专利名称：海带丝状体包埋脱水保存方法
技术领域：
本发明属于海洋生物技术领域，尤其是涉及一种大型经济藻类—海带种质的超低温保存技术。
背景技术：
海带(Laminaria japonica Aresch)是中国重要的经济藻类，海带生活史分两个明显的世代阶段孢子体世代和配子体世代，配子体世代是海带的单倍体阶段，在该阶段将雌配子体和雄配子体单个分离培养，可形成无性繁殖系。传统的种质保存技术就是将无性系继代培养保存，传统保存技术具有明显的不足(1)液体培养是唯一的保存途径，手段单一，限制了保存的规模和效率；(2)液体培养保存一般需要在半月内更新一次培养液，工作量大，操作繁琐，频繁操作也增加了种质污染及混杂的机会；(3)采孢子前无法对种海带进行无菌处理，整个保存过程都在有菌条件下，不能彻底杜绝微生物尤其杂藻的污染；(4)培养中细胞形态异常、单性生殖等现象时有发生，培养因子有待进一步优化。因此，目前的保种技术是一种传统的继代培养保存的方法，无法完全排除混杂、污染、变异的可能性。
超低温冷冻是唯一可靠的可长期稳定保存种质的技术。藻类种质超低温保存的研究开始于20世纪60年代，80年代以后发展速度较快，从淡水藻类到海水藻类，从微藻类到大型藻类，从非经济藻类到经济藻类都给予了较多的关注。藻类超低温冷冻保存的方法主要是两步冰冻法(two-step freezing)，该方法首先在保存材料中加入抗冻保护剂，进行预冻，再将预冻过的材料投入液氮中快速冷冻，目前已成为藻类种质冰冻保存的常规方法。该方法的主要局限在于抗冻保护剂有一定毒性，除了在复苏后去处保护剂环节繁琐外，对种质的遗传特性是否有影响也受到一定质疑，另外，两步法冻存通常需要比较昂贵的程序降温仪，也限制了该技术的推广应用。
包埋脱水法(encapsulation-dehydration)是近几年发展起来的一种新的超低温保存方法，即生物材料用褐藻胶包埋后，脱水到一定程度投入液氮保存，该方法通常不使用抗冻保护剂和昂贵的程序降温仪，无疑是对超低温保存技术的改进。在海带目中只有掌状海带(L.digitata)和裙带菜(Undaria pinnatifida)两个种类采用过包埋脱水法保存。未见采用包埋脱水法保存中国海带(L.japonica)的研究报道。在超低温冷冻保存中，有效的冻存程序以种类的不同而有较大差异，冻存程序的建立主要是依靠经验性的实验结果，没有一种程序适合其他种类或多数种类，这也是超低温保存技术的主要难点之一。
发明内容
本发明的目的在于改进已有的丝状体继代培养保存以及两步法超低温保存技术的不足而提供一种用于最有经济价值海带种类(L.japonica)的、可靠的、简单有效的种质保存方法。
本发明的目的是这样实现的，海带丝状体包埋脱水保存方法，是以海带丝状体为冻存材料的超低温保存方法，其特点是包括以下步骤材料包埋、蔗糖溶液中预培养、干燥脱水、预冻、入液氮保存、复苏、脱固定。
材料包埋是将丝状体用组织破碎仪切割成100-200um的小段，在光强1500±200Lux，光时L∶D 24∶0，水温10～15℃，营养盐NO3-N6-10g/m3，PO4-P 1-2g/m3的条件下培养两周后，将实验材料与3％褐藻酸钠溶液混匀，移入注射器中，将藻液滴入含0.1M CaCI2的30‰NaCI溶液中，轻轻摇动，胶球变硬，即完成固定化包埋过程，制成直径为3.5±0.2mm的含有丝状体的褐藻酸钙胶球。
蔗糖溶液中预培养是将胶球置于0.4M的蔗糖溶液中培养6-15h。
干燥脱水是预培养结束后，将胶球置于温度10-15℃、相对湿度50-80％的环境中阴干3-6h.去除保护剂是将混合液经500目筛绢过滤，滤出的无性系移入培养液中培养。
预冻是将干燥后的胶球置于-20--40℃的冰箱中停留30-60min。
入液氮保存是将预冻后的胶球直接投入液氮保存。
复苏是从液氮中取出胶球直接放入40℃恒温水浴，快速震荡直至胶球表面由白色变为水状，移入常规培养液培养。
脱固定是复苏培养一周后按每5-7粒胶球放入20ml含0.05M柠檬酸钠的30‰NaCI溶液中，使胶球完全溶解，用500目筛绢滤出丝状体，滤出的丝状体移入常规培养液中培养。
本发明与已有技术相比具有以下显著特点和积极效果(1)本发明采用超低温冷冻保存海带丝状体，使丝状体细胞在-196℃状态下代谢完全停止，生命以静止的形式在这种状态下长期保存，解冻后又可恢复其原有的生物活性和遗传特性，有效地解决了海带种质保存中污染、混杂、变异的问题；(2)本发明方法与常规的两步法超低温保存技术相比，一是不使用抗冻保护剂，避免了抗冻保护剂对种质材料的毒性影响，也简化了复苏后去处保护剂的繁琐；二是不采用比较昂贵的程序降温仪，利于该技术普及应用；(3)本发明方法将包埋脱水法与两步冰冻法结合，通过蔗糖溶液培养、低温高湿坏境干燥和预冻三环节充分脱水，既解决了海带(L.japonica)对干燥脱水较敏感的问题，也阻止了入液氮和复苏过程中冰晶的形成，提高了存活率。
