Fats作为黑色素瘤免疫治疗的靶点及应用
【专利摘要】本发明创造提供了FATS基因或其表达产物在黑色素瘤免疫环境中发挥的作用，能够作为黑色素瘤相关疾病的功能产品的靶点，还可以用于黑色素瘤相关疾病的功能产品的体外筛选。
【专利说明】
FATS作为黑色素瘤免疫治疗的靶点及应用
技术领域
[0001] 本发明创造属于生物技术领域，具体涉及FATS作为黑色素瘤免疫治疗的靶点及应 用。
【背景技术】
[0002] 黑色素瘤是一种恶性肿瘤，起源于黑色素细胞，在所有的皮肤肿瘤中最具侵袭性。 这些产生色素的细胞在体内可以来源于不同的组织包括皮肤，黏膜以及结膜等。几十年以 来，许多用于恶性肿瘤的化疗药物与方法被不断的开发，但是转移性黑色素瘤病人的生存 率却没有增加。2015年黑色素瘤在美国发病人数大约是73,870人次。尽管黑色素瘤没有其 他皮肤癌症常见，例如基底细胞癌以及鳞状细胞癌，但是黑色素瘤引起的死亡在皮肤癌症 中占巨大的比例。根据肿瘤程度的不同，黑色素瘤病人的存活率有着明显的差别，早期病人 只需要手术切除，转移病人的5年生存率仅为16.6%。
[0003] 幸运的是，近些年来，对黑色素瘤的了解为临床提供了有利的信息。随着强大的分 子诊断工具的出现，许多基因突变，放大或者删除在肿瘤生长，存活以及对小分子抑制剂的 敏感反应中被发现，这使高效的信号转导靶点以及免疫治疗靶点得以发展，先前不良的预 后在系统治疗出现之后有了改观。自从2011年，美国食品和药物管理局(FDA)批准了6种药 物（易普利姆玛，维罗非尼，达拉非尼，曲美替尼等），这些药物可以通过4种不同的机制(抑 制CTL相关抗体抑制剂，抑制BRAF，抑制MEK以及抑制Η)-1受体)对黑色素瘤进行治疗。
[0004] 研究所发现的致癌的BRAF的突变在高达50%的黑色素瘤中促进着肿瘤的生长， BRAF以及其他基因，例如KIT的突变的发现，为系统治疗引入了不同的方法。靶点治疗，包括 BRAF和MEK抑制剂，改变了 BRAF V600突变的黑色素瘤病人总的存活率。在过去的5到10年 里，黑色素瘤的治疗也由于新的一类免疫调节因子的发现而有了很大的变化，免疫检查点 的抑制极大的改变了治疗现状。免疫调节检查点的失活限制了黑色素瘤中T细胞的免疫应 答，这都是癌症免疫治疗的靶点。免疫检查点抑制剂易普利姆玛以及抗I 3D-I抗体，以CTLA-4 和ro-1/PD-Ll为靶点治疗的成功，在临床治疗中有了深远的意义。
[0005] 大量的研究表明，肿瘤的免疫治疗是晚期肿瘤病人的一种治疗选择。目前，肿瘤的 免疫治疗可以破坏肿瘤细胞，免疫系统的功能水平与肿瘤的预后以及肿瘤的临床治疗效果 密切相关。研究发现，靶定肿瘤微环境(TME)已经成为目前抗肿瘤治疗的重要策略。目前已 知，肿瘤微环境中的免疫细胞可以影响肿瘤的发生，发展，侵袭与最终的结果。
[0006] 染色体脆性位点是正常基因组中位点特异的不稳定区域，包括88个普通型脆性位 点(CFS)和39个稀有型脆性位点，CFS为染色体上的正常组成结构。但在细胞分裂中期出现 复制异常时，染色体中脆性位点为最易发生裂隙或断点的部位。CFSs在进化过程中的高度 保守性。ClOorfOO是最近被确定的一种通用脆性位点，最初发现，在几种肿瘤细胞系中过表 达C10orf90后表现出抑制肿瘤的作用，因而将C10orf90命名为脆性位点相关的肿瘤抑制因 子(Fragile-site associated tumor suppressor，FATS)。有报道指出，CFSs与免疫也具有 相关性。然而，目前对于FATS基因的研究非常有限，FATS基因在肿瘤免疫中的作用尚没有报 道。我们的前期研究结果提示，FATS基因可能是一种重要的免疫调节因子，在自身免疫疾病 以及肿瘤免疫中可能具有潜在的作用。
【发明内容】
[0007]本发明创造的目的在于提供FATS作为黑色素瘤免疫治疗的靶点的应用。
[0008]在本发明的一个方面，提供FATS基因或其表达产物(FATS基因的编码蛋白）在： [0009] i)开发、筛选黑色素瘤功能产品方面的应用;或 [0010] ii)制备治疗或预防黑色素瘤的功能产品方面的应用。
[0011] 在本发明的另一个方面，提供一种作用于FATS基因或其表达产物的用于治疗或预 防黑色素瘤的功能产品。
[0012] 在本发明的另一个方面，提供一种：
[0013] i)开发、筛选黑色素瘤功能产品的方法;或
[0014] ii)制备治疗或预防黑色素瘤的功能产品的方法。
[0015] 其中，所述功能产品包括药品（或药物、药剂等）、抑制剂(或抑制物等)等能够对黑 色素瘤的发生、发展产生治疗、缓解、抑制、调节等有益作用的产品或潜在物质;所述功能产 品可以为单一制剂，也可以为包含有效量制剂成分的组合物，所述组合物中可以包括药剂 学上能接受的载体。
[0016] 其中，所述功能产品包括下调FATS基因的表达、转录或其表达产物的功能;所述方 法包括下调FATS基因的表达、转录或其表达产物的步骤。本领域技术人员可知的能够下调 FATS基因的表达、转录或其表达产物的手段包括但不限于以下一种或多种，均可以用于本 发明：（i )DNA水平上：降低FATS基因拷贝数、转染FATS基因低表达载体；（i i)转录水平上:阻 碍或抑制FATS基因的表达、阻碍或失活调控FATS基因表达的启动子、激活负调控FATS基因 表达的转录因子、采用RNA干扰技术对FATS基因表达进行干扰；（iii)转录后水平上:激活促 进FATS基因mRNA降解的microRNA转录表达、导入抑制FATS基因表达的microRNA;(iv)翻译 后水平上：导入抑制FATS基因编码蛋白的分子、促进负调控FATS基因表达的蛋白、抑制FATS 基因表达的银子及蛋白的表达。
[0017] 在一些优选方案中，所述功能产品用于:增加肿瘤组织中炎性细胞的浸润。
[0018] 在另一些优选方案中，所述功能产品用于:在外周免疫器官或肿瘤免疫微环境中， 促进抗肿瘤免疫和/或抑制促肿瘤的免疫反应。
[0019] 在另一些优选方案中，所述功能产品用于:在巨噬细胞定向分化中，促进向Ml型巨 噬细胞极化，和/或抑制M2型巨噬细胞的极化。
[0020] 在另一些优选方案中，所述功能产品用于以下一种或优选的多种作用：
[0021] i)提高细胞毒性T淋巴细胞，NK细胞，γδτ细胞和/或Ml型巨噬细胞的比例；
[0022] ii)降低调节性T淋巴细胞和/或M2型巨噬细胞的比例；
[0023] iii)提高T细胞增殖相关细胞因子IL-2和/或Ml型巨噬细胞分泌细胞因子IL-12的 表达；
[0024] iv)提尚巨卩策细胞杀伤能力；
[0025] V)提高T细胞的增殖能力；
[0026] vi)降低巨噬细胞表达VEGF;
[0027] vii)抑制肿瘤组织血管生成；
[0028] viii)骨髓细胞在巨噬细胞定向分化中，促进向Ml型巨噬细胞极化，和/或抑制M2 型巨噬细胞的极化；
[0029] ix)促进M2型巨噬细胞的凋亡；
[0030] X)激活NF-κΒ信号通路。
[0031 ]在一些优选方案中，所述功能产品选自或含有:核酸抑制物，蛋白抑制剂，抗体，配 体，蛋白水解酶，蛋白结合分子，FATS基因缺陷或沉默的免疫相关细胞(如巨噬细胞）、其分 化细胞或构建物中的一种或多种，能够在基因或蛋白水平上下调FATS基因的表达或其表达 产物。
[0032] 在另一些优选方案中，所述功能产品选自或含有：以FATS基因或其转录本为靶序 列、且能够抑制FATS基因表达产物的表达或基因转录的小干扰1?^、(181^^、8111?^、微小1^^、 反义核酸;或能表达或形成所述小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
[0033] 在另一些优选方案中，所述功能产品选自或含有以下任一种：
[0034] i)以SEQ ID NO: 1或其转录本为靶序列，且能够抑制FATS基因表达产物的表达或 基因转录的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；
[0035] ii)能表达或形成i)中所述小干扰1?嫩、(181?财、8111?财、微小1?嫩、反义核酸的构建 物；
[0036] iii)含有SEQ ID N0:1或其互补序列，且能够在转入体内后形成抑制FATS基因表 达产物的表达或基因转录的干扰分子的构建物；
[0037] iv)抑制或敲除SEQ ID NO: 1基因序列后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建物；
[0038] V)以根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的SEQ ID NO: 1的同源序列或其转 录本为靶序列，且能够抑制FATS基因表达产物的表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、 shRNA、微小RNA、反义核酸；
[0039] vi)能表达或形成V)中所述小干扰1?嫩、(181?财、8111?财、微小1?嫩、反义核酸的构建 物；
[0040] vii)含有根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的SEQ ID NO: 1的同源序列或 其互补序列，且能够在转入体内后形成抑制FATS基因表达产物的表达或基因转录的干扰分 子的构建物；
[00411 Viii)抑制或敲除根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的SEQ ID N0:1的同 源基因序列后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建物。
[0042]所述构建物可以为细胞(如转染细胞)或表达载体。所述同源序列的同源性优选地 大于70%。
[0043]其中，所述FATS基因或其表达产物应理解为包括：
[0044] i)FATS基因或其表达产物的原始序列或片段；
[0045] ii)FATS基因或其表达产物的保守性变体、生物活性片段或衍生物；
[0046] iii)根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的FATS基因或其表达产物的原始 序列或片段；
[0047] iv)根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的FATS基因或其表达产物的保守性 变体、生物活性片段或衍生物。
[0048] 本发明创造具有如下优势：（1)揭示了FATS基因或其表达产物与黑色素瘤密切相 关，从而可以作为药物靶点开发黑色素瘤的相关药物；（2)揭示了FATS基因或其表达产物在 黑色素瘤中作用的细胞机制以及分子机制，为黑色素瘤的相关药物的开发提供了有效的目 标手段或重大依据。
【附图说明】
[0049] 图1是FATS基因缺陷抑制B16细胞小鼠皮下荷瘤黑色素瘤的发生发展。2 X IO5个 B16细胞皮下注射到小鼠右后背部(野生型小鼠，n=16;FATS基因缺陷小鼠，n=15)，观察并 测量肿瘤大小至荷瘤第20天，处死小鼠，检测小鼠黑色素瘤的体积以及重量;其中，A图为野 生型小鼠与FATS基因缺陷小鼠黑色素瘤的生长曲线;B图为野生型小鼠与FATS基因缺陷小 鼠肿瘤典型代表结果；C图为两组小鼠的最终肿瘤重量；图D为两组小鼠的未成瘤率（P = 0.0083); E图为两组小鼠的典型代表结果(*，P〈0.05; **，P〈0.01; ***，P〈0.001)。
[0050] 图2是FATS基因缺陷增加了炎性细胞向小鼠黑色素瘤中的浸润。B16细胞皮下注射 到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠黑色素瘤的 部分肿瘤组织，石蜡包埋切片（切片厚度为5μπι)，对切片进行H&E染色;后面两列分别是第一 列图片方框内的组织放大图，绿色箭头所指的是浸润的炎症细胞。
[0051 ]图3是FATS基因缺陷增加了黑色素瘤小鼠脾脏中T细胞和γδτ细胞的比例。Β16细 胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠 的脾脏，分离脾脏单个核细胞，流式细胞术检测免疫细胞亚群（总T细胞以及γδΤ细胞)变 化。A图为总的T细胞在两组黑色素瘤小鼠脾脏中比例的典型流式图；B图是两组小鼠脾脏总 T细胞比例的统计图；C图为γ δΤ细胞在两组黑色素瘤小鼠脾脏中比例的典型流式图；D图是 两组小鼠脾脏γδΤ细胞比例的统计图（*，Ρ〈0.05;#，Ρ〈0.01;#*，Ρ〈0.001)。
[0052] 图4是FATS基因缺陷对黑色素瘤小鼠脾脏中NK细胞的影响。Β16细胞皮下注射到野 生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的脾脏，分离脾 脏单个核细胞，流式细胞术检测NK细胞的比例与活化。A图为NK细胞在两组黑色素瘤小鼠脾 脏中比例的典型流式图；B图是两组小鼠NK细胞比例的统计图；C图左侧为NK细胞活化的典 型流式图，右侧为NK细胞活化情况的统计图，纵坐标表示平均荧光强度（MFI) (*，P〈 0·05;**，Ρ〈0·01;***，Ρ〈0·001)〇
[0053] 图5是FATS基因缺陷增加了黑色素瘤小鼠脾脏中CTL的比例与活化程度。Β16细胞 皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的 脾脏，分离脾脏单个核细胞，流式细胞术检测CTL细胞比例与活化。A图为CTL细胞在两组黑 色素瘤小鼠脾脏中比例的典型流式图；B图是两组小鼠CTL细胞比例的统计图；C图CTL细胞 活化情况的典型流式图；D图为CTL高度活化的高阳性⑶44比例的统计图（*，P〈0.05 ;**，P〈 0·01;***，Ρ〈0·001)。
[0054] 图6是FATS基因缺陷增加了黑色素瘤小鼠脾脏中IFN-γ+CTL和Thl细胞的比例。 Β16细胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两 组小鼠的脾脏，分离脾脏单个核细胞，流式细胞术检测IFN- γ +CTL和Thl细胞比例。A图为 IFN-Y+CTL细胞在两组黑色素瘤小鼠脾脏中比例的典型流式图和统计图；B图是两组小鼠 脾脏Thl细胞比例的典型流式图和统计图（*，Ρ〈0.05 ;#，Ρ〈0.01;#*，Ρ〈0.001)。
[0055] 图7是FATS基因缺陷对黑色素瘤小鼠脾脏中Treg和MDSC的影响。B16细胞皮下注射 到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的脾脏，分 离脾脏单个核细胞，流式细胞术检测免疫细胞亚群(Treg，MDSC)变化。A图为Treg细胞在两 组黑色素瘤小鼠脾脏中比例的典型流式图；B图是两组小鼠Treg细胞比例的统计图；C图 MDSC 细胞的比例统计图（*，Ρ〈0·05;**，Ρ〈0·01;***，Ρ〈0·001)。
[0056] 图8是FATS基因缺陷增加了黑色素瘤小鼠血清中T细胞活化因子的表达。Β16细胞 皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，对两组小鼠进行眼球取 血，在血浆中加入肝素钠，静置后离心，取血清，进行多细胞因子ELISA检测(Bi 0-Plex)。图 为两组小鼠血清中IL-2，IFN- γ，IL-12，IL-1 β，TNF-α以及IL-10的表达情况的统计图（*，P〈 0·05;**，Ρ〈0·01;***，Ρ〈0·001)〇
[0057] 图9是FATS基因缺陷促进了肿瘤免疫微环境中的T细胞比例。Β16细胞皮下注射到 野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的肿瘤组织， 分离单个核细胞，流式细胞术检测总T细胞和CTL的比例变化。A图为总的T细胞在两组黑色 素瘤小鼠肿瘤微环境中比例的典型流式图;B图是两组小鼠肿瘤微环境中总T细胞比例的统 计图；C图为CTL在两组黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中比例的典型流式图；D图是两组小鼠肿瘤 微环境中 CTL比例的统计图（*，P〈0.05;**，P〈0.01;***，P〈0.001)。
[0058] 图10是FATS基因缺陷增加了黑色素瘤小鼠肿瘤免疫微环境中γ δΤ以及NK细胞的 比例。Β16细胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠， 取两组小鼠的肿瘤组织，分离单个核细胞，流式细胞术检测免疫细胞亚群(ΝΚΤ以及γδΤ细 胞)变化。A图为NK细胞在两组黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中比例的典型流式图；B图是两组小 鼠肿瘤微环境NK细胞比例的统计图；C图为γ δΤ细胞在两组黑色素瘤小鼠脾脏中比例的典 型流式图；D图是两组小鼠肿瘤微环境中γ δΤ细胞比例的统计图（*，Ρ〈0.05;**，Ρ〈 0·01;***，Ρ〈0·001)。
[0059] 图11是FATS基因缺陷增强了黑色素瘤肿瘤微环境中CTL的活化。Β16细胞皮下注射 到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的肿瘤组 织，分离单个核细胞，流式细胞术检测CTL的活化。A图为活化的CTL细胞在FATS基因缺陷也 野生型小鼠黑色素瘤肿瘤微环境中比例的典型流式图；B图是两组小鼠肿瘤微环境活化的 CTL 细胞比例的统计图（*，Ρ〈0·05;**，Ρ〈0·01;***，Ρ〈0·001)。
