过巧光实时定量PCR和Western Blot实验(DcR3抗体购自Abeam,货号 ab8405，二抗购自中杉金桥，货号SP 9001)进一步检测了EMT标志分子E-ca化erin的表达变 化，E-ca化erin蛋白表达降低意味着EMT的发生。
[0058]巧光实时定量PCR具体实验步骤如下所述：
[0化9] a.RNA的提取
[0060] ①向6孔板每孔细胞中加入1ml TRIZ0L。
[0061] ②两相分离每1ml的TRIZ化试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动 剧烈振荡管体15秒后，15到30°C解育2到3分钟。4°C下1200化pm离屯、15分钟。
[0062] ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无 RNA酶的离屯、管中。加等体积异丙醇混合W 沉淀其中的RNA，混匀后15到30°C解育10分钟后，于4 °C下1200化pm离屯、10分钟。
[0063] ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZ0L试剂裂解的样品中加入至少1ml的75 %乙醇 (75%乙醇用DEPC肥0配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4°C下7000巧m离屯、5分钟。
[0064] ⑤RNA干燥小屯、吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空气中干燥5-10分钟。
[0065] ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无 RNA酶的水40μ1用枪反复吹打几次，使其完全 溶解，获得的RNA溶液保存于-80°C待用。
[0066] b.样品cDNA合成
[0067] ①反应体系
[0068] 反应体系如下表1所示：
[0069] 表1
[0070]
[0071 ] 表1中上下游引物购自Invitrogen，具体为：
[0072] 上游引物：TGGAGGAATTCTTGCTTTGC(沈Q ID N0:1);
[0073] 下游引物:CGTACATGTCAGCCAGCTTC(SEQ ID N0:2)。
[0074] 将表1中的组分加入到管中，轻弹管底将溶液混合，600化pm短暂离屯、。
[0075] ②混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70°C干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内 外溫度一致，然后加逆转录酶0.化1，37 °C水浴60分钟。
[0076] ③取出后立即95°C干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80°C待 用。
[0077] C.实时PCR(Real time PCR)参照TAKARA Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time) 说明书操作(货号:DRR041A)。
[0078]巧光实时定量PCR实验结果如图5所示，从图5中可看出与对照组（未处理组和加 IgGl组)相比，DcR3处理组中E-ca化erin的mRNA表达水平明显降低。
[00巧]Western Blot具体实验步骤如下所述：
[0080] a.收集蛋白样品；用RIPA裂解液裂解贴壁细胞，然后4°C，13,000g离屯、15min.取上 清液作为样品。
[0081 ] b.电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
[0082] C.转膜:电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min X 3次。
[0083] 转膜条件:300mA恒流;0.22皿孔径PVDF膜，转膜时间75min。
[0084] 封闭:将膜完全浸没封闭液中室溫轻摇60min。
[00 化]d. -抗（0。33抗体（413。日111，日68405);6-。日化61'；[]1抗体（口1'〇16；[]116。11，20874-1-4口）； tubulin抗体(Abmart))。
[0086] 解育：用TBST稀释一抗，室溫解育lOmin，放4°C过夜。第二天从4°C拿出膜，在室溫 解育30min。
[0087] 洗膜:TBST洗膜5次，每次lOmin。
[008引e.二抗解育：用5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗(根据一抗的种属选择山羊抗兔IgG化 +DHRP或山羊抗小鼠 IgG(H+L)HRP)，l:5000,室溫轻摇40min。洗膜：TBST洗膜6次，每次 ：3min。