四、具体实施方案下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例，海带丝状体包埋脱水保存法，是以海带丝状体为冻存材料的超低温保存方法，包括材料包埋、蔗糖溶液中预培养、干燥脱水、预冻、入液氮保存、复苏、脱固定七个步骤；首先将丝状体用组织破碎仪切割成100-200um的小段，在光强1500±200Lux，光时L∶D 24∶0，水温10～15℃，营养盐NO3-N 6-10g/m3，PO4-P 1-2g/m3的条件下培养两周，与3％褐藻酸钠溶液混匀，移入注射器中，将藻液滴入含0.1M CaCI2的30‰ NaCI溶液中，轻轻摇动，15-30min后胶球变硬，制成直径为3.5±0.2mm的含有丝状体的褐藻酸钙胶球；将胶球置于海水配置的0.4M蔗糖溶液中培养6h；预培养结束后，将胶球置于温度10℃、相对湿度70％的环境中阴干6h；将干燥后的胶球置于-40℃的冰箱中停留30mm；预冻后的胶球直接投入液氮保存，保存时间依据具体情况，可几个月，也可几年，或更长；复苏时，从液氮中取出胶球直接放入40℃恒温水浴，快速震荡直至胶球表面由白色变为水状，移入常规培养液培养；复苏后培养7天，按每7粒胶球放入20ml含0.05M柠檬酸钠的30‰ NaCI溶液中，使胶球完全溶解，用500目筛绢滤出丝状体，滤出的细胞系移入常规培养液中培养。
采用本发明方法保存的丝状体，再培养法测定存活率达43％。
权利要求
1.海带丝状体包埋脱水保存方法，是以海带丝状体为冻存材料的超低温保存方法，其特征是包括以下步骤材料包埋、蔗糖溶液中预培养、干燥脱水、预冻、入液氮保存、复苏、脱固定。
2.根据权利要求1所述的海带丝状体包埋脱水保存方法，其特征材料包埋是将海带无性系用组织破碎仪切割成100-200um的小段，在光强1500±200Lux，光时LD 240，水温10～15℃，营养盐NO3-N 6-10g/m3，PO4-P 1-2g/m3的条件下培养两周后，与3％褐藻酸钠溶液混匀，移入注射器中，将藻液滴入含0.1MCaCI2的30‰ NaCI溶液中，轻轻摇动，胶球变硬即完成固定化包埋过程，得到直径为3.5±0.2mm的含有丝状体的褐藻酸钙胶球。
3.根据权利要求1所述的海带丝状体包埋脱水保存方法，其特征蔗糖溶液中预培养是将含有丝状体的褐藻酸钙胶球置于海水配置的0.4M蔗糖溶液中培养6-15小时。
4.根据权利要求1所述的海带丝状体包埋脱水保存方法，其特征干燥脱水是蔗糖溶液中预培养结束后，将含有丝状体的褐藻酸钙胶球置于温度10-15℃、相对湿度50-80％的环境中阴干3-6小时。
5.根据权利要求1所述的海带丝状体包埋脱水保存方法，其特征预冻是将干燥脱水后的含有丝状体的褐藻酸钙胶球置于温度在-20℃--40℃的冰箱中停留30-60min。
6.根据权利要求1所述的海带丝状体包埋脱水保存方法，其特征入液氮保存是将预冻后的含有丝状体的褐藻酸钙胶球直接投入液氮保存。
7.根据权利要求1所述的海带丝状体包埋脱水保存方法，其特征复苏是从液氮中取出含有丝状体的褐藻酸钙胶球直接放入40℃恒温水浴，快速震荡直至胶球表面由白色变为水状，移入常规培养液培养。
8.根据权利要求1所述的海带丝状体包埋脱水保存方法，其特征脱固定是在复苏培养一周后按每5-7粒胶球放入20ml含0.05M柠檬酸钠的30％o NaCI溶液中，使胶球完全溶解，用500目筛绢滤出丝状体，滤出的丝状体移入常规培养液中培养。
全文摘要
本发明公开了海带丝状体包埋脱水保存方法，是以海带丝状体为冻存材料的超低温保存方法，包括以下步骤材料包埋、蔗糖溶液中预培养、干燥脱水、预冻、入液氮保存、复苏、脱固定，本发明改进已有的丝状体继代培养保存以及两步法超低温保存技术的不足，提供一种用于最有经济价值海带种类(L.japonica)的、可靠的、简单有效的种质保存方法，有效地解决了海带种质保存中污染、混杂、变异的问题，不使用抗冻保护剂，避免了抗冻保护剂对种质材料的毒性影响，也简化了复苏后去处保护剂的繁琐，设备简单，利于该技术普及应用，提高了存活率。
文档编号A01H4/00GK1762198SQ20051012327
公开日2006年4月26日 申请日期2005年11月17日 优先权日2005年11月17日
发明者张全胜, 王国文, 戴宏亮, 解建祖, 钱瑞, 郑龙华 申请人:山东东方海洋科技股份有限公司, 烟台大学