[0060] 图12是FATS基因缺陷增加了黑色素肿瘤微环境中IFN-γ+CTL以及Thl的比例。Β16 细胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小 鼠的肿瘤组织，分离单个核细胞，流式细胞术检测IFN- γ +CTL以及Thl的比例。A图为CTL细 胞分泌IFN-γ在FATS基因缺陷与野生型小鼠黑色素瘤肿瘤微环境中比例的典型流式图与 统计图；B图为两组黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中Thl细胞比例的典型流式图与统计图（*，Ρ〈 0·05;**，Ρ〈0·01;***，Ρ〈0·001)〇
[0061 ]图13是FATS基因缺陷对黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中Treg和MDSC的影响。Β16细胞 皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的 肿瘤组织，分离单个核细胞，流式细胞术检测免疫细胞亚群(Treg以及MDSC)的变化。A图为 Treg细胞在两组黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中比例的典型流式图；B图是两组小鼠肿瘤微环 境中Treg细胞比例的统计图；C图MDSC细胞的比例统计图（*，Ρ〈0·05 ;**，Ρ〈0·01;***，Ρ〈 ο.οοι)〇
[0062] 图14是FATS基因缺陷促进了肿瘤微环境中Ml型巨噬细胞，抑制了 M2型巨噬细胞。 B16细胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两 组小鼠的肿瘤组织，部分组织甲醛固定，剩余组织分离单个核细胞，流式细胞术检测免疫细 胞亚群(Ml，M2型巨噬细胞)变化以及免疫荧光检测肿瘤组织切片中⑶206的表达。A图为Ml 型巨噬细胞在两组黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中比例的典型流式图；B图为Ml型巨噬细胞在 两组黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中比例的统计图；C图为M2型巨噬细胞在两组黑色素瘤小鼠 肿瘤微环境中比例的典型流式图；D图为M2型巨噬细胞在两组黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中 比例的统计图；E图为肿瘤组织切片中⑶206的表达情况，红色箭头所指为染上⑶206的细胞 (*，Ρ〈0·05;**，Ρ〈0·01;***，Ρ〈0·001)。
[0063] 图15是FATS基因缺陷增加了Ml型巨噬细胞，抑制了M2型巨噬细胞相关因子的基因 表达。B16细胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠， 取两组小鼠的肿瘤组织，分离单个核细胞，流式细胞术分选巨噬细胞，提取巨噬细胞RNA，检 测Ml和M2型巨噬细胞表达，极化相关因子的基因水平。A图为肿瘤微环境中巨噬细胞表达的 Ml型巨噬细胞相关因子（IL-12，TNFa和N0S2)的基因水平;B图为肿瘤微环境中巨噬细胞表 达的M2型巨噬细胞相关因子（几-10 48^，1代1(00206)以及(：(^22)的基因水平（*，？〈 0·05;**，Ρ〈0·01;***，Ρ〈0·001)〇
[0064] 图16是FATS基因缺陷抑制了黑色素瘤肿瘤微环境中的血管生成。Β16细胞皮下注 射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的肿瘤组 织，甲醛固定，切片，免疫荧光检测肿瘤组织切片中⑶31的表达。图为FATS基因缺陷小鼠肿 瘤组织中⑶31表达情况，白色箭头所指为染上⑶31的细胞，蓝色背景为DAPI染色。
[0065] 图17是FATS基因缺陷并没有影响T细胞体外增殖。磁珠分选未荷瘤的野生型以及 FATS基因缺陷小鼠的脾脏CD3+T细胞，CFSE染色后，培养在提前过夜抗体包被的48孔细胞培 养板中，培养上清为还有10%FBS的1640培养基或者是B16细胞培养上清，培养4天后，流式 细胞术检测T细胞的增殖情况。图左侧为B16细胞培养上清培养的两组小鼠的T细胞的增殖 指数统计图；图右侧为含有I〇 %I7BS的1640培养基培养的FATS基因缺陷小鼠与野生型小鼠 的T细胞的增殖指数统计图。
[0066]图18是FATS基因缺陷增强了黑色素瘤肿瘤微环境中巨噬细胞的提呈能力。B16细 胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠 的肿瘤组织，分离单个核细胞，流式细胞术分选巨噬细胞，丝裂霉素C处理巨噬细胞后与磁 珠分选出的CD3+T细胞1:4混合，共培养，流式检测T细胞的增殖变化。A图为共培养后T细胞 的增殖指数统计图；B图为培养上清中IL-2的表达情况（*，Ρ〈0·05;**，Ρ〈0·01;***，Ρ〈 ο.οοι)〇
[0067]图19是FATS基因缺陷小鼠肿瘤中的巨噬细胞具有更强的细胞杀伤功能。B16细胞 皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下进行荷瘤，20天后，处死小鼠，取两组小鼠的 肿瘤组织，分离单个核细胞，流式细胞术分选巨噬细胞，与B16细胞40:1混合，共培养，1天 后，流式检测B16细胞的凋亡情况。A图为共培养后B16细胞的凋亡典型流式图；B图为B16细 胞早期凋亡比例统计图；C图为共培养细胞培养上清中NO的表达情况（*，P〈0.05 ; ，P〈 0·01;***，Ρ〈0·001)。
[0068] 图20是FATS基因缺陷促进了巨噬细胞向Ml型巨噬细胞的极化，抑制了 M2型巨噬细 胞的极化。分离FATS基因缺陷小鼠以及野生型小鼠的骨髓细胞，加入M-CFS使其定向分化为 MO型巨噬细胞，随后加入IFN-γ和LPS或者IL-4使MO型巨噬细胞向Ml型巨噬细胞或M2型巨 噬细胞极化，16小时后收取细胞，流式细胞染色检测Ml型和M2巨噬细胞的比例。图A为MO型 巨噬细胞向Ml型极化后，Ml型巨噬细胞的比例的典型流式图；图B为极化后Ml型巨噬细胞比 例的统计图；图C为MO型巨噬细胞向M2型极化后，M2型巨噬细胞的比例的典型流式图；图D为 极化后M2型巨噬细胞比例的统计图（*，P〈0.05 ;#，P〈0.01;#*，P〈0.001)。
[0069] 图21是FATS基因缺陷促进了 Ml型巨噬细胞中IL-12，TNF-a和N0S2的基因表达。分 离FATS基因缺陷小鼠以及野生型小鼠的骨髓细胞，加入M-CFS使其定向分化为MO型巨噬细 胞，随后加入IFN-γ和LPS使MO型巨噬细胞向Ml型巨噬细胞极化，收取细胞，实时定量PCR检 测Ml型巨噬细胞相关因子的表达。图为MO型巨噬细胞向Ml型极化后，Ml型巨噬细胞中TNF-〇，从^2以及11^-12的基因表达的统计图（*，？〈0.05 ;**，？〈0.01;***，？〈0.001)。
[0070] 图22是FATS基因缺陷抑制了M2型巨噬细胞中Argl，Mrcl，Retnla和CCL22的基因表 达。分离FATS基因缺陷小鼠以及野生型小鼠的骨髓细胞，加入M-CFS使其定向分化为MO型巨 噬细胞，随后加入IL-4使MO型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化。收取细胞，实时定量PCR检测 M2型巨噬细胞相关因子的表达。图为MO型巨噬细胞向M2型极化后，M2型巨噬细胞中Argl， 1代1，1^加 1&和〇0^2的基因表达的统计图（*，？〈0.05;**，？〈0.01;***，卩〈0.001)。
[0071]图23是FATS基因缺陷促进了 M2型巨噬细胞凋亡。分离FATS基因缺陷小鼠以及野生 型小鼠的骨髓细胞，加入M-CFS使其定向分化为MO型巨噬细胞，随后加入IL-4使MO型巨噬细 胞向M2型巨噬细胞极化。收取细胞，凋亡试剂盒检测两组小鼠M2型巨噬细胞凋亡情况以及 免疫印迹检测凋亡相关蛋白表达。图A为M2型巨噬细胞凋亡典型流式图；图B为M2型巨噬细 胞早期凋亡的比例统计图；C图为M2型巨噬细胞凋亡信号Cleaved-caspase3和Bcl2的表达 水平(*，Ρ〈0·05 ;**，Ρ〈0·01;***，Ρ〈0·001)。
[0072]图24是FATS基因缺陷激活了巨噬细胞NF-κΒ信号通路。分离FATS基因缺陷小鼠以 及野生型小鼠的骨髓细胞，加入M-CFS使其定向分化为MO型巨噬细胞。以上方法所得的两组 小鼠的巨噬细胞用LPS刺激后提取蛋白，免疫印迹技术检测细胞内NF-κΒ信号通路。图A为骨 髓定向分化的MO型巨噬细胞p65的表达情况；图B为骨髓MO型巨噬细胞ΙκΒα信号的表达情 况。
[0073]图25是FATS基因缺陷的骨髓来源巨噬细胞过继治疗能明显抑制肿瘤生长。选取10 只C57BL/6小鼠，雌性，6-8周，体重18-20g，皮下注射Β16细胞，2 X 105/只，构建小鼠皮下黑 色素瘤移植瘤模型，随机将小鼠分成两组，每组5只。分别在小鼠荷瘤第2天和第7天，将野生 型小鼠和FATS基因敲除小鼠骨髓来源的定向分化为MO型的巨噬细胞(LPS刺激12小时)过继 输注到小鼠体内，连续监测小鼠肿瘤大小。荷瘤16天后，将处死小鼠，分离肿瘤组织，称量肿 瘤重量并拍照。图A为过继输注野生型以及FATS基因缺陷小鼠骨髓来源巨噬细胞后，小鼠黑 色素瘤的生长曲线；图B为过继输注野生型以及FATS基因缺陷小鼠骨髓来源巨噬细胞后，小 鼠黑色素瘤肿瘤的典型代表结果；图C为过继输注野生型以及FATS基因缺陷小鼠骨髓来源 巨噬细胞后小鼠肿瘤的最终重量(*，P〈〇 · 05; **，P〈0 · 01; ***，P〈0 · 001)。图26是过继输注 FATS-siRNA转染的骨髓来源的巨噬细胞能明显抑制肿瘤的生长。分离野生型小鼠骨髓细 胞，加入M-CFS使其定向分化为MO型巨噬细胞，随后分别转染FATS-siRNA和NC-siRNA，24小 时后，加入LPS( lμg/ml) 12h刺激巨噬细胞，收集细胞，调整细胞浓度为I X lOVml，尾静脉注 射到小鼠体内，每只小鼠注射1〇〇μ1。分别在荷瘤第2天和第7天进行两次过继治疗，连续监 测小鼠肿瘤生长情况。图A为转染FATS/NC-siRNA 24小时后，RT-PCR检测FATS基因的mRNA水 平的表达水平。图B为两组si-RNA治疗后小鼠黑素素瘤的肿瘤生长曲线。（*，P〈0.05;**，P〈 0.01;*林，P〈0.001)。以上各图中，WT表示野生型小鼠，KO表示FATS基因缺陷小鼠。
【具体实施方式】
[0074] 下面通过结合具体实施例对本发明创造进行进一步说明。
[0075] 本说明书和权利要求书中使用的下列术语，除非另外说明具有下述一般含义，且 下述含义被认为在本领域技术人员的知识范围之内：
[0076] "保守"指所涉及的氨基酸序列或核酸序列与原始序列具有较高的相似性或同一 性，能够维持其原始序列基本的结构、生物学活性或功能，一般可以通过相似的氨基酸残基 替换或等位基因（简并密码子)替换等获得。
[0077] "变体"指具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或核酸序列，所述改 变可包括氨基酸序列或核酸序列中氨基酸或核苷酸的插入、缺失或替换。变体可具有保守 性改变，其中替换的氨基酸与原氨基酸具有相似的结构或化学性质，如亮氨酸和异亮氨酸 之间的替换，也可具有非保守性改变。
[0078] "同源"包括完全同源和部分同源，在描述多肽、蛋白质或氨基酸序列时，指具有相 同或相似的结构或功能，或具有相似的氨基酸序列;在描述核酸序列时，指具有相似性或互 补的核酸序列，也包括根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的核酸序列；"同源"在本 发明具有相对较为广泛的含义，例如，包括具有一定百分比的相同性的序列(氨基酸序列或 核酸序列），或包括序列的变体。
[0079] "衍生物"在描述多肽、蛋白质或氨基酸序列时，指由原多肽、蛋白质或氨基酸序列 衍生而来的关联多肽、蛋白质或氨基酸序列，其具有与原始多肽、蛋白质或氨基酸序列相似 的性质、活性或功能，例如，本发明中多肽、蛋白质或氨基酸序列包括这样的衍生物：（i)成 熟多肽与另一种化合物融合，或者（ii)在氨基酸序列中融合或插入附加的氨基酸序列 (linker、蛋白质纯化标识序列、酶切位点等）；等;在描述核酸序列时，指由原始序列衍生未 来的关联序列，其具有与原始核酸序列相似的性质、活性或功能，可以包括：（i)序列或基因 中连续或间隔地插入、缺失、替换一个或多个碱基(优选为等位基因的替换），且所述一个或 多个氨基酸残基的插入、缺失、替换在同一序列或基因中可同时或不同时存在；（ii)序列或 基因中一个或多个碱基被修饰；（iii)序列或基因中融合或插入编码附加的氨基酸序列的 基因;等。
[0080] "抑制剂"包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂、核酸抑制物等。
[0081 ] "下调"指降低FATS基因或其表达产物的活性、降低FATS基因或其表达产物的稳定 性、降低FATS基因表达产物的表达、减少FATS基因或其表达产物的有效作用时间、抑制FATS 基因的转录和/或翻译等。
[0082] "干扰分子"是指能够下调FATS基因或其表达产物的物质的总称，包括所述的小干 扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸等。
[0083]根据特定的靶序列来设计干扰分子是本领域技术人员已知且能够实现的。这些干 扰分子也可以通过本领域已知的多种手段(例如采用适当的试剂)被输送到体内，从而发挥 其下调FATS基因或其表达产物的作用。
[0084]在通过本文得知了 FATS基因或其表达产物与黑色素瘤之间的相关性后，可以基于 该特征来筛选能够作用于、尤其是能够下调FATS基因或其表达产物的功能产品，所用的筛 选方法也也可以通过本领域已知的多种手段得到实现。
[0085]下面通过具体实验及分析和讨论详细阐述FATS基因或其表达产物与黑色素瘤之 间的相关性。
[0086] -、FATS基因缺陷对小鼠黑色素瘤以及肿瘤免疫微环境的调节作用
[0087] 1.1对象和方法
[0088] 1.1.1主要材料、试剂与仪器设备
[0089] 1.1.1.1主要试剂 DMEM培养液 美国GIBCO公司 RPM丨 1640 怡芥液 .IiN GIBCO 公 I1J 胎牛血清（FBS) 美国GIBCO公司 双抗（Pcnicniin-StrcptomyCiii) G丨BCO 公）i'J 0.25%胰蛋白酶+EDTA 美国GIBCO公司 磷酸盐缓冲液（PBS) 上海索来宝公司 二甲基亚砜（DMSO) 美国Sigma公司 麻酉卒药 美国Sigma公司 胶原酶IV 美国Sigma公司 小鼠淋巴细胞分离液 天津灏洋生物制品科技公司
[0090] 三联刺激剂 美国Bio Legend公司 牛血清白蛋白（BSA) 美国GIBCO公司 Pcrmcabiiizalion wash buiTcr 〇]|上丨 eBiosciencc 公、丨J CytoΠx/Cytopcrm buITcr .? I i(i cBioscience 公!，.J Fixation buffer ..Ii I 丨;:丨 eBioscience 公丨j CFSE 美国 Invitrogen.公司 TRIZOL 美国 Invitrogen 公司 M-MLV Reverse Transcriptase 戈|丨::丨丨nvitrogen 公 ReaUimePCR定量试剂盒 上海星汉生物科技有限公司 多聚甲醛（PFA) 美国Sigma公司
[0091] 1.1.1.2细胞系
[0092] B16细胞
[0093] 1.1.1.3抗体 Anli-mousc CD3- PE .:? 丨丨;:丨 cBiosciencx 公），.J Anli-mouso CD8a- APC eBiosciencc 公.i，.j Anti-mouse NKI. I - APC 11;:丨 cBiosciencx 公，.J Anti-mouse γδ- APC eBiosciencc 公.i，.j Anti-mouse CD3- PE-CY7 .)2 丨丨::丨 cEiioscicnce 公-丨丨.j Anti-mouse CD25- FITC N Biolegcnd 公丨 Anti-mouse Foxp3- PE .无丨丨::丨 Biolcgcnd 公.!丨J Anti-mouse CD4- APC ..λ?Ι 丨;:丨 eBioscience 公 Anti-mouse Ly6C- PE .? 丨丨;:丨 eBioscience 公）i.J