[0089] f.曝光:E化(Thermo)加到膜上后反应2min，胶片曝光：10s-5min (曝光时间随不同 光强度而调整），显影2min，定影。惊片，扫描等后续分析。
[0090] Western Blot实验结果如图6所示，从图6中可W看出与对照组（未处理组和加 IgGl组)相比，DcR3处理组中E-ca化erin的蛋白表达水平明显降低。
[0091] 从上述巧光实时定量PCR和Western Blot实验结果可W看出，经DcR3的处理可W 明显降低化pG2细胞中E-ca化erin mRNA和蛋白水平的表达。进一步地，向细胞中转染表达 DcR3的质粒（plvχ-zs-green-DcR3)(具体实施步骤参照lipo2000(invit;rogen)说明书进行 转染），24小时后进行检测，所得结果如图7所示，从图7中可W看出与转染了空载体的对照 组相比，转染了携带DcR3基因的载体组细胞中E-ca化erin的表达量明显降低。W上结果提 示化R3是一个促进肿瘤细胞EMT发生的因子。
[0092] (3)免疫组化检测
[0093] 本实验通过免疫组化检测了病人肝脏组织中化R3的表达情况，具体的检测步骤如 下所述：
[0094] a.石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色前应置60°C 1小时）。
[00M]①二甲苯、IK切片过二甲苯两次），各10分钟。
[0096] ②梯度酒精:100%，2分钟95%，2分钟80%，2分钟70% 2分钟。
[0097] ③蒸馈水洗:5分钟，2次(置于摇床）。
[0098] b.过氧化氨封闭内源性过氧化物酶:3 %出化室溫10分钟(避光）。
[0099] C.蒸馈水洗:5分钟，2次(置于摇床）。
[0100] d.抗原修复:用抗原修复液(购自碧云天)进行抗原修复。
[0101] e.PBS:5分钟，2次(置于摇床）。
[0102] f.正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围 的水分(保持组织呈湿润状态，）滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清)处理， 37 °C，15分钟。
[0103] g.滴加第一抗体(DcR3抗体(Abcam，ab8405)):用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第 一抗体，37 °C 2小时。
[0104] h.PBS:5分钟，2次(置于摇床）。
[0105] i.滴加生物素化的二抗(中杉金桥，货号SP 9001and 5?9002)，37。(：，40分钟。
[0106] j.PBS:5分钟，2次(置于摇床）。
[0107] k.滴加立抗(SAB复合物），37°C，40分钟。
[010引 l.PBS:5分钟，2次(置于摇床）。
[0109] m.DAB显色，镜下观察，适时终止（自来水冲终止）。
[0110] η.自来水(细水)充分冲洗。
[0111] 0.苏木素复染，室溫，30秒，自来水冲洗。
[0112] Ρ.自来水冲洗返蓝，15分钟。
[0113] q.梯度酒精脱水:80%，2分钟95%，2分钟100%，2次，5分钟。
[0114] r.二甲苯透明：1,11(二甲苯)各5分钟
[0115] S.封片:加拿大树胶(或中性树胶)封片。
[0116] 免疫组化检测结果如图8(其中，获得图8所采用的第一抗体为DcR3抗体(Abeam， ab8405)所示，图8显示正常肝组织细胞化R3的表达水平很低，而肝癌组织切片中，DcR3的表 达明显升高（图8中箭头位置），提示化R3是肿瘤相关抗原。
[0117] (4)肝脏组织中E-ca化er in的检测
[0118] 为了验证体内化R3与E-ca化erin表达确实存在相反的关系，本实验采用免疫组化 实验检测了肝脏组织当中E-ca化erin的表达，具体地步骤如上述，（其中，所采用的一抗E- cadherin抗体购自proteintech，货号20874-1-AP，二抗购自中杉金桥，货号SP9002)，所得 实验结果如图9所示，图9显示正常肝组织细胞E-ca化erin存在于细胞间接触结构，而肝癌 组织切片中，E-cadherin的表达下降，同时细胞不规则，细胞间接触结构缺少明显的E- ca化erin的表达，该结果进一步证实了化R3调控E-ca化erin表达的可行性。
[0119] (5)DcR3 敲低实验
[0120] 接下来本发明进一步采用Wound healing实验探索了化R3敲低的情况下肿瘤细胞 化epG2)的迁移能力。
[0121] a.培养板接种细胞之前先用记号笔在6孔板背面画横线标记(方便拍照时定位同 一个视野）。
[0122] b.细胞消化后接入6孔板，数量W贴壁后铺满板底为宜(数量少时可培养一段时间 至铺满板底）。
[0123] C.细胞铺满板底后，用1ml枪头垂直于孔板制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度 一致。