[0094] Anli-mousc Ly6G- PcCy^.5 ..XiN eBioscience 公 Anti-niousc CD44- PE .))1.1(1 eBiosciencc 公."1 Anti-mouse 丨FM-γ- PE .美国 eBioscience 公）i'J Anli-mousc CDl lb- FITC .))1.1(1 eBiosciencc 公."1 Anli-mousc CDl lb- PE -X:丨丨、;i eBioscience 公-"J Anli-mousc F4/80- APC .Ji I ":| Biolcgcnd 公.)，.j Anli-mousc CD206- Fl I C .'.Xl 11;:丨 Biolcgend 公！ Anti-mouse MHC-II - PE 'eBiosciencc 公.i，.j Ant.i-m.ou:se CD31..- PE 美国 eBioscience 公司
[0095] 1.1.1.4引物序列
[0097] 1.1.1.5主要仪器 超净工作台 苏净安泰公司 倒置显微镜 日本Olympus公司 细胞培养板 美国C oming公司 细胞培养皿 美国Coming公司 细胞冻存管 美国Coming公司 一次性15ml/50ml离心管 美国Coming公司 二氧化碳细胞培养箱 Sanyo公司 数显游标卡尺 国产中性公司 Iml注射器 上海治宇医疗器械有限公司 细胞过滤器（40μηι) 美国BD公司
[0098] Eppendorl:5804 丨丨',，丨速离心帆 ：? i 丨(丨 Eppendorl'公… Eppendorf5804 迷你/4心机 .U.丨(I Eppendorf 公） FACSC6流式细胞仪 美国BD公司 超微量核酸蛋白含量测定仪 美国Thermo Scientific公司 凝胶成像系统 BIORAD %孔O.lmL的实时定量PCR板 ABI公司 丈时)11 丨丨丨.:PCR 仪 7500 Fast Applied Biosystcms 全自动包埋机 德国Leica公司 轮转式切片机 德国Leica公司 展片机. 德国Leica公司 烤片机 德国Leica公司
[0099] 1.1.2试剂配制
[0100] 1.1.2.1 0.01M PBS：
[0101] 分别称取 Na2HP〇4(1.54g)，KH2P〇4(0.2g)，NaCl(8.0g)，KCl(0.2g)，加入到超纯水 中，充分溶解，定容至100mL，调节PH值(7.2-7.4)。高压灭菌，于4°C冰箱保存备用。
[0102] 1 · 1.2.2流式染色缓冲液（SB，Stainning Buffer)
[0103] 1)38的组成成分为2%卩83,0.1%恥吣，1倍卩83;
[0104] 2)将10ml FBS和5ml浓度为10%的NaN3加入到500ml的PBS中，充分混匀，于4°C冰 箱保存备用。
[0105] 1.1.2.3抗体稀释液：
[0106] 1)抗体稀释液的组成成分为0.2 %牛血清白蛋白（BSA)，0.1 %叠氮钠 (NaN3)以及1 倍 PBS;
[0107] 2)将称取的0.2mg BSA和吸取的Iml 10%的NaN3加入到IOOrnl的PBS中，搅拌，使其 完全溶解，于4 tC冰箱保存备用。
[0108] 1.1.2.4 4%多聚甲醛：
[0109] 1)称取2g多聚甲醛加入到45ml超纯水中，加入lmol/L的NaOH;
[0110] 2)56°C过夜使其完全溶解；
[0111] 3)冷却至室温后，加入5ml 10XPBS
[0112] 4)加入 lmol/L 的 CaCl2 和 MgCl2 各 50ul;
[0113] 5)将PH值调至7.3，4°C避光保存。
[0114] 1.1.2.5流式细胞染色封闭液
[0115] 1)封闭液的组成成分为BSA和大鼠血清；
[0116] 2)取800ul的10%BSA加入200ul的大鼠血清，混合均匀，4°C避光保存。
[0117] 1.1.2.6细胞分选用的缓冲液(0.5%BSA/PBS):
[0118] 1)分选用缓冲液组成成分为BSA和HfPBS
[0119] 2)配制10%BSA，用1倍PBS稀释20倍，4°C保存备用。
[0120] 1.1.2.7抗原热修复液：
[0121 ] 1)修复液组成成分为梓檬酸钠和梓檬酸；
[0122] 2)取柠檬酸钠41ml，柠檬酸9ml，加至450ml超纯水中，混匀，常温保存备用。
[0123] 1.1.3实验方法
[0124] 1.1.3.1 B16细胞复苏、传代和冻存
[0125] 1.1.3.1.1 细胞复苏：
[0126] 1)细胞复苏前，细胞房内以及细胞房超净工作台内需紫外照射15_20min;
[0127] 2)从液氮中取出来需要复苏的细胞，立即放入37°C水浴锅中，不断晃动冻存管 Imin内使细胞液快速溶解；
[0128] 3)装有细胞的冻存管在放入超净工作台前，需酒精仔细擦拭，在超净台中打开冻 存管，将其中的Iml细胞悬液吸到干净无菌的15ml离心管中，加入加有胎牛血清(FBS)的 DMEM培养基(DMEM+20%FBS)，800rpm离心，5min;由于刚复苏的细胞相对脆弱，所以适当的 降低离心时的转速；
[0129] 4)倒掉上清液，用Iml加有20 %FBS的DMEM培养基吹打离心管中沉淀的细胞，使细 胞悬浮起来，提前在IOcm2培养皿中加入9ml加有20 %FBS的DMEM培养基，吸取细胞悬液到培 养皿中，前后左右轻轻摇动，使细胞在培养皿中分布均匀；
[0130] 5)在培养皿上标注好所培养细胞的种类，复苏日期以及培养人姓名，放入CO2细胞 培养箱中培养；
[0131 ] 6) 24小时内更换新鲜的完全培养基。
[0132] 1.1.3.1.2 细胞传代
[0133] 1)当B16(B16细胞为贴壁细胞)在培养皿中的汇合度达到了80%-90%时，即可进 行细胞传代；
[0134] 2)用5ml枪吸出培养皿中的培养上清，随后将无菌的1倍的I3BS 2-3ml轻轻的加入 培养皿中，前后左右轻轻摇动，随后弃掉所加入的I3BS，吸取胰蛋白酶Iml，加入培养皿中进 行细胞消化，前后左右摇动，将培养皿放回细胞培养箱，Imin后取出，加入2-3ml加有10% FBS的DMEM培养基终止消化；用Iml枪将培养皿中的细胞吹打下来，全部细胞悬液吸入到 15ml无菌的离心管中，1000 rpm，离心，5min;
[0135] 3)弃掉上清液，加Iml加有10%FBS的DMEM培养基，用Iml枪吹打，使沉淀的细胞完 全悬浮起来，根据实验要求，将细胞传到提前加入加有10%FBS的DMEM培养基的培养皿中， 前后左右轻轻摇动，使细胞在培养皿中分布均匀；
[0136] 4)在培养皿上标注好培养细胞的种类，传代日期以及培养人姓名，放入CO2细胞培 养箱中培养。
[0137] 1.1.3.1.3 细胞冻存
[0138] 1)配制冻存液:90 % 的 FBS+10 % 的 DMSO;
[0139] 2)收集细胞并进行离心(与传代步骤相同）；
[0140] 3)将配制好的冻存液(0.5ml)提前加入到冻存管中，用加有10%FBS的DMEM培养基 重悬细胞，吸取0.5ml细胞悬液加入到冻存管中，使DMSO的终浓度保持在5% ;
[0141 ] 4)在冻存管写明细胞种类与冻存日期；
[0142] 5)将冻存管放入室温保存的盛有异丙醇的冻存盒中，随后将冻存盒放在_80°C超 低温冰箱中过夜，冻存管可于第二天取出，放入液氮中进行长期保存，冻存盒中异丙醇的使 用次数不能超过5次，5次使用后需更换新的异丙醇。
[0143] 1.1.3.2小鼠黑色素瘤模型构建
[0144] 1.1.3.2.1实验动物
[0145] 1)FATS基因缺陷小鼠（品系为C57BL/6)由天津肿瘤医院李政教授提供，饲养与天 津医科大学实验动物中心，小鼠房等级为SPF级别，饲养环境保持温度为20-25 °C，相对湿度 40%-60%;FATS基因缺陷小鼠被敲掉的FATS基因序列如SEQ ID N0:1所示；
[0146] 2)野生型小鼠为C57BL/6无特殊病原体(SPF级）小鼠，8周龄，体重为20g左右，购买 于北京维通利华实验动物技术有限公司，小鼠饲养于天津医科大学实验动物中心，小鼠房 等级为SPF级别，饲养环境保持温度为20-25°C，相对湿度40%-60%。
[0147] 1.1.3.2.2异位小鼠黑色素瘤模型构建
[0148] 1)将B16细胞培养于IOcm2培养皿中，用加有10%FBS，1%双抗的DMEM培养基培养， 培养至对数生长期；
[0149] 2)收集细胞并进行离心(与传代步骤相同）；
[0150] 3)弃掉上清液，细胞沉淀用1倍的I3BS吹打，lOOOrpm，离心，5min，弃上清，随后再重 复1次；
[0151] 4)收集到的B16细胞用1倍的PBS重悬，计数，调整细胞浓度至2 X 106/ml;
[0152] 5)提前半天时间，用脱毛膏将小鼠右后背部的毛脱去，注射细胞悬液前用75%酒 精对小鼠注射部位进行消毒；
[0153] 6)在每只小鼠的右后背部，注射1 ΟΟμΙ 2 X 106/ml的B16细胞(共31只），即每只小 鼠注射Β16细胞的数量为2 X 105/只，进针后或出针前，可稍微改变针头的方向，注射时动作 轻缓，出针后轻按针孔片刻，可避免细胞悬液漏出；
[0154] 7)每天对小鼠的肿瘤生长情况进行观察，并用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长度与宽 度，做好记录；
[0155] 8)荷瘤后20天，麻醉后脱颈处死小鼠，分离小鼠的脾脏与肿瘤，肿瘤组织，照相，称 重，并测量其长度与宽度，计算肿瘤的终体积；
[0156] 9)小鼠的肿瘤体积计算公式为(长X宽2)/2(_3)
[0157] 1.1.3.3脾脏以及肿瘤组织单个核细胞的分离 [0158] 1.1.3.3.1脾脏单个核细胞的分离
[0159] I)准备：一次性细胞筛网，Iml注射器，培养皿，平头剪刀，镊子，75 %酒精，10倍 PBS，1倍PBS，超纯水，无血清1640培养基，加10%FBS，1%双抗的1640培养基；
[0160] 2)在培养皿中加入4ml无血清1640培养基；
[0161] 3)取小鼠脾脏组织，放入超净工作台，置于一次性细胞筛网中（浸泡于75%酒精中 的器械使用时需用1倍的PBS冲洗，以免杀伤细胞，筛网不可用手触摸网面），用平头剪刀剪 碎脾组织；
[0162] 4)取Iml注射器的针芯(不可用手触摸针芯顶部，用镊子抽出后再用手拿住中间部 分抽出），将针芯头部轻沾皿中培养基后，研磨筛网中的脾脏组织；
[0163] 5)研磨完全后，弃掉针芯，用Iml枪吸取皿中1640培养基冲洗筛网，使细胞流入培 养皿中，再吸取干净的无血清1640培养基2ml冲洗筛网1次；
[0164] 6)将培养皿中的细胞悬液转移至15ml无菌离心管中，1300rpm，离心，5min;
[0165] 7)裂解红细胞:弃上清，涡旋沉淀的细胞，可使细胞松散便于裂解，用900μ1的超纯 水重悬细胞，然后迅速加入10倍的PBS ?οομL，混合后会出现裂解的红细胞团块，将团块挑 出，加入无血清1640培养基至5-7ml，1300rpm，离心，5min(视沉淀细胞的多少可成比例加大 纯水和PBS的量）；
[0166] 8)弃上清，用加有10%FBS，1 %双抗的1640培养基重悬细胞，培养，备用。
[0167] 1.1.3.3.2肿瘤组织单个核细胞的分离
[0168] 1)准备:小鼠单个核细胞分离液，肿瘤消化酶，一次性细胞筛网，Iml注射器，培养 皿，平头剪刀，镊子，75%酒精，1倍PBS，加10%FBS，1%双抗的1640培养基；
[0169] 2)剥离小鼠肿瘤组织，尽量不要破坏肿瘤组织，随后将肿瘤组织置于无菌培养皿 中，放于超净工作台，用平头剪剪碎组织至直径约Imm的小块，加入0.05mg/ml肿瘤消化酶 (0 · 05mg/ml 的胶原酶 IV+0 · 05mg/ml 的透明质酸酶+0 · 05mg/ml 的 DNA 酶I) 20ml 左右，37 °C 消 化1小时左右；
[0170] 3)肿瘤组织消化后转移至一次性细胞筛中，用无菌的Iml注射器针芯的头部对其 进行研磨，期间加入1倍PBS过滤研磨液，收集滤液至15ml无菌离心管中，1500rpm，离心， 5min，重复2次；
[0171] 4)弃上清，加入4ml 1倍PBS重悬，随后加入等体积的小鼠淋巴细胞分离液，室温离 心，提速挡和刹车挡均设为〇,2000rpm，室温离心，20min，平稳取出离心管；
[0172] 5)用5ml枪吸出白膜层上方的液体，仅留取至白膜层上方0.5ml处。用200μ1枪吸出 离心管中的白膜层，置于干净的无菌15ml离心管中，加入3倍体积的1倍PBS，离心5min，3次， 转速分别为 2000rpm，1800rpm 和 1500rpm;
[0173] 6)弃上清，加入含有10%FBS，I %双抗的1640培养基重悬细胞，培养，备用。
[0174] 1.1.3.4流式细胞术检测免疫细胞亚群：
[0175] 1)收取需要检测的细胞，1500rpm，离心，5min;
[0176] 2)弃上清（弃上清时将流式管在干净的滤纸或卫生纸上轻沾，以免过多的上清液 流回），加入1ml 1倍的PBS，重悬细胞，1500rpm，离心，5min;
[0177] 3)弃上清，分出空白管，单染管以及同型对照检测管，与检测管一起，加入1倍PBS， 使每管内液体量大约在?〇〇μ1左右；
[0178] 4)封闭：每管加入25μ1的流式抗体封闭液，4°C避光，30min;
[0179] 5)表面染色:每管按照实验设计分别加入大鼠抗小鼠荧光标记抗体，并按照实验 要求，在同型对照管中加入配套的同型抗体，去除检测时的假阳性：
[0180] ①总 T 细胞：CD3-PE
[0181] ②细胞毒性T淋巴细胞(CTL) :CD3-PE/CD8a-APC
[0182] ③ γδΤ细胞：0)3-ΡΕ/γδ-ΑΡ〇
[0183] ④自然杀伤T细胞(NKT) :CD3-PE/NK1 · 1
[0184] ⑤髓系抑制细胞(MDSC):CDllb-FITC/Ly6C-PE/Ly6G_PeCy 7
[0185] ⑥ Ml 型巨噬细胞：CDl lb-FITC/MHC-II-PE/F4/80-APC
[0186] CDllb-FITC/CDllc-PE/F4/80-APC
[0187] ⑦ M2 型巨噬细胞：CD206-FITC/CD1 lb-PE/F4/80-APC
[0188] ⑧活化的细胞毒性T淋巴细胞:CD3-FITC/CD44-PE/CD8-APC
[0189] ⑨活化的 1 型辅助性 T 细胞:CD3-FITC/CD44-PE/CD4-APC
[0190] 6)4°C 避光，30min;
[0191 ] 7)每管加入1ml的PBS重悬，1500rpm，离心，5min，洗涤2次；
[0192] 8)弃上清，每管加入4%多聚甲醛或者固定缓冲液50-100μ1固定；
[0193] 9)流式细胞仪上机检测(可短时间保存于4°C)。
[0194] 1 · 1 · 3 · 5流式细胞仪检测Treg细胞：
[0195] 1)收取脾脏或肿瘤细胞(不需要刺激，细胞直接用于流式检测），分出空白管，单染 管，同型检测管以及实验管，表面染色:⑶25-FITC/⑶3-Pe-Cy 7/⑶4-APC
[0196] 2)4°C 避光孵育 30min;
[0197] 3)每管加入1ml染色缓冲液SB，1500rpm离心5min，2次（由于胞内染色破膜会对细 胞产生损伤所以要用在PBS加入FBS的SB对细胞加以保护）；
[0?98] 4)弃上清，加入250μ1/管Foxp3Cytof ix/Cytoperm缓冲液(事先按说明说稀释），4 。(:避光透膜，15-20min;
[ΟΙ"] 5)每管加入l-2ml的Permeabilization wash缓冲液（商品化为10倍，使用前用超 纯水稀释为1倍），1800rpm，离心，7min，由于透膜后细胞体积变大，容易丢失，所以增加了细 胞离心的转速与时间；
[0200] 6)封闭：每管加入25μ 1封闭液，4 °C避光，30min;
[0201] 7)加入大鼠抗小鼠荧光抗体Foxp3-PE，并按照说明书在同型管中加入配套的同型 抗体，室温避光30min;
[0202] 8)每管加入1-21111的？61'1116&13；[112&1:;[011?^11缓冲液，1800印111，离心，7111；[11;
[0203] 9)弃上清，每管加入1ml的SB，1800rpm，离心，7min;
[0204] 10)每管加入4%多聚甲醛或者固定缓冲液50-100μ1固定；
[0205] 11)流式细胞仪上机检测(可短时间内保存于4°C)。
[0206] 1.1.3.6流式细胞仪检测细胞毒性T淋巴细胞胞内因子：
[0207] 1)需要检测的细胞加入三联刺激剂(包括PMA，钙离子霉素和BFA)，置于CO2细胞培 养箱中，刺激4-5小时，收取细胞，1500rpm，离心，5min，弃上清；
[0208] 2)加入1ml 1倍的PBS，重悬细胞，1500rpm离心，5min;
[0209] 3)分出空白管，单染管，同型检测管以及实验管，表面染色：
[0210] ①细胞毒性T淋巴细胞：CD3-FITC/CD8a-APC
[0211] ②1 型辅助性 T 细胞:CD3-FITC/CD4-APC
[0212] 4)4°C 避光孵育，30min;
[0213] 5)每管加入1ml染色缓冲液SB，1500rpm离心，5min，2次，弃上清；
[0214] 6)每管加入250μ1/管4%PFA或者固定缓冲液，4°C避光30min或者过夜，固定；
[0215] 7)离心弃上清，每管加入1ml 1倍的Permeabilization wash缓冲液，1800rpm，离 心，7min;
[0216] 7)弃上清，加入250μ1/管1倍的Permeabilization wash缓冲液，4°C避光透膜，15-20min；
[0217] 8)每管加入1ml 的Permeabi lizat ion wash 缓冲液，1800rpm，离心，7min，弃上清；
[0218] 9)封闭：每管加入25μ1封闭液，4°C避光30min;
[0219] 10)加入大鼠抗小鼠荧光抗体IFN-γ-ΡΕ，并按照说明书在同型管中加入配套的同 型抗体，4°C避光，30min;
[0220] 11)每管加入l_2ml的Permeabilization wash缓冲液，1800rpm，离心，7min;
[0221 ] 12)弃上清，每管加入1ml的SB，1800rpm，离心，7min;
[0222] 13)每管加入4%多聚甲醛或者固定缓冲液50-100μ1固定；
[0223] 14)流式细胞仪上机检测(可短时间保存于4°C)。
[0224] 1.1.3.7细胞RNA提取
[0225] 1)将冻存于-80°C冰箱的加有Trizol的细胞取出，室温融化，涡旋15s混合均匀，室 温静置，IOmin;
[0226] 2)每管中加入200μ1氯仿，涡旋后在冰上静置5min(室温亦可以）；
[0227] 3)4°C，12000rpm，离心，15min，小心取上清，移至新的无RNA酶的1.5ml EP管中（注 意不要碰到中间层，用200μ1的枪轻吸）；
[0228] 4)加入与上清同等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，在冰上静置，IOmin;
[0229] 5)4°C，12000rpm，离心，lOmin，弃上清，加入无水乙醇Iml，上下颠倒混勾，4°C， 12000rpm，离心，5min，弃上清，用10μ1的枪吸出残余液体，室温瞭干，约5-10min;
[0230] 6)根据管底沉淀量，加入无RNA酶水，溶解RNA，可长期保存于-80°C ;
[0231 ] 7)提取的RNA检测:琼脂糖凝胶(1 % )电泳，180V，10分钟；
[0232] 8)Nanodrop检测RNA浓度，以便后续实验。
[0233] 1.1.3.8 RNA反转成cDNA
[0234] 1)反转录使用试剂盒，M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen?,by life technologies?)；
[0235] 2)主要反转步骤为:测量所提RNA的浓度(Nanodrop)，用以计算反转用量;RNA样品 上样量一般为2yg，加入随机引物ΙμL，dNTP ΙμL，无RNA酶水补充至13μ1; 65°C，5min;取出， 加入4μ1 的5倍First缓冲液，2μ1 的DTT; 37 °C，2min;取出，冰上加入MLV酶ΙμL; 25°C，IOmin; 37°C，50min;70°C，15min;cDNA放置在-20°C保存。
[0236] 1.1.3.9 实时定量 PCR
[0237] 1)2(^1体系包括：1(^1的9?0?!^8七6^1^1，正反定量引物各0.541(1(^]\〇，。0嫩叫 1，R0X 0·4μ1，超纯水7·6μ1;
[0238] 2)ABI 7500Fast进行实时定量PCR检测。
[0239] 1.1.3.10 组织切片，H&E染色：
[0240] 1.1.3.10.1石蜡包埋，切片：
[0241 ] 1)去黑色素瘤小鼠肿瘤组织，简称直径5_左右小块；
[0242] 2)将肿瘤组织放置于包埋盒中，浸泡在4%多聚甲醛中过夜固定；
[0243] 3)组织脱水:从甲醛中取出包埋盒，流水冲洗30min;随后浸泡于75 %酒精，30min; 85 %酒精，30min; 95 %酒精，过夜；无水酒精Ih 30min;
[0244] 4)组织透明：常温将包埋盒浸泡于二甲苯中，35min;
[0245] 5)组织浸蜡:浸蜡温度60°C，将包埋盒浸泡于蜡缸I中l_2h，随后换至蜡缸II中，继 续浸蜡Ih;
[0246] 6)组织包埋:打开包埋盒，将组织取出，放入预热好的模具中（模具内事先放入少 量溶蜡），包埋盒的盖子放在模具上方，继续添加石蜡，直至包埋盒的盖子也完全浸没于石 蜡中；
[0247] 7)组织冷却:将模具放置4°C冷却，等石蜡完全凝固后，取出模具中包埋好的组织， 常温保存；
[0248] 8)石蜡切片:使用石蜡包埋组织切片机，将肿瘤组织切片，厚度为5μπι，随后将切好 的蜡片放入45°C的温水中，使其自然展开，展开后用玻璃载玻片将蜡片捞起，轻轻甩掉载玻 片上的水，65 °C烤片，3-4h，常温保存。
[0249] 1.1.3.10.2 H&E染色
[0250] 1)切片脱蜡:石蜡切片放置于二甲苯中Ih;
[0251 ] 2)切片水化:将切片从二甲苯中取出，放入无水酒精中，2min ; 95 %酒精，2min ; 85 %酒精，2min; 75 %酒精，2min;蒸馏水冲洗Imin;
[0252] 3)切片染色:将切片放入苏木精中，染色IOmin;自来水冲洗;0.5%伊红染色Imin; 自来水冲洗2-5min;蒸馏水冲洗l-3s;镜检染色效果，如不理想可重复染色；
[0253] 4)切片脱水:将染好的切片放置在75%酒精中，10-308;85%酒精，10-30 8;95%酒 精，30s_lmin;无水酒精，2_3min;镜检；
[0254] 5)透明封藏：将脱水后的切片放置入二甲苯中，15min，取出，在二甲苯湿润状态 下，滴树胶，加盖玻片(注意不要有气泡）；室温晾干，照相，可长期室温保存。
[0255] 1.1.3.11组织切片免疫荧光染色：
[0256] 1)组织包埋切片见1.1.3.10.1;
[0257] 2)切片脱蜡水化见1.1.3.10.2;
[0258] 3)在切片上滴加1-2滴的过氧化氢(3%)，室温孵育lOmin，用于降低内源性过氧化 物酶；
[0259] 4)PBS 洗片 3次，3min/次；
[0260] 5)抗原热修复:切片放入预热的抗原修复液中，微波炉高火模式5min，随后解冻模 式15min，室温冷却；
[0261] 6)封闭：封闭用1 %的BSA，37°C，30min，倾去血清，勿洗；
[0262] 7)滴加 CD206-FITC/CD31-PE(抗体 1:50 稀释），4°C 避光，过夜；
[0263] 8)PBS 漂洗3次，5min/次；
[0264] 9)滴加DAPI;
[0265] 10)滴加PBS，加盖玻片封片，照相。
[0266] 1.1.3.12多细胞因子ELISA检测：
[0267] 黑色素瘤小鼠血清中的IFN-γ，TNF_a，IL-10，IL-1O，N0，IL_2以及IL-12由Bio-Plex细胞因子检测系统进行检测。
[0268] 1.1.3.13肿瘤组织巨噬细胞分选
[0269] 1)分离小鼠肿瘤单个核细胞(过程见1.1.3.3.2);
[0270] 2)细胞悬液中加入大鼠抗小鼠荧光标记抗体，F4/80-FITC，避光，30min;
[0271] 3)加入 1 倍的PBS lml，1500rpm，离心，5min;
[0272] 4)根据细胞数量，用分选缓冲液重悬细胞；
[0273] 3)ArisIII流式细胞仪对标记了 F4/80-FITC的细胞进行分选；
[0274] 4)分选出的细胞用1倍的PBS洗，1500rpm，5min，加入Trizol混匀，-80°C保存，备 用。
[0275] 1.1.4数据处理与统计分析
[0276] 本研究全部数据都来自至少三次独立的实验，实验数据均用means 土 SD表示，均输 入Excel建立数据库，分析采用采用SpSS13.0统计软件。组内比较采用概率计算应用 Student's unpaired t-test,以ρ〈0·05表示差异有统计学意义（*，Ρ〈0·05;**，Ρ〈 0·01;***，Ρ〈0·001)。统计图均由GraphPad Prism Version 5.0(GraphPad Software Inc， San Diego CA)完成。流式数据采用FlowJo 7.6.1software(Tree Star，Inc，USA)进行分 析。
[0277] I. 2 结果
[0278] 1.2.1 FATS基因缺陷后抑制了 B16细胞皮下荷瘤小鼠黑色素瘤的发生发展
[0279] 我们利用黑色素瘤细胞系，B16细胞对C57小鼠进行皮下荷瘤，构建小鼠黑色素瘤 模型，来探究FATS基因在黑色素瘤中的作用。
[0280]异位小鼠黑色素瘤模型：2 X IO5个B16细胞皮下注射到雌性C57BL/6小鼠的右后背 部，包括野生型小鼠（WT)(η = 16)和FATS基因缺陷小鼠（KO)(η = 15 )，每日对小鼠进行观察 记录出瘤情况并测量肿瘤大小至荷瘤第20天。结果显示，FATS基因缺陷的小鼠相较野生型 小鼠，黑色素瘤成瘤率明显降低（图1D，E，P〈0.01)，同时肿瘤的生长速度缓慢，野生型小鼠 最终所成的黑色素瘤体积显著的大于FATS基因缺陷小鼠的黑色素瘤体积（图1A，B，P〈 0.01)。相一致的，FATS基因缺陷小鼠黑色素瘤的最终重量相较野生型小鼠的肿瘤重量也表 现出明显的减少（图IC，P〈0.01)。这些结果表明，FATS基因缺陷显著的抑制了B16细胞小鼠 皮下荷瘤所成的黑色素瘤的发生和发展。
[0281] 1.2.2 FATS基因缺陷后增加了小鼠黑色素瘤组织中的炎性细胞的浸润
[0282] 基于以上所得结果，FATS基因缺陷明显抑制了黑色素瘤的生长，我们猜测，FATS基 因缺陷也许会影响黑色素瘤的肿瘤微环境。因此，我们进一步对野生型小鼠以及FATS基因 缺陷小鼠的肿瘤组织进行了 H&E染色，来检测两组小鼠肿瘤组织中对肿瘤生长具有抑制作 用的炎性细胞的浸润情况。染色如图2所示，与预期结果相一致，FATS基因缺陷后，B16荷瘤 小鼠的黑色素瘤中，肿瘤内部以及肿瘤边缘炎性细胞浸润都明显的增加了。这一结果说明， FATS基因缺陷确实增加了小鼠黑色素瘤中炎性细胞的浸润。
[0283] 1.2.3黑色素瘤小鼠外周免疫器官中，FATS基因缺陷后影响了免疫细胞的比例
[0284] 以上结果表明，FATS基因缺陷后抑制了小鼠黑色素瘤的发生发展可能是通过影响 肿瘤相关的免疫细胞来实现的，为了验证这一猜想，我们进一步检测了两组黑色素瘤小鼠 的外周以及肿瘤组织中的免疫细胞。首先是对黑色素瘤小鼠的外周免疫器官，脾脏进行了 检测。B16荷瘤20天后，处死小鼠，分离小鼠脾脏细胞，流式细胞术分析脾脏细胞中的多种免 疫细胞的情况。结果如图3A-D所示，FATS基因缺陷小鼠相较野生型小鼠，外周免疫器官中总 的T细胞(⑶3+T细胞）以及γδΤ细胞（γ δ+/⑶3+)的数量明显的增加。虽然自然杀伤(NK)细胞 (NK1. Γ)的数量没有明显的差别（图4Α，B)，但是检测NK细胞的活化(NK1.1+/CD44+)程度(平 均荧光强度，MFI)发现，NK细胞活化在FATS基因缺陷小鼠中明显增加（图4C) (CD44阳性是T 细胞和NK细胞活化的标志）。除此之外，在抗肿瘤过程中起主要作用的细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)的比例在FATS缺陷小鼠的脾脏中明显的增加（图5Α，B)，并且其活化水平(CD44)显著 增加，横型框代表⑶44高表达的CTL比例，在FATS基因缺陷小鼠中显著的多于野生型小鼠 (图5C，D)。我们也发现，IFN- γ作为细胞杀伤的重要的效应因子，在FATS基因缺陷小鼠脾脏 中的CTL细胞中表达增加，同时Thl (⑶3+⑶4+IFN- γ +)细胞的比例在FATS缺陷小鼠脾脏中也 有所增加（图6Α，Β)。这些结果提示，在黑色素瘤小鼠的外周免疫器官中，FATS基因缺陷后增 加了抗肿瘤免疫。
[0285] 进一步检测脾脏中对肿瘤生长具有促进作用的免疫细胞，调节性T细胞(Treg，CD3 +CD4+CD25+Foxp +)以及髓系抑制细胞(MDSC，CDllb+Ly6C+Ly6G+)，流式结果发现，虽然MDSC的 比例没有明显的差别（图7C)，但是Treg的比例在FATS缺陷后有了显著的下降（图7A，B)。这 说明FATS基因缺陷对抑制性肿瘤免疫有着抑制作用。
[0286] 1.2.4黑色素瘤小鼠血清中，FATS基因缺陷增加了促进肿瘤杀伤相关的细胞因子
[0287] 研究表明，IL-2可以有效的刺激效应T细胞和NK细胞的增殖，是T细胞增殖重要的 细胞因子，也是一个重要的生长因子，参与着抗原激活的淋巴细胞的增殖以及免疫记忆的 产生。同时，IL-12的产生可以促进T细胞的增殖和NK细胞的活化，诱导Th 1细胞极化以及CTL 的产生，还可以抑制血管生成。IL-12可由Ml型巨噬细胞产生，Ml型巨噬细胞也可以分泌IL-1β和TNF-α介导肿瘤细胞的溶解。亦有研究报道，IFN-γ产生的增加可以促进Ml型巨噬细 胞，也可以抑制血管生成并促进抗肿瘤免疫监视。而抑制免疫的细胞因子(例如IL-10)可由 免疫抑制细胞(M2型巨噬，Treg等)产生，对肿瘤起到促进的作用。基于诸多已有的研究，为 了深入探究FATS基因在小鼠黑色素瘤中的作用，我们对Β16皮下荷瘤的野生型以及FATS基 因缺陷小鼠的血清进行了多细胞因子ELISA检测，结果如图8所示，IL-2，IL-12在FATS基因 缺陷的黑色素瘤小鼠血清中明显升高，这与FATS基因缺陷后小鼠T细胞比例增加相一致。除 此，IL-li3，TNF_a以及IFN-γ也明显增加，进一步的，参与促肿瘤的免疫抑制因子IL-10在 FATS基因缺陷小鼠血清中显著减少。这些结果表明，FATS基因缺陷可能影响了黑色素瘤小 鼠的免疫细胞的比例和功能，从而对黑色素瘤的发生发展产生了抑制作用，这与我们已得 的实验结果相一致。
[0288] 1.2.5 FATS基因缺陷显著影响了黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中的免疫细胞
[0289] 以上的研究结果表明，FATS基因可能在免疫调节中具有重要的作用，从而影响了 肿瘤的发生发展过程。我们知道，除去外周免疫器官，在肿瘤的发生发展中，起到更为关键 作用的，是肿瘤的免疫微环境。目前已知，肿瘤微环境中的免疫细胞可以影响肿瘤的发生， 发展，侵袭与最终的结果。免疫细胞从外周迀移进入肿瘤组织，在肿瘤环境中亦会产生一些 变化。肿瘤不仅可以通过多种机制逃避免疫系统，还可以改变浸润在肿瘤微环境中的免疫 细胞的功能来创造一个有利于肿瘤生长的环境，例如巨噬细胞，在肿瘤环境中可被极化转 变为M2型巨噬细胞，丧失杀伤能力(Ml型巨噬细胞），产生免疫抑制作用(对肿瘤杀伤的效应 细胞产生抑制），促进肿瘤的生长。相反的，肿瘤环境中具有抗肿瘤的效应T细胞(例如CTL， Thl)可与具有抗原呈递功能的细胞(例如Ml型巨噬细胞)相互作用，导致进一步的增值与活 化，同时也反过来促进Ml型巨噬细胞，产生抗肿瘤免疫。因此，为了深入全面的探究FATS基 因在小鼠黑色素瘤中的作用，我们进一步检测了野生型小鼠和FATS基因缺陷小鼠黑色素瘤 肿瘤微环境中的免疫细胞变化。
[0290] B16细胞皮下荷瘤20天后，取两组小鼠的肿瘤组织，分离出单个核细胞，流式细胞 术检测多种免疫细胞在FATS基因缺陷小鼠以及野生型小鼠黑色素瘤的肿瘤微环境中的情 况。
[0291] 首先，我们对具有肿瘤抑制作用的免疫细胞，CTUNKT以及γ δΤ细胞的比例变化进 行了分析，结果如图9-10所示:与野生型小鼠相比，FATS基因缺陷小鼠黑色素瘤肿瘤微环境 中的总的T细胞（图9Α，Β)，具有肿瘤杀伤功能的CTL(图9C，D)显著增加，同时，NK(图10Α，Β) 以及γ对（图l〇C，D)细胞比例也显著的增加，且相较脾脏免疫细胞比例的增加更为明显，除 此，NK T细胞的比例（图10右上格)在FATS基因缺陷小鼠中也有了增加。由此可知，FATS基因 缺陷增强了黑色素瘤小鼠肿瘤免疫微环境中的肿瘤免疫杀伤。
[0292] T细胞的活化在肿瘤过程中至关重要，活化的CTL细胞具有强大的直接肿瘤细胞杀 伤能力。我们以上的结果发现，在肿瘤环境中，CTL细胞的比例明显的增加，在分析外周脾脏 时我们已经发现，CTL的比例和活化程度都在FATS基因缺陷后有了增加，那么，随后我们思 考，CTL的活化是否也在FATS基因缺陷后增强?于是，我们利用⑶44染色分析了 CTL细胞在肿 瘤微环境中的活化程度。结果表明，在黑色素瘤肿瘤微环境中，FATS缺陷小鼠的CTL活化程 度明显增加，横型框代表⑶44高表达的CTL比例，在FATS基因缺陷小鼠中，CD44基本全部表 现出高的表达程度，这说明FATS基因缺陷后极大的活化了 CTL细胞（图11A，B)。这一结果证 明，FATS基因缺陷使得CTL的活化增强，这与FATS基因缺陷的小鼠所表现出的肿瘤抑制作用 相一致。亦有实验研究证明，IFN-γ作为细胞杀伤的重要的效应因子参与肿瘤杀伤和免疫 监视，所以我们进一步的，通过检测CTL细胞中的IFN- γ的表达情况分析FATS基因缺陷小鼠 与野生型小鼠肿瘤微环境中的CTL对肿瘤细胞的杀伤能力，同时也对Thl (⑶3+⑶4+IFN-y+) 细胞进行了检测。实验结果显示，在FATS基因缺陷小鼠肿瘤微环境中的CTL细胞表达的IFN-γ显著增加（图12A)，同时Thl(CD3+CD4+IFN-Y +)细胞的比例在FATS缺陷小鼠肿瘤微环境中 也了显著增加（图12B)，且比例增高的程度明显高于脾脏中的比例。