[0124] d.吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板立次，洗去划痕产生的细胞碎片。
[01巧]e .加入完全培养基，同时分为未处理组，加 IgGl组和加化R3-FC组，使终浓度为化 g/ml，拍照记录。
[01 %] f.将培养板放入培养箱培养，48小时取出拍照。
[0127] g.根据收集图片数据分析实验结果。
[0128] 所得结果如图10所示，图10显示与未处理组和加 IgGl组相比，力阳cR3-Fc组48小时 后肿瘤细胞化巧G2)迁移明显加快，图中黑色实线显示的是迁移后细胞之间的距离。
[0129] Transwell 实验（购自 corning ,0.8 微米孔径）
[0130] 将未处理组、转染对照siRNA(其正义链为SEQ ID N0:3、反义链为SEQ ID N0:4) (阴性对照组)和转染化R3特异siRNA(其正义链为SEQ ID N0:5,反义链为沈Q ID N0:6)组 的化pG细胞悬液加到小室，下室加入5 %血清，24h后吸出培养基，PBS清洗两次，用棉签搔去 上室面细胞，无水甲醇固定15min，小室翻转惊干10min，0.1%的结晶紫染色20min(结晶紫 用无水甲醇配成0.5 %的母液，用时稀释成0.1%)，PBS清洗两次，24孔板加入PBS，将 transwe 11小室放24孔板里拍照。所得结果如图11及图12所示，图11显示的是化answe 11迁 移细胞的整体图片，图12是图11的局部放大图片。图11及图12显示化R3特异SiRNA组比未处 理组、化组迁移的细胞少，即表明化R3的降低可W明显抑制肿瘤细胞化巧G2)的迁移。
[0131] 最后说明的是上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点，而非限制本发 明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应 当理解:依然可W对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何 修改或局部替换，均应涵盖在本发明的保护范围当中。
【主权项】
1. 针对DcR3的抑制剂在制备降低或消除肿瘤细胞转移的药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其中，所述应用为针对DcR3的抑制剂在制备通过升高E-钙黏着蛋白来降低或消除肿瘤细胞转移的药物中的应用。3. 根据权利要求1所述的应用，其中，所述应用为针对DcR3的抑制剂在制备通过升高 EMT过程中E-钙黏着蛋白来降低或消除肿瘤细胞转移的药物中的应用。4. 根据权利要求1~3中任一项所述的应用，其中，所述针对DcR3的抑制剂为降低DcR3 的表达水平和/或拮抗DcR3作用的试剂;例如抗DcR3的抗体、针对DcR3编码序列的RNA干扰 分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA;所述抗DcR3的抗体例如为人DcR3/TNFRSF6B抗 体;所述siRNA的正义链的序列如SEQ ID N0:5所示，反义链的序列如SEQ ID N0:6所示。5. 根据权利要求1~3中任一项所述的应用，其中，所述肿瘤选自肝癌、乳腺癌、胶质瘤、 结肠癌、子宫颈癌、肺癌、胰腺癌、胃癌或膀胱癌;优选肝癌。6. -种降低或消除肿瘤细胞转移的siRNA，其中，所述siRNA的正义链的序列如SEQ ID NO:5所示，反义链的序列如SEQ ID NO:6所示。7. -种降低或消除肿瘤细胞转移的药物组合物，其中，该药物组合物包含有效剂量的 权利要求6所述的siRNA。8. -种抑制肿瘤细胞EMT的方法，所述方法包括调控DcR3靶点，所述调控DcR3靶点包括 降低DcR3的表达水平和/或拮抗DcR3作用的途径。9. 一种升高肿瘤细胞中E-钙黏着蛋白的方法，所述方法包括调控DcR3靶点，所述调控 DcR3靶点包括降低DcR3的表达水平和/或拮抗DcR3作用的途径。10. -种筛选降低或消除肿瘤细胞转移药物的方法，所述方法包括： (a) 提供表达DcR3的肿瘤细胞系、肿瘤培养物或荷肿瘤动物； (b) 将候选药物与步骤(a)中提供的肿瘤细胞系、肿瘤培养物或荷肿瘤动物接触，作为 给药组； (c) 检测给药组中E-钙黏着蛋白的表达水平，并与未给予候选药物的对照肿瘤细胞系、 肿瘤培养物或荷肿瘤动物中的E-钙黏着蛋白的表达水平进行比较； 如果检测结果显示，给药组的E-钙黏着蛋白的表达水平高于对照组，则表明该候选化 合物为降低或消除肿瘤细胞转移药物； 优选地，所述肿瘤选自肝癌、乳腺癌、胶质瘤、结肠癌、子宫颈癌、肺癌、胰腺癌、胃癌或 膀胱癌;更优选地，所述肿瘤为肝癌。
【文档编号】A61K31/713GK105999271SQ201610389396
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】万晓春, 张宏玲
【申请人】深圳先进技术研究院