[0293] 此外，我们还分析了黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中对肿瘤生长具有促进作用的免疫 细胞，Treg以及MDSC，结果如图13所示，FATS基因缺陷小鼠的黑色素瘤肿瘤微环境中的Treg 细胞相较野生型小鼠显著的减少，且减少成都明显多于黑色素瘤小鼠外周免疫器官（图 13A，B)，而MDSC的比例没有显著的差异（图13C)。这一结果与脾脏检测结果相一致，显示了 FATS基因缺陷对于促进肿瘤的抑制性免疫具有明显的抑制作用。
[0294] 肿瘤是由恶性细胞以及正常的基质细胞所组成的，微环境中包括了数量众多的巨 噬细胞，这些巨噬细胞被称之为肿瘤相关的巨噬细胞(ΤΑΜ)。这些巨噬细胞可以通过细胞毒 性，细胞溶解或者抗原呈递激活肿瘤杀伤的T细胞来抑制肿瘤的生长。然而，在大多数情况 下，TAM会发生某一种改变来协助恶性的细胞生长，侵袭以及逃避凋亡。一些文献已经报道， 巨噬细胞在肿瘤微环境中具有非常重要的作用，目前主要的TAM被认为是M2(⑶llb+F4/80 + CD206+)型的巨噬细胞。M2型巨噬细胞可以促进肿瘤的血管生成，侵袭和转移。它们同时也 可以通过产生IL-IO来促进免疫抑制。M2型巨噬细胞表达CCL22,招募Treg细胞来抑制CTL的 功能。M2型巨噬细胞在维持肿瘤细胞生长，存活和转移中起着至关重要的作用。而与之功能 相反的为Ml (⑶llb+F4/80+MHC-n + )型巨噬细胞，Ml型巨噬细胞表达MHC-II分子，表现出吞 噬以及抗原提呈的能力，产生iNOS2，IL-li3以及TNF-α等介导肿瘤细胞的细胞溶解，来发挥 着细胞杀伤的功能。Ml型巨噬细胞产生IL-12,促进肿瘤中T细胞的活化和增殖，抑制血管生 成，同时也可以将抗原交叉提呈给⑶8+T细胞。Ml型巨噬细胞也可以激活Thl型应答。也就是 说，Ml型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化最终会导致肿瘤生长的促进。因此，基于巨噬细胞不 同亚型在肿瘤中相反的作用，使得在肿瘤微环境中对巨噬细胞亚型的检测显得尤为重要。
[0295] 我们利用流式细胞染色分析了 FATS基因缺陷后黑色素瘤小鼠肿瘤微环境中的巨 噬细胞分型情况。结果如图14显示，FATS基因缺陷的小鼠黑色素瘤肿瘤微环境中Ml巨噬细 胞的比例显著的增加（图14A，B)，而M2型巨噬细胞比例则显著的减少（图14C，D)。此外，我们 用⑶206-FITC(⑶206为M2型巨噬细胞的重要表面标记)对肿瘤组织切片进行了免疫荧光染 色，发现野生型小鼠肿瘤中的CD206显著多于FATS基因缺陷小鼠（图14E)。由此，我们的结果 表明，在黑色素瘤肿瘤微环境中，FATS基因缺陷后，具有抑制肿瘤功能的Ml型巨噬细胞比例 显著升高，而具有促瘤作用的M2型巨噬细胞的比例显著下降，这些结果与FATS基因缺陷小 鼠肿瘤生长受抑制的现象相一致。
[0296] 为了进一步的验证以上所得到的，关于巨噬细胞亚型在肿瘤微环境中显著变化的 结果，我们流式分选了肿瘤组织中的巨噬细胞(F4/80阳性），提取RNA，利用实时定量PCR，检 测了 Ml型和M2型巨噬细胞所表达的重要基因的表达情况，同时也对Ml型巨噬细胞极化重要 的细胞因子的基因表达进行了检测。结果如图15所示，Ml型巨噬细胞所表达基因，IL-12， TNFa和N0S2的基因表达在FATS基因缺陷小鼠的巨噬细胞中增加（图15A )，而M2型巨噬细胞 表达基因几-10 48^，1^1(〇)206)以及0(^22降低（图158)。除此，我们还发现^六了3基因缺 陷小鼠肿瘤组织中巨噬细胞表达VEGF的量明显下降。这些结果都进一步证明，FATS基因缺 陷的小鼠巨噬细胞更倾向于分化为具有抑制血管生成，促进肿瘤杀伤的Ml型巨噬细胞，并 且FATS基因缺陷显著抑制了促进血管生成，促进肿瘤生长的M2型巨噬细胞的转化。
[0297] 1.2.6 FATS基因缺陷抑制了小鼠肿瘤组织中的血管生成
[0298] 由于血管生成在肿瘤的生长中有着极为重要的作用，血管的生成可以为肿瘤细胞 输送营养，并且协助肿瘤的转移。已有大量的研究报道，Ml型巨噬细胞可以分泌IL-12,抑制 血管生成，而M2型巨噬细胞则可以通过分泌VEGF促进血管生成，促进肿瘤的生长于转移。我 们的实验结果发现，FATS基因缺陷的小鼠肿瘤微环境中主要存在的巨噬细胞为Ml型巨噬细 胞，比例原大于野生型小鼠，同时巨噬细胞表达的VEGF的量也在FATS缺陷后显著减少。由 此，我们猜测，FATS基因缺陷后肿瘤的血管生成是否减少。于是我们利用免疫荧光，检测了 FATS基因缺陷小鼠与野生型小鼠肿瘤组织中的⑶31的表达情况。与预期相一致，相比野生 型小鼠，FATS基因缺陷小鼠肿瘤组织中的⑶31显著的减少（图16)，白色箭头所指的红色点 为⑶31阳性，蓝色背景为DAPI染色显示的细胞核。这一结果说明，FATS基因缺陷后可能通过 影响巨噬细胞的极化，从而影响了肿瘤的血管生成，最终对肿瘤的生长产生了抑制作用。
[0299] 1.3讨论
[0300] 近些年来，肿瘤免疫在肿瘤中的作用受到了越来越多的关注。肿瘤的免疫治疗可 以特异的破坏肿瘤细胞，免疫系统的功能水平与肿瘤的治疗以及预后有着密切的关系。诸 多研究结果显示，肿瘤微环境已经成为目前抗肿瘤免疫治疗的重要靶点。
[0301] 肿瘤微环境由肿瘤实质细胞和肿瘤间质细胞组成，其中，间质细胞中的免疫细胞 在肿瘤的发生发展中有着不可或缺的作用。不同的免疫细胞相互作用，例如抗原提呈以及 细胞间通过细胞因子协同或抑制，来影响肿瘤的生长。免疫细胞相互协调，发挥着抵抗病原 菌与肿瘤的作用，然而，肿瘤却通过改变浸润在肿瘤微环境中的免疫细胞的功能来创造一 个有利于肿瘤生长的环境，逃避免疫监视，产生肿瘤细胞的免疫逃逸。
[0302] 目前研究表明，免疫系统存在着促进肿瘤与抑制肿瘤的双重作用。上文已经提到， NK细胞，中性粒细胞，γ δΤ细胞，NKT细胞，Th 1细胞，CTL和以及Ml型巨噬细胞，可以对肿瘤产 生强的杀伤作用。
[0303] NK细胞以及中性粒细胞是固有免疫应答细胞，分别通过穿孔素，颗粒酶以及Fas/ FasL以及活性氧等杀伤机制对肿瘤进行直接的抑制。同时，γ δΤ细胞以及NK T细胞也直接 或间接的对肿瘤细胞产生杀伤作用，在抗肿瘤免疫中发挥着作用。除此之外，诸多研究证 明，T细胞在肿瘤免疫中发挥着至关重要的作用，初始T细胞可以识别抗原提呈细胞表面的 MHC分子所提呈的短肽进而分化为不同的效应T细胞。CD4+T细胞可以识别MHC-II提呈的抗 原肽，CD8+T细胞可以识别MHC-I提呈的抗原肽。初始的CD4+T细胞经抗原提呈后，根据活化过 程中微环境里存在的细胞因子不同，分化为不同亚型的效应辅助性T细胞。辅助性T细胞分 化过程中所分泌的细胞因子又可以影响NK细胞，CTL细胞的细胞的活化。辅助性T细胞包括 Th l，Th 2和Th 17等，它们在肿瘤中有着不同的作用。Th 1细胞产生IFN-γ和几种其他的 细胞因子可以显著的促进细胞介导的免疫应答，发挥着细胞毒性作用，对肿瘤的生长起到 抑制的作用。越来越多的证据提示，Th 1细胞的活化可以促进CTL的增殖，NK细胞，Ml型巨噬 细胞以及其他具有潜在细胞毒性的效应细胞的活化。另外，CTL是抗肿瘤免疫中的重要的效 应细胞，经过抗原提呈，CTL细胞表现出直接的细胞介导的肿瘤细胞毒性反应。
[0304]我们的研究结果发现，B16细胞荷瘤后，FATS基因缺陷小鼠的肿瘤发生率低且成瘤 后肿瘤生长缓慢(图1)，这提示我们，FATS基因缺陷很可能影响了肿瘤中肿瘤相关的免疫细 胞。于是我们全面的分析了野生型小鼠与FATS基因缺陷小鼠外周免疫器官和肿瘤免疫微环 境中免疫细胞的变化。与已知的研究结果相一致，FATS基因缺陷小鼠抗肿瘤免疫细胞的比 例显著的增加，在肿瘤微环境中增加的最为明显，这就说明，FATS基因缺陷对肿瘤相关的免 疫细胞确实存在着重要的影响。FATS基因缺陷小鼠肿瘤浸润的炎性细胞明显增加（图2 )，这 与流式检测发现的肿瘤中总T细胞比例增加相一致（图9)。进一步的，FATS基因缺陷后，γ δΤ 细胞，NK细胞比例增加（图10)。更为重要的，主要的效应T细胞，Th 1以及CTL的比例也显著的 增加（图9，图12 )，同时，T细胞的活化标记⑶44以及主要效应细胞因子IFN- γ的比例在CTL 细胞中显著的增加（图11，图⑵。这些结果提示，FATS基因缺陷显著的增加了肿瘤细胞毒性 应答，这与FATS基因缺陷小鼠黑色素瘤抑制的结果相吻合。
[0305]我们进一步的实验发现，FATS基因缺陷小鼠肿瘤微环境中Ml型巨噬细胞的数量显 著的增多（图14)。近些年来，随着对巨噬细胞分型研究的深入，Ml型巨噬细胞肿瘤中的作用 被越来越重视。众所周知，肿瘤相关的巨噬细胞是组成肿瘤微环境中的主要细胞之一，对肿 瘤的生长有着十分重要的影响作用。研究发现，Ml型巨噬细胞表达MHC-II分子，表现出吞噬 以及抗原提呈的能力。同时，Ml型巨噬细胞可以产生促炎性细胞因子，iN0S2，R0S，RNSJL-l β以及TNF-α介导肿瘤细胞的细胞溶解，来发挥着细胞杀伤的功能。Ml型巨噬细胞产生IL-2 以及IL-12，IL-2可以刺激活化的效应T细胞和NK细胞的增殖，是一个重要的生长因子，参与 着抗原激活的淋巴细胞的增殖以及免疫记忆的产生，而IL-12能够促进表达IL-12受体的T， NK以及NK T细胞分泌IFN-γ，诱导Thl细胞极化以及CTL的产生，而IFN-γ的增加又可以正 反馈调节进一步促使Ml型巨噬细胞活性增强，同时IFN-γ可以促进抗肿瘤监视，抑制癌基 因活化以及抑制血管生成，也有研究发现，IL-12同样表现出抗血管生成的活性。不仅如此， Ml型巨噬细胞也可以将抗原交叉提呈给⑶8+Τ细胞。由此，Ml型巨噬细胞极化在抗肿瘤免疫 中的作用极为重要，有效的结合了抗肿瘤免疫需要的固有免疫与适应性免疫应答。
[0306]除去对肿瘤具有杀伤的免疫细胞，肿瘤微环境中也存在着对肿瘤具有促进作用的 免疫细胞。M2型巨噬细胞，MDCS，Treg等免疫抑制细胞可以抑制抗肿瘤免疫反应，使得侵袭 性的肿瘤细胞逃避免疫监视，对抗肿瘤免疫应答形成了阻碍。
[0307] MDSC是由多种未成熟的髓系细胞组成，具有免疫抑制的功能。MDSC可以通过精氨 酸酶-1，抑制T细胞的功能。同时，MDSC含有的iNOS能抑制T细胞反应。此外，MDSC也可以通过 ROS来抑制T细胞的活化。除此，MDSC干扰IL-2受体信号，阻碍淋巴细胞运输，促进Treg的活 化，同时可以产生IL-10和TGF-β，对Treg具有诱导作用。Treg在癌症病人比例增加，研究发 现，在肿瘤微环境中有大量的Treg细胞的浸润。Treg细胞表达一系列的抑制分子，例如儿-10，TGF-β，LAG-3，GITR，CTLA-4和PD-1，这些因子可以直接抑制免疫细胞。并且，Tr eg可以抑 制效应T细胞的细胞毒性反应，促进效应T细胞的凋亡。IL-2是活化的效应T细胞存活所必须 的，Tr eg细胞页可以耗尽局部的IL-2，间接的抑制效应T细胞。
[0308] 与Ml型细胞相对，M2型巨噬细胞促进肿瘤的血管生成，侵袭和转移。M2型巨噬细胞 表达的CCL22对Treg细胞有招募作用，Treg进一步的抑制CTL的功能，同时，M2型巨噬细胞也 可以通过产生TGF-β和IL-10，将T细胞诱导为Treg或者其他不具有抗瘤活性的T细胞亚型。 M2型巨噬细胞特异性的表达精氨酸酶-1对T细胞的活化进行抑制。M2型巨噬细胞所表达的 精氨酸酶-I(Arg-I)，可以使精氨酸变为鸟氨酸，不再产生N0,降低了巨噬细胞的杀伤功能。 M2型巨噬细胞在维持肿瘤细胞生长，存活和转移中起着非常重要的作用。
[0309] 基于以上理论，我们的实验进一步检测分析了肿瘤免疫微环境中免疫抑制细胞的 比例，对FATS基因缺陷调节肿瘤免疫有了更全面的研究。与已有的研究结果相一致，我们的 实验结果显示，在FATS基因缺陷小鼠的肿瘤微环境中，虽然MDSC的比例在两组小鼠中没有 显著的差异，但是Treg细胞的比例显著的降低（图13)，这说明在FATS基因缺陷小鼠中，促进 肿瘤生长的免疫应答被抑制。有趣的是，M2型巨噬细胞的检测发现，FATS基因缺陷小鼠M2型 巨噬细胞比例显著的低于野生型小鼠的M2型巨噬细胞，免疫荧光染色也得到了一致的结果 (图14)，这一结果提示，FATS基因缺陷小鼠的肿瘤微环境中，存在着巨噬细胞极化的不同， 也就是说，FATS基因缺陷可能显著的促进了抗肿瘤免疫的Ml型巨噬细胞的极化，抑制了 M2 型巨噬细胞的极化。
[0310] 我们知道，肿瘤免疫微环境中，巨噬细胞极化的不同(M1/M2)对肿瘤的发生发展中 有着深远的影响。一些研究显示，肿瘤中的巨噬细胞与无菌伤口中的巨噬细胞功能相似，并 没有表现出杀伤活性，具有促进生长的作用。随着研究的深入，最近的研究提示，巨噬细胞 根据免疫条件的不同，可以极化为不同表型的巨噬细胞，也就是说，微环境的刺激可以使巨 噬细胞极化为Ml型，也可以极化为M2型巨噬细胞，当肿瘤免疫微环境中的M2型巨噬细胞被 调节，转变为Ml型巨噬细胞时，肿瘤生长就会受到明显的抑制。在人类肿瘤与不同的小鼠肿 瘤模型的研究中均已经发现，将巨噬细胞表型由促肿瘤的M2型转变为抗肿瘤的Ml型，可以 显著的抑制肿瘤的生长。
[0311 ] 在本次研究中，FATS基因缺陷小鼠的巨噬细胞中Ml型巨噬细胞表达IL-12，TNF-α， N0S2明显高于野生型小鼠，同时M2型巨噬细胞表达的六找-1，1代1以及〇(^22在野生型小鼠 中明显高于FATS基因缺陷小鼠（图15)。肿瘤小鼠的血清ELISA检测也发现，Ml型巨噬细胞分 泌的IL-Ιβ，TNF-a，IL-12以及促进正反馈Ml巨噬细胞活化的IFN- γ在FATS基因缺陷小鼠中 显著增加，同时，M2型巨噬细胞所分泌的IL-IO的含量下降（图8)。这些结果都提示，FATS基 因缺陷后，小鼠肿瘤微环境中的巨噬细胞更倾向于极化为对肿瘤有抑制作用的Ml杀伤型巨 噬细胞，Ml型巨噬细胞的增加，M2型巨噬细胞的减少是FATS基因缺陷后抑制黑色素瘤生长 的潜在的细胞机制。研究显示，Ml型巨噬细胞通过多种机制对血管生成有着显著的抑制作 用，而M2型巨噬细胞则会明显的促进血管生成，这也是肿瘤能得以生长的必要因素，我们的 结果发现，FATS基因缺陷小鼠肿瘤中巨噬细胞表达VEGF的量显著下降，肿瘤切片CD31染色 显示了一致的结果，FATS基因缺陷小鼠肿瘤组织中⑶31表达极低（图16)。这也就是说，FATS 基因缺陷对黑色素瘤的抑制可能是通过促进Ml型巨噬细胞极化，直接杀伤肿瘤细胞，一致 肿瘤组织血管生成，并促进细胞毒性T细胞的增殖，对肿瘤进一步的抑制和杀伤。
[0312] 我们的结果提示，肿瘤效应的T细胞比例的增加与Μ1/Μ2型巨噬细胞极化的改变可 能是FATS基因缺陷后抑制小鼠黑色素瘤生长的可能原因，为我们进一步的FATS基因影响黑 色素瘤的机制研究提供了有力依据。
[0313] 二、FATS基因缺陷对小鼠黑色素瘤调节作用的细胞与分子机制
[0314] 2.1对象和方法
[0315] 2.1.1主要材料、试剂与仪器设备
[0316] 2.1.1.1主要试剂 DMEM培养液 美国GIBCO公司 RPMI 1640培养液 美国GIBCO公司 胎牛血清（FBS) 美国GIBCO公司 双抗 rPeniciIIin-Strcptomycin) N GIBCO 公），'J 0.25%胰蛋白酶+EDTA 美国GIBCO公司 磷酸盐缓冲液（PBS) 上海索来宝公司 二甲基亚砜（DMSO ) 美国Sigma公司 麻醉药 美国Sigma公司 巯基乙醇酸盐（TG) 美国BD公司 Permeabilizaiion wash 缓丨1Ii液 .Ail 丨、:i eBioscience 公）丨1
[0317]固定缓冲液（Fixationbuffer) 美国 eBioscience 公司 细胞凋亡检测试剂盒：AnnexinVM 中国三箭生物公司 assay kil NO检测试剂盒 中国碧云天公司 IL-2 ELISA检测试剂盒 中国联科生物公司 CFSE 美国 Iiwitrogen 公司 TRIZOL 美国 Invitrogen 公司 M-MLV Reverse Transcriptase .? 丨丨;:丨 Irivitrogen 公nj Rca丨-丨 imePCR 定丨 i i: U 剂;?? BDI 003?? 德国美天旎公司 多聚甲酸（PFA) 美国Sigma公司 Radio-inimunoprecipilaiion assay burfer -X:丨丨、:丨 Sigma 公.丨丨I (RIPA) FJhcnyimclhancsulIbnyl iluoridc (PMSF) :I.丨;:丨 Sigma 公 Wj QPI 美国Sigma公司
[0318] 脂多糖（LPS ) 美国Sigma公司 脱脂奶粉 天津博美科生物技术有限公司 Bradford蛋白定量试剂盒 北京博迈德科技发展有限公司
[0319] 2.1.1.2 细胞系
[0320] B16 细胞
[0321] 2.1.1.3细胞因子
[0322] M-CSF 美国 R&D 公司
[0323] IL-4 美国 R&D 公司
[0324] IFN-γ 美国R&D公司
[0325] 2.1.1.4抗体 Clcavcd-caspase 3 戈 I i;:i Cell Signaling Technology 公 Be丨2 -.XiN Proicdi 公）丨I P65 ..λ? I 丨;:丨 Cell Signaling Techno丨ogy 公）ij !κΒα .? I 卜:丨 Cell Signaling Technologv 公i'J
[0326] β-actm 中国三箭生物公司 HistoneS 中国三箭生物公司 HRP-coniUgalccl goal anti-mouse IgG Ah 戈丨丨、:丨 Cell Signaling Technology 公）【.J HRP-conjugatcd goat anti-rabbit IgG Ab .Ji 11':丨 Cell Signaling Technology 公！「J
[0327] 2.1.1.5引物序列
[0329] 2.1.1.6主要仪器 超净工作台 苏净安泰公司 倒置显微镜 日本Olympus公司 细胞培养板. 美国Coming公司 細胞培养皿 美国Coming公司 一次性15ml/50ml离心管 美国Coming公司 二氧化碳細胞培养箱 Sanyo公司 Iml注射器 上海治宇医疗器械有限公司 细胞过滤器（40 μπι) 美国BD公司
[0330] Eppendorf5804 高速离心机 美国 Eppendorf 公司 Eppendorf5804迷你离心机 美国Eppendorf公司 FACSC6流式细胞仪 美国BD公司 超微量核酸蛋白含量测定仪 美国Thermo Scientific公司 凝胶成像系统 BIORAD 96孔O.lmL的实时定量PCR板 ABI公司 酶标仪 美国BiotekEpoch PVDF膜 瑞士 Roche公司 电泳仪DYY-6C型 北京市六一仪器厂
[0331] 2.1.2试剂配制
[0332] 2.1.2.1 0.01M PBS：
[0333] 分别称取 Na2HP〇4(1.54g)，KH2P〇4(0.2g)，NaCl(8.0g)，KCl(0.2g)，加入到超纯水 中，充分溶解，定容至100mL，调节PH值(7.2-7.4)。高压灭菌，于4°C冰箱保存备用。
[0334] 2.1.2.2配制CFSE:
[0335] 1)CFSE是一种荧光染料，可以穿透细胞膜，经常被用来检测细胞的增殖情况本身 并不带有荧光的CFSE在标记细胞后，细胞内的醋酶将其分解，从而产生高强度的荧光。这种 荧光产物可以与细胞内的氨基结合，并长时间存留与胞内。随着细胞的分裂，CFSE被平均分 配至子代细胞中，随之子代细胞的荧光强度下降为母代细胞的一半。因此，CFSE荧光强度的 高低直接与细胞分裂的次数相关。
[0336] 2)将Img的CFSE溶解于1，800μ1的DMSO中，分装并于-20°C进行保存。使用时，可用 无血清培养基，1倍PBS或其他缓冲液将其稀释使用(具体浓度根据实验要求而定）。
[0337] 2.1.2.3抗体稀释液：
[0338] 1)抗体稀释液的组成成分为0.2 %牛血清白蛋白（BSA)，0.1 %叠氮钠(NaN3)以及1 倍 PBS;
[0339] 2)将称取的0.2mg BSA和吸取的Iml 10%的NaN3加入到100mL的1倍PBS中，搅拌， 使其完全溶解，于4 °C冰箱保存备用。
[0340] 2.1.2.4 4%多聚甲醛：
[0341] 1)称取2g多聚甲醛加入到45ml超纯水中，加入lmol/L的NaOH;
[0342] 2)56°C过夜使其完全溶解；
[0343] 3)冷却至室温后，加入5ml 10倍PBS;
[0344] 4)加入lmol/L的CaCl2和MgCl2各50ul;
[0345] 5)将PH值调至7.3，4°C避光保存。
[0346] 2 · 1 · 2 · 5细胞磁珠分选用的缓冲液(0 · 5%BSA/PBS):
[0347] 1)分选用缓冲液组成成分为BSA和HfPBS
[0348] 2)配制10%BSA，用1倍PBS稀释20倍，4°C保存备用。
[0349] 2.1.2.6 RIPA裂解液：
[0350] I )RIPA的组成成分为50mmol/L的Tris(Mff 121 · 14，PH7 · 5)，150mmol/L的NaCl，1 % Tr i tonX-100，I % 脱氧胆酸钠以及0 · I % SDS;
[0351] 2)称取Tris 3.02g，NaCl 4.38g，TritonX-100 5ml，脱氧胆酸钠5g，SDS 0.5g，加 超纯水至500ml，调节pH值，至7.5。充分混匀后，保存于4°C备用，长期保存则应存于_20°C ; [0352] 3)使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。
[0353] 2.1.2.7蛋白酶抑制剂：
[0354] 1)蛋白酶抑制剂cooktail，所需母液成分：
[0355] ①lOOmmol/L的PMSF:称取17 · 4mg的PMSF，加入1ml的异丙醇。充分溶解后，分装于 1.5ml离心管中，于-20°C保存；
[0356] @抑肽素六口1'〇1:;[11；[11(211^/1111):保存于4<€;
[0357] 2)配制：
[0358] ①PMSF:终浓度为lmmol/L，即母液稀释100倍使用；
[0359] ②Aprotinin :终浓度为lμg/ml，即母液稀释2000倍使用。
[0360] 2.1.2.8免疫印迹上样用试剂：
[0361 ] 1)浓缩上样缓冲液(4倍）：
[0362] 将0.8g SDS，0.04g溴酚蓝，4ml甘油以及 1.0mol/L的Tris-HC1(PH 6.8)加入到去 离子水中，定容至IOml，充分混匀后，分装于1.5ml EP管中，保存于4°C，使用时需稀释为1 倍。
[0363] 2) 1.0 mol/L的二硫苏糖醇(DTT，10倍浓缩液）：
[0364] 将3.09g DTT溶解于20ml的O.OlmoVL乙酸钠溶液(PH为5.2)中，分装于1.5ml EP 管中，保存于_20°C，使用时需稀释为1倍。
[0365] 2.1.2.9配胶用工作液
[0366] 1)浓缩胶缓冲液（1.0mol/L Tris-HCl，pH 6.8)
[0367] 将12.114g Tris(MW121.14)加入到100ml蒸馏水中，充分溶解后，加入浓盐酸将PH 值调至6.8,保存于4°C备用；
[0368] 2)分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl，pH 8.8):
[0369] 将18.671g Tris(MW121.14)加入到100ml蒸馏水中，充分溶解后，加入浓盐酸将PH 值调至8.8,保存于4°C备用；
[0370] 3)10%十二烷基硫酸钠（SDS):
[0371] 将IOg SDS加入到IOOrnl蒸馏水中，充分溶解，如溶解时困难，可于50°C下水浴溶 解，保存于室温。长期保存过程中出现沉淀，只需水浴溶解，不影响使用。
[0372] 4) 10%过硫酸铵(AP):
[0373] 将0.1 g过硫酸胺加入到Iml蒸馏水中，充分溶解，分装于0.2ml EP管中，保存于-20 cC。
[0374] 5)30%丙烯酰胺:保存于4°C。
[0375] 6)四甲基乙二胺原液(TEMED):保存于4°C。
[0376] 2.1.2.10免疫印迹所用缓冲液
[0377] 1)跑胶缓冲液：
[0378] 10倍浓缩电泳液缓冲液，称取144g的甘氨酸，30.2g的Tris_base，10g的SDS，充分 溶解于超纯水中，定容至1L，室温保存，使用时稀释为1倍。
[0379] 2)转膜缓冲液：
[0380] 1倍转膜缓冲液，称取14.4g的甘氨酸和3.02g的Tris-base，充分溶解于超纯水中， 定容至800ml，加入甲醇200ml使用。
[0381] 3) 10倍TBS缓冲液：
[0382] 10倍浓缩TBS缓冲液，称取80g的NaCl和24.2g的Tris-base，充分溶解于超纯水中， 定容至IL，使用浓盐酸调节PH值，7.6,室温保存。
[0383] 4)1倍TBST缓冲液：
[0384] 吸取100ml 10倍的浓缩TBS缓冲液，加入超纯水，定容至1L，最后加入Tween-20,充 分混匀；由于Tween-20较为粘稠，吸取时应非常缓慢，防止产生气泡，溶解时要不断用玻璃 棒搅动，以防Tween-20迅速沉于烧杯底部;室温保存备用。
[0385] 5)封闭液/抗体稀释液(5%脱脂牛奶）：
[0386] 称取脱脂奶粉5g，充分溶解于100mL的1倍TBST缓冲液中，一周内使用可保存于4 °C，长期保存可放于-20°c。
[0387] 2.1.3实验方法
[0388] 2.1.3.1异位小鼠黑色素瘤模型构建(具体步骤详见1.1.3.2.2)
[0389] 1)脱去小鼠右后背部的毛脱去，用75%酒精对小鼠注射部位进行消毒；
[0390] 2)将B16细胞悬液(2X106/ml)注射到小鼠右后背部（100μΙ/只）
[0391] 3)荷瘤后20天，麻醉后脱颈处死小鼠，分离小鼠的肿瘤组织，用于分选巨噬细胞。
[0392] 2.1.3.2巨噬细胞与T细胞混合细胞培养：
[0393] 2.1.3.2.1肿瘤组织巨噬细胞分选
[0394] 1)分离小鼠肿瘤单个核细胞(具体过程详见1.1.3.3.2);
[0395] 2)细胞悬液中加入大鼠抗小鼠荧光标记抗体，F4/80-FITC;
[0396] 3)Aris III流式细胞仪对标记了F4/80-FITC的细胞进行分选；
[0397] 4)培养在含有10%血清的无菌1640培养基中，备用。
[0398] 2 · 1 · 3 · 2 · 2小鼠 CD3+T 细胞分选
[0399] 1)取正常野生型C57小鼠脾脏，分离单个核细胞(具体过程详见1.1.3.3.1);
[0400] 2)细胞计数；
[04011 3)细胞中加入磁珠分选缓冲液3-5ml，300g离心，lOmin，完全吸除上清；
[0402] 4)加入磁珠分选缓冲液(是加入磁珠的10倍体积)和⑶3+磁珠（10μ1/IO7个细胞）， 混匀，4°C，静置15min，中间取出来混匀一次；
[0403] 5)加入磁珠分选缓冲液20ml，300g离心，lOmin，完全吸除上清；
[0404] 6)每IO8个细胞加入500μ1的分选缓冲液，缓慢滴加到预先用分选缓冲液洗过的分 选柱；
[0405] 7)将分选柱放置在无菌的15ml离心管上，加入2ml含有10%FBS的1640培养基，快 速将粘附在柱子上的细胞洗出，计数，洗出的细胞即为CD3+的T细胞，培养备用。注:实验全 程在冰上进行，可提高分选效率。
[0406] 2.1.3.2.3 CFSE染色
[0407] 1)重悬分选的⑶3+T细胞，调整细胞浓度为I X IOfVml;
[0408] 2)每ml细胞中加入2μ1 CFSE贮存液，混匀，终浓度为ΙΟμΜ;
[0409] 3)37°C 孵育，IOmin;
[0410] 4)取出，加入5倍体积的预冷的培养基，终止染色；
[0411] 5)冰上孵育，5min;
[0412] 6)1300rpm，离心，5min;
[0413] 7)用含有 10%FBS 的 1640培养基 1300rpm，离心，5min，洗3次；
[0414] 8)重悬细胞，根据实验需求调整细胞浓度。
[0415] 2.1.3.2.4巨噬细胞与T细胞混合培养
[0416] 1)流式分选出的巨噬细胞用丝裂霉素C(5ygAU)处理，每IX IO6细胞加入丝裂霉 素12.5μ1，在细胞培养箱中培养30min;
[0417] 2)加入含有10%FBS的1640培养基洗3次，细胞计数；
[0418] 3)与⑶3+T细胞共培养4天，巨噬细胞与T细胞比例为1:4,培养中间2-3天补液50-100μΙ；
[0419] 4)培养结束后收取细胞，与直接固定未经传代的母带T细胞一起，流式细胞仪上机 检测CFSE表达情况。
[0420] 2.1.3.3巨噬细胞与Β16细胞混合培养：
[0421] 2 · 1 · 3 · 3 · 1肿瘤组织巨噬细胞分选：
[0422] 具体过程详见2.1.3.2.1
[0423] 2 · 1 · 3 · 3 · 2巨噬细胞与Β16细胞混合培养
[0424] 1)流式分选出的巨噬细胞用丝裂霉素C(5ygAU)处理，每IX IO6细胞加入丝裂霉 素12.5μ1，在细胞培养箱中培养30min;
[0425] 2)加入含有10%FBS的1640培养基洗3次，细胞计数；
[0426] 3)收B16细胞，计数；
[0427] 4)巨噬细胞与B16细胞共培养1天，巨噬细胞与B16细胞比例为40:1;
[0428] 5)培养结束后收取细胞，流式细胞仪上机检测B16细胞的凋亡情况。
[0429] 2丄3.4 T细胞增殖实验
[0430] 1)用抗CD3和CD28的抗体包被48孔板(浓度为抗CD3,5μg/ml;抗CD28，lμg/ml)，4°C 过夜；
[0431 ] 2)分选⑶3阳性T细胞(具体步骤详见2.1.3.2.2);
[0432] 3)细胞计数，CFSE染色(具体步骤详见2.1.3.2.3);
[0433] 4)培养于包被好的46孔板中，每孔IO6个T细胞；
[0434] 5)培养上清为混合了B16培养上清的1640培养基或者是普通1640培养基，培养4 天，流式细胞术检测CFSE的表达情况。
[0435] 2.1.3.4骨髓细胞分离：
[0436] 1)麻醉后，脱颈处死小鼠，用75%酒精消毒双下肢，固定后剪开皮肤，分离肌肉组 织，暴露胫骨，保留两侧关节，将胫骨取出，迅速置于冷的1倍PBS中；
[0437] 2)去掉骨面上残余的组织，置于超净工作台中，沿关节剪开股两端，暴露出髓腔， 用Iml注射器吸取1倍的PBS，将骨髓冲至培养皿中，反复冲洗，直至胫骨全部变为白色；
[0438] 3)用Iml的枪将骨髓吹散至单细胞状态，随后收集细胞悬液至无菌的15ml离心管 中，1000 rpm，离心，5min;
[0439] 4)弃上清，加入 Iml 1 倍的 PBS，1000rpm，离心，5min;
[0440] 5)弃上清，用含有10%FBS的DMEM培养基重悬细胞，培养在细胞培养箱中。
[0441] 2.1.3.5巨噬细胞定向分化：
[0442] 1)分离出的骨髓细胞加入M-CSF (10ng/ml)培养5天，此时的细胞为MO型巨噬细胞 (培养第三天需半量换液）；
[0443] 2)M1型巨噬细胞极化:MO型巨噬细胞加入IFN-γ (20ng/ml)培养12h，随后加入LPS (100ng/ml)继续培养4h，即为Ml型巨噬细胞；
[0444] 3)M2型巨噬细胞极化:MO型巨噬细胞加入IL-4(20ng/ml)培养16h，即为M2型巨噬 细胞。
[0445] 2.1.3.6巨噬细胞分型检测：
[0446] 1)收取待检测的细胞，1500rpm，离心，5min;
[0447] 2)弃上清，加入1ml 1倍的PBS，重悬细胞，1500rpm，离心，5min;
[0448] 3)弃上清，分出空白管，单染管以及同型对照检测管，与检测管一起，加入1倍PBS， 使每管大约1〇〇μ1;
[0449] 4)封闭：每管加入25μ1的流式抗体封闭液，4°C避光，30min;
[0450] 5)表面染色:每管按照实验设计分别加入大鼠抗小鼠荧光标记抗体和同型对照抗 体：
[0451 ]①M1 型巨噬细胞：CD 11 b-F ITC/MHC- II-PE/F4/80-APC
[0452] CDllb-FITC/CDllc-PE/F4/80-APC
[0453] ② M2 型巨噬细胞：CD206-FITC/CDllb-PE/F4/80-APC
[0454] 6)4°C 避光，30min;
[0455] 7)每管加入1ml的1倍PBS重悬，1500rpm，离心，5min，洗涤2次；
[0456] 8)弃上清，每管加入4%多聚甲醛或者固定缓冲液50-100μ1固定；
[0457] 9)流式细胞仪上机检测(短时间可保存于4°C)。
[0458] 2.1.3.7细胞凋亡检测
[0459] 细胞凋亡检测使用的是细胞凋亡检测试剂盒:Annexin V/PI assay kit，主要步 骤包括：
[0460] 1)将试剂盒中的Binding缓冲液用超纯水稀释10倍，备用；
[0461 ] 2)收细胞，用冷的1倍PBS洗一遍（1500rpm，离心，5min);
[0462] 3)弃上清，用Iml稀释的Binding缓冲液重悬细胞，1500rpm，离心，5min;
[0463] 4)分出空白管和两管单染管；
[0464] 5)每管加入5μ1 的Annexin V-FITC/APC，室温避光IOmin;
[0465] 6)每管加入5μ1的PI-PE，室温避光5min;
[0466] 7)每管加入200μ1的Binding缓冲液，流式细胞仪检测（lh之内）。
[0467] 2 · 1 · 3 · 8细胞RNA提取(具体步骤详见1 · 1 · 3 · 7)
[0468] 1)将冻存于-80°C冰箱的加有Trizol的骨髓定向分化的M1/M2型细胞取出，室温融 化，涡旋15s混合均匀，室温静置IOmin;
[0469] 2)每管加入氯仿，静置；
[0470] 3)离心，取上清，移至新的无RNA酶管中；
[0471] 4)加入与上清同等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，在冰上静；
[0472] 5)离心，弃上清，加入无水乙醇，混匀，离心，弃上清，吸出残余液体，室温晾干；
[0473] 6)加入无RNA酶水，溶解RNA，可长期保存于-80 °C ;
[0474] 7)琼脂糖胶，跑胶鉴定；
[0475] 8)Nanodrop 测定 RNA 浓度。
[0476] 2.1.3.9RNA 反转成 cDNA
[0477] 1)反转录使用试剂盒，M-MLV Reverse Transcriptase(InvitrogenTM,by life technologies?)；
[0478] 2)主要反转步骤详见I · I · 3 · 8。
[0479] 2.1.3.10 实时定量 PCR
[0480] 1)2(^1体系包括：1(^1的9?0?1^8七6^1丨1，正反定量引物各0.5以1(1(^]\〇，。0嫩叫 1，尺(^0.4以1，超纯水7.641 ;
[0481 ] 2)ABI 7500Fast进行实时定量PCR检测。
[0482] 2.1.3.11细胞蛋白提取
[0483] 1)收取细胞(不能使用胰蛋白酶），1200-1300rpm离心，5min，弃上清；
[0484] 2)加入1ml 1倍的PBS吹打沉淀细胞，转移细胞悬液至1.5ml的EP管中，1300-1500rpm离心，5min，尽量干净的弃掉上清；
[0485] 3)用加有PMAF和OPE的RIPA裂解液吹打细胞，根据细胞的多少调整RIPA裂解液的 用量，冰上静置30min;
[0486] 4)14000印111，4°〇离心，15111；[11，吸取上清，分装在0.2111]^/^?管中。
[0487] 2.1.3.12蛋白浓度检测
[0488] 1)标准蛋白稀释10倍使用；
[0489] 2)取8个0.2ml 的 EP管：
L〇491」3)配工作液:A液：B液为50:1，上卜難倒混习；
[0492] 4)在96孔板中加入200μ1/孔的工作液，随后在工作液中加入配好的标准蛋白和稀 释好的蛋白；
[0493] 5)37。(：放置3〇11^11;
[0494] 6)酶标仪检测OD值(595nm)〇
[0495] 2.1.3.13免疫蛋白印记：
[0496] 1)10 %分离胶的配制（IOml): 超纯水 4 ml 分离胶缓冲液 2.5 ml
[0497] 30 %丙烯酰胺溶液 3,3 ml 10 % SDS 0.1 nil 10 %过硫酸氨 CLlml.. TEMED 0.004 ml
[0498] 2) 12%分离胶的配制： 超纯水 3.3 m! Γη,ηη? 分离胶缓冲液 2.5 mi
[0499] 30 %丙烯酰胺溶液 4 ml 10 % SDS 0.1ml F ^ 10 %过硫酸氨 0,1ml
[0500] TEMED 0.004 ml
[05011 3)5%浓缩胶的配制(6ml): 超纯水 4.1 ml 浓缩胶缓冲液 0.75 mi 30 %丙烯酰胺溶液 I ml
[0502] 10% SDS 0.06 m! 10 %过硫酸氨 〇.〇() ml TEMED 0.006 ml
[0503] 4)电泳：
[0504] ①蛋白上样:取25-30yg蛋白，加入浓缩上样缓冲液和超纯水(缓冲液最后稀释为1 倍），混匀，99 °C变性，5min，取出后加到已经事先装在电泳仪上的免疫印迹胶孔中，倒入跑 胶缓冲液；
[0505]②打开凝胶电泳仪的电源，设置电压80V(当蛋白跑至分离胶时更换电压至100V);
[0506]③当溴酚蓝染料的前缘跑至分离胶的下缘结束电泳。
[0507] 5)转膜：
[0508]①小心取出凝胶，将其浸泡于转膜缓冲液中；
[0509]②剪大于胶块的PVDF膜，在无水甲醇中活化30s后浸泡于转膜缓冲液中待用；
[0510]③按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤 纸、海绵，夹好转移夹，确保每层之间没有气泡；
[0511 ]④将转移夹放入转移槽，膜在正极、胶在负极，打开电源，89V稳压转移60min。 [0512] 6)封闭：
[0513] 把PVDF膜浸入封闭液中，室温摇动Ih。
[0514] 7)洗膜与杂交：
[0515] ①加入第一抗体:按照单抗说明书，稀释于抗体稀释液中，将有蛋白的PVDF膜放入 第一抗体中，4°C摇动过夜；
[0516] ②用 TBST 洗膜，5-10min，3次；
[0517] ③加入第二抗体:辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔或鼠IgG抗体（1:2000稀 释），将有蛋白的PVDF膜放入第二抗体中，室温摇动2h;
[0518] ④用TBST 洗膜，IOmin，3次。
[0519] 8)曝光：
[0520] ①将化学发光试剂盒中的两种试剂按1:1的比例混匀，滴加在保鲜膜上；
[0521] ②用滤纸将PVDF膜上的TBST吸净，蛋白面朝下，放置在反应液上，30s;在暗室中与 硝酸纤维素膜摇动孵育Imin;
[0522] ③用滤纸吸净膜上的反应液，蛋白面朝上，用保鲜膜包好，放置在压片盒中；
[0523] ④进入暗室，用感光胶片在压片盒中曝光，曝光时间视具体实验而定；
[0524]⑤曝光后的感光胶片在显影液中显影，随后在定影液中定影，用水冲洗晾干；
[0525] 2.1.3.14 ELISA检测
[0526] 1)样品制备:收集共培养细胞(T细胞与巨噬细胞)与培养上清，1500rpm离心，取上 清；
[0527] 2)各取100μΙ的6个标准品，依次加入到包被好的微孔板中，做好标记；
[0528] 3)将处理过的样品依次加入微孔板中，每孔100μΙ;
[0529] 4)在微孔板上覆膜，放置于37°C，孵育60min，弃掉微孔中的液体，并用卫生纸吸净 残余液体；
[0530] 5)用事先按照说明书稀释好的清洗液清晰微孔板5次；
[0531] 6)每孔加入底物I，每孔各50μ1，再加入底物II，每孔各50μ1，充分混匀，室温下避 光，15min;
[0532] 7)每孔加入终止液50μ1，充分混匀，终止反应；
[0533] 8)酶标仪检测OD值(450nm)〇
[0534] 2.1.3.15 NO检测
[0535] 1)将标准样品用培养基稀释至lmM(原液为1M);
[0536] 2)取9个0.2ml 的 EP管：
[0538] 3)在96孔板中，加入标准品和样品，每孔各加50μ1;
[0539] 4)以上每孔各加入溶液Ι50μ1，溶液ΙΙ50μ1;
[0540] 5)室温，避光，放置30min;
[0541 ] 6)酶标仪检测OD值（540nm)。
[0542] 2.1.4数据处理与统计
[0543] 本研究全部数据都来自至少三次独立的实验，实验数据均用means 土 SD表示，均输 入Excel建立数据库，分析采用采用SpSS13.0统计软件。组内比较采用概率计算应用 Student's unpaired t-test,以ρ〈0·05表示差异有统计学意义（*，Ρ〈0·05;**，Ρ〈 0.01;***，Ρ〈0·001)。统计图均由GraphPad Prism Version 5.0(GraphPad Software Inc， San Diego CA)完成。流式数据米用Modifit以及FlowJo 7.6. lsoftware(Tree Star，Inc， USA)进行分析。
[0544] 2.2 结果
[0545] 2.2.1 FATS基因缺陷小鼠T细胞体外增殖与野生型小鼠相比没有明显区别
[0546] 我们的体内研究结果发现，黑色素瘤小鼠的外周免疫器官与肿瘤免疫微环境中， FATS基因缺陷明显增加了 CTL细胞的比例，并且CTL的活化与功能都显著的增强（图5，9， 11)。同时也发现，巨噬细胞亚型(Ml和M2型巨噬细胞)在FATS基因缺陷小鼠与野生型小鼠的 肿瘤免疫微环境中的变化显著（图14)。众所周知，Ml型巨噬细胞在固有免疫杀伤和适应性 抗原呈递中都有不可或缺的作用。由此我们猜测，FATS基因缺陷可能通过增加Ml型巨噬细 胞比例，减少M2型巨噬细胞比例来影响巨噬细胞的抗原呈递功能从而影响了肿瘤免疫微环 境中的T细胞的增值，也可能是FATS基因缺陷小鼠的T细胞本身存在着强的增殖能力，或者 这两个因素在黑色素瘤肿瘤的发生发展中均具有重要作用。
[0547] 为了深入的研究FATS基因可以直接的影响哪一种免疫细胞功能，即FATS基因缺陷 抑制黑色素瘤生长的细胞机制，我们首先对野生型小鼠以及FATS基因缺陷小鼠的T细胞进 行了增殖检测。我们分离出野生型以及FATS基因缺陷小鼠的⑶3+T细胞，CFSE染色后，用B16 细胞培养上清或者含有10%FBS的1640培养基培养，4天后用流式细胞术检测T细胞的增殖 情况。如图17所示，无论使用普通培养基还是Bl 6细胞培养上清培养，FATS基因缺陷小鼠的T 细胞的增殖指数(PI)与野生型小鼠均没有明显的差别，这一结果提示，FATS基因缺陷可能 并没有直接导致T细胞的增殖能力的增强，也就是说，FATS基因缺陷后对黑色素瘤的抑制作 用可能是通过影响巨噬细胞分型转变来实现的。
[0548] 2.2.2 FATS基因缺陷小鼠黑色素瘤中巨噬细胞促进了T细胞的增殖
[0549] 研究表明，M1型巨噬细胞表达MHC-II，具有抗原提呈的能力，参与固有以及适应性 免疫，促进肿瘤效应T细胞的增殖;相反的，M2型巨噬细胞在促进肿瘤的生长有着重要的作 用，其比例的增加会抑制T细胞的增殖。由于我们发现，虽然在肿瘤微环境中，FATS基因缺陷 后T细胞的比例显著的增加，但是FATS基因缺陷的T细胞在体外增殖实验中却没有表现出强 的增殖能力，与野生型T细胞差别不大（图17)，于是我们进一步检测了肿瘤微环境中巨噬细 胞的提呈能力，探究FATS基因缺陷的巨噬细胞是否是引起T细胞在肿瘤环境中增多的一个 原因。我们将流式分选出的两组小鼠肿瘤组织中的巨噬细胞与标记了 CFSE的没有荷瘤野生 型小鼠的CD3+T细胞进行共培养。培养4天后流式检测T细胞的增值情况。实验结果显示，相 比野生型小鼠肿瘤微环境中的巨噬细胞，FATS基因缺陷小鼠肿瘤微环境中的巨噬细胞更加 显著的促进了T细胞的增值（图18A)，同时，我们对培养上清中的IL-2进行了检测，发现与 FATS基因缺陷巨噬细胞共培养的上清中，IL-2的表达增高（图18B)，这也进一步验证了T细 胞增殖在与FATS基因缺陷的巨噬细胞共培养后增加。这些结果表明，FATS基因缺陷小鼠的 肿瘤微环境中的巨噬细胞相较野生型小鼠，表现出了强大的抗原呈递能力，也进一步说明， FATS基因缺陷后，肿瘤微环境中的巨噬细胞主要为促进T细胞增殖的Ml型巨噬细胞。
[0550] 2.2.3 FATS基因缺陷小鼠肿瘤中的巨噬细胞对Bl6细胞具有更强的直接杀伤作用
[0551] 我们知道，Ml型巨噬细胞除去抗原呈递，促进T细胞增殖功能外，在固有免疫中亦 有着重要的作用，它们可以产生N0,对细胞进行直接的杀伤。而M2型巨噬细胞不产生N0,对 细胞不再具有杀伤作用。基于我们已经得到的实验结果，我们进一步检测了 FATS基因缺陷 后，巨噬细胞是否表现出Ml型的细胞杀伤能力。我们用流式分选出野生型以及FATS基因缺 陷小鼠黑色素瘤组织中的巨噬细胞，并将它们与B16细胞共培养，1天后检测B16的凋亡。结 果如图19所示，与FATS基因缺陷的巨噬细胞共培养的B16细胞凋亡增加（图19A，B)，同时我 们对共培养上清中的NO进行了检测，相一致的，FATS基因缺陷巨噬细胞共培养上清中NO的 含量显著的增加（图19C)，进一步说明，FATS基因缺陷的巨噬细胞具有更为强大的细胞杀伤 能力，也就是说明，FATS基因缺陷的巨噬细胞更偏向于具有杀伤能力的Ml型巨噬细胞这与 我们的体内结果相统一。
[0552] 2.2.4 FATS基因缺陷促进了骨髓细胞向Ml型巨噬细胞分化，同时抑制了M2型巨噬 细胞分化
[0553] 我们以上的实验结果表明，FATS基因缺陷可能直接影响了巨噬细胞的分型，即抑 制了Ml型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转化，来影响肿瘤免疫的。为了进一步验证我们的实 验结果，我们在体外实验中，研究FATS基因缺陷是否对巨噬细胞的极化产生直接的影响。我 们分离出野生型小鼠以及FATS基因缺陷小鼠的骨髓细胞，加入M-CSF对其进行巨噬细胞的 定向分化，分化第7天，加入IFN-γ和LPS或者IL-4使其进一步向Ml型或者M2型巨噬细胞极 化，16个小时后收集细胞，流式细胞染色或者定量检测，全面的分析了FATS基因缺陷对Ml以 及M2型巨噬细胞分化的影响。
[0554] 首先，我们利用流式细胞术检测野生型小鼠与FATS基因缺陷小鼠中，Ml以及M2型 巨噬细胞的比例。如图20所示，MO型巨噬细胞在向Ml型巨噬细胞极化后，FATS基因缺陷小鼠 Ml型巨噬细胞的比例远高于野生型小鼠的Ml型巨噬细胞的比例（图20A，B)，这一结果提示， FATS基因缺陷后，巨噬细胞明显倾向于分化为Ml型巨噬细胞。此外，与预期相一致的，在M2 型巨噬细胞极化中，FATS基因缺陷则表现出M2型巨噬细胞极化的明显受抑，FATS基因缺陷 小鼠M2型巨噬细胞的比例显著少于野生型小鼠的M2型巨噬细胞比例（图20C，D)。这一结果 非常明显的提示，FATS基因缺陷可以直接对巨噬细胞产生影响，显著的促进了 Ml型巨噬细 胞的极化，抑制了M2型巨噬细胞的极化。
[0555] 同时，我们也对野生型小鼠和FATS基因缺陷小鼠的Ml以及M2型巨噬细胞的基因表 达水平进行了实时定量PCR检测。结果如图21，22所示，与流式结果相一致，MO型巨噬细胞向 Ml型巨噬细胞极化后，FATS基因缺陷小鼠的Ml型巨噬细胞中，重要细胞因子，IL-12，TNF-a 以及N0S2的mRNA表达明显的高于野生型小鼠（图21)。而在MO型向M2型巨噬细胞极化后， FATS基因缺陷小鼠的巨噬细胞表达M2型细胞因子，六找1，1代1，1^加1 &以及0(^22的1111?嫩水 平明显低于野生型小鼠（图22)。这些结果表明，在MO型巨噬细胞极化的过程中，FATS基因缺 陷使得巨噬细胞显著易于分化为Ml型巨噬细胞，同时抑制了 M2型巨噬细胞的分化，这与我 们先前得到的体内研究的结果相一致。
[0556] 2.2.5 FATS基因缺陷促进了M2型巨噬细胞的凋亡
[0557] 以上实验中，我们发现，FATS基因缺陷小鼠的M2型巨噬细胞显著的减少，为了更加 全面的探究FATS基因对M2型巨噬细胞的影响以及潜在的机制，我们继续检测了野生型小鼠 以及FATS基因缺陷小鼠在巨噬细胞定向分化为M2型巨噬细胞中的细胞凋亡。我们分离小鼠 骨髓细胞，加入M-CSF诱导巨噬细胞定向分化，最后加入IL-4诱导M2型巨噬细胞极化，收集 M2型巨噬细胞，流式检测其凋亡水平以及免疫印迹检测细胞凋亡相关信号表达水平。流式 结果显示，FATS基因缺陷后，在诱导M2型巨噬细胞极化过程中，细胞的凋亡显著的增加（图 23A，B)，无论是早期凋亡还是晚期凋亡，FATS基因缺陷的小鼠M2型巨噬细胞都显著高于野 生型小鼠。这一结果显示了，FATS基因缺陷促进了M2型巨噬细胞的凋亡，这可能是FATS基因 缺陷小鼠中M2型巨噬细胞比例减少的一个原因。进一步的，我们检测了两组小鼠中，M2型巨 噬细胞中凋亡相关信号的表达，与流式结果相一致，FATS基因缺陷小鼠的M2型巨噬细胞中， Cleaved_caspase3蛋白的表达量相较野生型小鼠增加，同时具有抑制细胞凋亡的蛋白， Be 12在FATS基因缺陷的巨噬细胞中受到抑制（图23C)。这些结果提示了，FATS基因缺陷促进 了M2型巨噬细胞的凋亡，从而减少了M2型巨噬细胞的比例，这与体内实验中检测的肿瘤微 环境中M2型巨噬细胞的比例减少以及体外实验中M2型巨噬细胞极化后减少相一致。
[0558] 2.2.6 FATS基因缺陷促进了巨噬细胞中NF-kB信号通路的激活
[0559] 我们的研究证实，FATS基因缺陷促进M2型巨噬细胞的凋亡，导致M2型巨噬细胞比 例的下降，同时我们也发现了在FATS基因缺陷时，Ml型巨噬细胞的比例显著的增加，为了深 入探究我们体内体外实验所得到结果的可能的机制，我们进一步检测了 MO型巨噬细胞以及 腹腔富集的巨噬细胞中分化相关的信号通路。我们提取骨髓定向分化过程中MO型巨噬细胞 的蛋白，细胞免疫印迹检测了巨噬细胞向Ml型巨噬细胞定向分化的重要信号通路，NF-kB信 号通路。结果如图24所示，NF-kB信号通路中，p65的表达在FATS基因缺陷后被明显激活，同 时与P65结合抑制其进入细胞核的ΙκΒα信号的表达受到了抑制（图24A，B)。这一结果表明， FATS基因缺陷后激活了巨噬细胞中NF-kB信号通路，促进了MO型巨噬细胞向Ml型巨噬细胞 的分化，从而增加了Ml型巨噬细胞的比例。
[0560] 2.3讨论
[0561] 我们在体内实验中对黑色素瘤小鼠的肿瘤微环境里免疫细胞的分析中发现，FATS 基因缺陷抑制了促进肿瘤的免疫抑制细胞，同时促进了对肿瘤具有杀伤的效应免疫细胞。 众所周知，肿瘤微环境中的免疫细胞通过抗原提呈，分泌多种细胞因子等机制相互协同或 抑制，从而对肿瘤产生影响，其中巨噬细胞(M1型巨噬细胞）以及效应的T细胞(CTL，Th 1)对 于肿瘤的杀伤和生长抑制有着重要的作用。我们注意到，FATS基因缺陷后，黑色素瘤小鼠中 具有主要细胞杀伤效应作用的Thl，CTL以及同时具有固有杀伤和抗原呈递功能的Ml型巨噬 细胞的比例显著增加。这些结果让我们提出一个疑问，FATS基因缺陷是直接对T细胞增殖产 生影响还是通过巨噬细胞间接影响T细胞的比例?于是我们对FATS基因缺陷的T细胞进行了 体外增殖检测，结果发现，T细胞的增殖并没有在FATS基因缺陷后增加（图17)，接下来，我们 用黑色素瘤小鼠中的巨噬细胞与T细胞共培养检测T细胞增殖，结果却发现，FATS基因缺陷 的巨噬细胞显著的促进了 T细胞的增殖，T细胞增殖指数增加，同时培养上清中T细胞增殖所 必须的细胞因子，IL-2的量也在FATS基因缺陷小鼠巨噬细胞混合培养上清中显著增加（图 18)，由此，我们推测，FATS基因缺陷直接产生影响的细胞可能是巨噬细胞，也就是说，FATS 基因缺陷可能是通过改变巨噬细胞的极化，进一步的，激活了效应T细胞并影响肿瘤免疫微 环境中免疫细胞的比例。
[0562] 随后，我们的体外实验结果发现，骨髓定向分化过程中，FATS基因缺陷的骨髓细胞 在同样的极化条件下，比野生型小鼠更易于极化为Ml型巨噬细胞，并抑制M2型巨噬细胞（图 20)。同时基因的检测也得到了一致的结果，Ml型极化条件下，FATS基因缺陷的巨噬细胞更 高的表现Ml型特异性的标记（图21 )，其中包括分泌产生的IL-12，对T细胞的增殖和存活有 着重要的作用；而在M2型巨噬细胞极化条件下，M2型巨噬细胞特征的因子Arg-1，CCL22， Mrcl以及Retnla的表达在FATS基因缺陷巨噬细胞中明显抑制（图22)，其中CCL22招募Treg 抑制肿瘤效应细胞，对肿瘤的生长有着促进作用。这些与我们体内实验分析肿瘤微环境中 免疫细胞比例变化得到的数据在理论上完全吻合。
[0563]我们知道，Ml型巨噬细胞除去提呈促进T细胞增殖的功能外，也在固有免疫中起着 关键作用，对肿瘤有着直接的杀伤作用。我们进一步的对FATS基因缺陷小鼠肿瘤组织中巨 噬细胞的杀伤作用进行检测，与预期相一致，FATS基因缺陷小鼠肿瘤微环境中的巨噬细胞 对B16细胞的杀伤明显强于野生型小鼠肿瘤中的巨噬细胞（图19)。这一结果提示，FATS基因 缺陷后黑色素瘤的肿瘤微环境中的巨噬细胞以Ml/杀伤型巨噬细胞居多，使得杀伤肿瘤细 胞的免疫应答显著强于野生型小鼠。这也进一步验证了，在FATS基因缺陷小鼠中，巨噬细胞 的极化发生了改变，Ml型巨噬细胞极化增加直接影响着肿瘤的免疫杀伤。
[0564]巨噬细胞的极化是非常复杂的。研究指出，脂肪组织相关巨噬向Ml型极化中需要 JNK信号。激活AKTl和2激酶调节PI3K信号。基因消融实验显示，AKT 1和2在调节巨噬细胞Ml 和M2型上具有相互作用。JAK/STAT信号对Ml型巨噬有强的诱导作用，但是要是巨噬细胞完 全极化为Ml型巨噬需要激活TLR-4以及IFN-Y信号通路。亦有研究发现，二甲双胍可以通过 Notch信号通路促进Ml型巨噬细胞，抑制M2型巨噬细胞可以抑制肝癌细胞的生长。
[0565]有研究表明NF-kB信号通路对巨噬细胞的极化有着重要的作用。Duygu Sag等人证 明Abcgl基因缺陷可以激活NF-kB信号通路，促进Ml型巨噬细胞极化，同时也将黑色素瘤中 的巨噬细胞从促进肿瘤的M2型转变为抑制肿瘤的Ml型巨噬细胞，最终导致了黑色素瘤的生 长的显著抑制。
[0566] NF-κΒ是一种核转录因子，可以调控多种基因的表达。NF-κΒ信号通路中，IkB家族 成员（ΙκΒα，Ικβ等)与 P65(p65是NF-kB信号通路中的关键成员）结合，使p65处于没有活性状 态。各种激活信号通过对IkB降解来激活NF-κΒ信号通路。我们对骨髓定向分化的巨噬细胞 进行WB检测，发现FATS基因缺陷小鼠MO型巨噬细胞中p65表达增加，ΙκΒα的表达下调，即NF-κΒ信号在FATS基因缺陷小鼠中要强于野生型小鼠（图24)，这提示FATS基因缺陷可以通过激 活NF-κΒ信号通路来促进Ml型巨噬细胞极化。
[0567] 与此同时，我们发现了在M2型巨噬细胞极化条件极化后，FATS基因缺陷小鼠M2型 巨噬细胞的凋亡比例增加，WB检测后发现凋亡信号（cleaved-caspase-3)增加，而抑制凋亡 的信号(Bcl2)表达下降（图23)，这说明FATS基因缺陷促进了 M2型巨噬细胞的凋亡，但是我 们也发现，凋亡的比例增加并没有M2型巨噬细胞比例减少显著，这也提示，FATS基因缺陷小 鼠M2型巨噬细胞的减少可能并不仅仅由于凋亡数目的增加，也由于巨噬细胞更倾向于Ml型 巨噬细胞极化，抑制M2型巨噬细胞极化引起。
[0568] 三、FATS-KO小鼠骨髓来源巨噬细胞过继治疗实验
[0569] 3.1对象和方法
[0570] 3.1.1实验方法
[0571 ] 3.1.1.1小鼠黑色素瘤皮下移植瘤模型构建
[0572] 1)将B16细胞培养于IOcm2培养皿中，用加有10%FBS，1%双抗的DMEM培养基培养， 培养至对数生长期；
[0573] 2)收集细胞并进行离心。
[0574] 3)弃掉上清液，细胞沉淀用1倍的I3BS吹打，lOOOrpm，离心，5min，弃上清，随后再重 复1次；
[0575] 4)收集到的B16细胞用1倍的PBS重悬，计数，调整细胞浓度至2 X 106/ml;
[0576] 5)提前半天时间，用脱毛膏将小鼠右后背部的毛脱去，注射细胞悬液前用75%酒 精对小鼠注射部位进行消毒；
[0577] 6)在每只小鼠的右后背部，注射100μΙ 2 X 106/ml的B16细胞(共31只），即每只小 鼠注射Β16细胞的数量为2 X 105/只，进针后或出针前，可稍微改变针头的方向，注射时动作 轻缓，出针后轻按针孔片刻，可避免细胞悬液漏出；
[0578] 7)每天对小鼠的肿瘤生长情况进行观察，并用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长度与宽 度，做好记录；
[0579] 8)荷瘤后20天，麻醉后脱颈处死小鼠，分离小鼠的脾脏与肿瘤，肿瘤组织，照相，称 重，并测量其长度与宽度，计算肿瘤的终体积；
[0580] 9)小鼠的肿瘤体积计算公式为长X宽2/2(mm3)
[0581] 3.1.1.2小鼠骨髓细胞分离：
[0582] 1)麻醉后，脱颈处死小鼠，用75%酒精消毒双下肢，固定后剪开皮肤，分离肌肉组 织，暴露胫骨，保留两侧关节，将胫骨取出，迅速置于冷的1倍PBS中；
[0583] 2)去掉骨面上残余的组织，置于超净工作台中，沿关节剪开股两端，暴露出髓腔， 用Iml注射器吸取1倍的PBS，将骨髓冲至培养皿中，反复冲洗，直至胫骨全部变为白色；
[0584] 3)用Iml的枪将骨髓吹散至单细胞状态，随后收集细胞悬液至无菌的15ml离心管 中，1000 rpm，离心，5min;
[0585] 4)弃上清，加入 Iml 1 倍的 PBS，1000rpm，离心，5min;
[0586] 5)弃上清，用含有10%FBS的DMEM培养基重悬细胞，培养在细胞培养箱中。
[0587] 3.1.1.3小鼠骨髓来源巨噬细胞定向分化：
[0588] 1)分离出的骨髓细胞加入M-CSF (10ng/ml)培养5天，此时的细胞为MO型巨噬细胞 (培养第三天需半量换液）；
[0589] 2)M1型巨噬细胞极化:MO型巨噬细胞加入IFN-γ (20ng/ml)培养12h，随后加入LPS (100ng/ml)继续培养4h，即为Ml型巨噬细胞；
[0590] 3)M2型巨噬细胞极化:MO型巨噬细胞加入IL-4(20ng/ml)培养16h，即为M2型巨噬 细胞。
[0591] 3.1.2具体方法
[0592] 选取10只0578176小鼠，雌性，6-8周，体重18-2(^，皮下注射816细胞，2\10 5/只， 构建小鼠皮下黑色素瘤移植瘤模型(具体步骤见3.1.1.1)，然后将小鼠随机分成两组，每组 各5只。分别在小鼠荷瘤第2天和第7天，通过尾静脉注射的方式分别将野生型小鼠和FATS基 因敲除小鼠骨髓来源的定向分化为MO型的巨噬细胞，过继输注到小鼠体内，注射前用LPS刺 激12个小时，连续监测小鼠肿瘤大小。荷瘤16天后，将处死小鼠，分离肿瘤组织，称量肿瘤重 量。然后利用小鼠肿瘤组织浸润单个核细胞分离液分离肿瘤组织中的单个核细胞，流式检 测肿瘤中巨噬细胞的比例及M2型巨噬细胞的比例。
[0593] 3.2结果
[0594] 3.2.1 FATS基因缺陷的骨髓来源巨噬细胞过继治疗能明显抑制肿瘤生长
[0595] 以上的研究结果提示，FATS基因缺陷的巨噬细胞可能在肿瘤的生长中具有中具有 重要的杀伤能力，从而抑制肿瘤的生长。为了进一步证实FATS基因缺陷或低表达的巨噬细 胞具有抑制黑色素瘤的生长作用，我们将野生型以及FATS基因缺陷的巨噬细胞或者沉默 FATS基因以及对照的野生型巨噬细胞尾静脉注射到B16细胞荷瘤的小鼠体内对黑色素瘤进 行过继治疗。结果发现，FATS基因缺陷的巨噬细胞过继治疗后，显著抑制了黑色素瘤的生长 (图25A)，肿瘤最终的体积显著减小（图25B)，同时肿瘤的肿瘤也明显的下降（图25C)。
[0596] 四、FATS-siRNA转染WT小鼠骨髓来源巨噬细胞进行过继治疗实验
[0597] 4.1对象和方法
[0598] 4.1.1主要材料、试剂与仪器设备
[0599] 4.1.1.1主要试剂
[0600] Lipofectamine RNAiMAX Reagent转染美国Invitrogen公司 [0601 ] 试剂
[0602] FATS-siRNA 广州瑞博公司合成
[0603] 4.1.2实验方法
[0604] 4.1.2.1骨髓细胞向巨噬细胞定向诱导分化。
[0605] 主要材料：2-3只C57BL/6小鼠，雌性，6-8周，体重18-20g; PBS; RPMI1640完全培养 基；IOcm细胞培养皿。
[0606]骨髓细胞向巨噬细胞定向分化的培养基：1640完全培养基20ng/ml M-CSF
[0607] 方法:脱颈处死小鼠，取股骨和胫骨，酒精浸泡2分钟-超净台，无菌PBS漂洗-Iml 注射器冲出骨髓细胞，1500rpm离心，5min，弃上清，PBS洗一遍，RPMI1640完全培养基重悬计 数-1.5 X 106细胞/皿，加入定向分化的培养基，培养5-6天-弃去未贴壁细胞，细胞刮子收 获贴壁细胞，即为巨噬细胞，计数，调整细胞浓度为2.5 X 106个/ml，备用。（中间需添加 5ml 完全培养基带M-CSF)
[0608] 4丄2 · 2 ·巨噬细胞转染FATS-siRNA
[0609] 主要材料:FATS-siRNA(广州瑞博公司合成，其对应的DNA序列如SEQ ID NO: 2); Lipofectamine RNAiMAX Reagent转染试剂;PBS; RPMI1640完全培养基；12孔板。
[0610] 方法:上述收获的巨噬细胞，5 X IO6个/孔，接种到12孔板中，细胞汇聚60-80 % - 参照下表，用RPMI1640完全培养基，分别稀释FATS-siRNA与Lipofectamine RNAiMAX Reagent转染试剂-1:1混合，室温静置5分钟-混合液与细胞共孵育1-3天-镜下检测转染 效率-24小时后，定量PCR，进一步检测转染效率。
[0611]稀释FATS-siRNA与Lipofectamine RNAiMAX Reagent转染试剂
[0613] 1:1混合，室温静置5分钟，
[0614] SiRNA-脂质混合液配制及细胞转染
[0617] 混合液与细胞共孵育1-3天-镜下检测转染效率-定量PCR，进一步检测转染是否 成功.
[0618] 4.1.2.3巨噬细胞向Ml型定向诱导极化
[0619] 转染FATS-siRNA 24小时后，加入LPS(lμg/ml)诱导巨噬细胞向Ml型极化，12小时 后，收集细胞，计数，调整细胞浓度为I X IO7个/ml，流式检测，确定巨噬细胞表型。注:空载 体-巨噬细胞作为对照。
[0620] 4.1.2.4 Ml型巨噬细胞过继治疗肿瘤
[0621] 动物:C57BL/6小鼠，雌性，6-8周，体重18-20g。
[0622] 肿瘤模型:B16小鼠黑色素瘤细胞2X IO5/只小鼠皮下注射荷瘤。
[0623] 方法:分别于小鼠皮下注射荷瘤后1、7天，将FATS-siRNA巨噬细胞I X 106/只小鼠 尾静脉注射过继治疗，16天后，处死小鼠。荷瘤期间，隔天监测肿瘤大小。注:转染NC-siRNA 巨噬细胞作为对照。
[0624] 4.2结果
[0625] 4.2.1过继输注FATS-siRNA转染的骨髓来源的巨噬细胞能明显抑制肿瘤的生长
[0626] 通过应用siRNA沉默野生型巨噬细胞中的FATS基因，我们将FATS/NC-siRNA转染到 野生型的巨噬细胞中，随后用这两种巨噬细胞对黑色素瘤小鼠进行过继治疗，结果如图26 所示，FATS基因沉默的巨噬细胞治疗后显著的抑制了黑色素瘤的生长。这些结果证实，巨噬 细胞缺陷或者沉默FATS基因后对小鼠黑色素瘤具有治疗作用。
[0627]以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本 发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造 的保护范围之内。
【主权项】
1 .FATS基因或其表达产物(FATS基因的编码蛋白）在下述任一方面的应用： i) 开发、筛选黑色素瘤功能产品方面； ii) 制备治疗或预防黑色素瘤的功能产品方面。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述功能产品为能够对黑色素瘤的发生、 发展产生治疗、缓解、抑制、调节的有益作用的产品或潜在物质;所述功能产品为单一制剂 或包含有效量制剂成分的组合物。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述功能产品包括下调FATS基因的表达、 转录或其表达产物的功能。4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述功能产品用于：增加肿瘤组织中炎性 细胞的浸润。5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述功能产品用于:在外周免疫器官或肿 瘤免疫微环境中，促进抗肿瘤免疫和/或抑制促肿瘤的免疫反应。6. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述功能产品用于:在巨噬细胞定向分化 中，促进向Ml型巨噬细胞极化，和/或抑制M2型巨噬细胞的极化。7. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述功能产品用于以下一种或多种作用： i) 提高细胞毒性T淋巴细胞，NK细胞，γ δΤ细胞和/或Ml型巨噬细胞的比例； ii) 降低调节性T淋巴细胞和/或M2型巨噬细胞的比例； iii) 提高T细胞增殖相关细胞因子IL-2和/或Ml型巨噬细胞分泌细胞因子IL-12的表 达； iv) 提尚巨细胞杀伤能力； v) 提高T细胞的增殖能力； v i)降低巨噬细胞表达VEGF; vii)抑制肿瘤组织血管生成； vi i i)骨髓细胞在巨噬细胞定向分化中，促进向Ml型巨噬细胞极化，和/或抑制M2型巨 噬细胞的极化； ix)促进M2型巨噬细胞的凋亡； X)激活NF-kB信号通路。8. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述功能产品选自或含有:核酸抑制物，蛋 白抑制剂，抗体，配体，蛋白水解酶，蛋白结合分子，FATS基因缺陷或沉默的免疫相关细胞、 其分化细胞或构建物中的一种或多种，能够在基因或蛋白水平上下调FATS基因的表达或其 表达产物。9. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述功能产品选自或含有：以FATS基因或 其转录本为靶序列、且能够抑制FATS基因表达产物的表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、 shRNA、微小RNA、反义核酸;或能表达或形成所述小干扰卩嫩、(1通嫩、5^嫩、微小1^、反义核 酸的构建物。10. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述功能产品选自或含有以下任一种： i) 以SEQ ID ΝΟ:1或其转录本为靶序列，且能够抑制FATS基因表达产物的表达或基因 转录的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸； ii) 能表达或形成i)中所述小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸的构建物； iii) 含有SEQ ID NO:1或其互补序列，且能够在转入体内后形成抑制FATS基因表达产 物的表达或基因转录的干扰分子的构建物； iv) 抑制或敲除SEQ ID NO: 1基因序列后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建物； v) 以根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的SEQ ID NO: 1的同源序列或其转录本 为靶序列，且能够抑制FATS基因表达产物的表达或基因转录的小干扰1?^、(181^^、8111?^、微 小RNA、反义核酸； vi) 能表达或形成v)中所述小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸的构建物； vii) 含有根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的SEQ ID NO: 1的同源序列或其互 补序列，且能够在转入体内后形成抑制FATS基因表达产物的表达或基因转录的干扰分子的 构建物； viii) 抑制或敲除根据构建物的生物体的密码子偏爱性体现的SEQ ID NO: 1的同源基 因序列后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建物。
【文档编号】A61K48/00GK105963699SQ201610315637
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】张荣信, 张凯, 张丽娟, 薛振毅, 李岩
【申请人】天津医科大学