人工合成的甘蓝型黄籽油菜的分子标记及其应用的制作方法

专利名称：人工合成的甘蓝型黄籽油菜的分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于油菜育种技术领域，具体涉及一种人工合成的甘蓝型黄籽油菜的分子标记及利用该分子标记进行标记辅助选择，培育一种遗传稳定的黄籽油菜新品种。
背景技术：
大量研究表明，在相同遗传背景下，黄籽油菜较黑籽具有含油量和蛋白质含量高；种皮薄(约为一半)；纤维素、单宁和鞣酸等多酚化合物含量低；油质清澈透明，杂质少；饼粕对畜禽适口性好；成熟度较易鉴定，便于适时收获等一系列优点。在白菜型油菜、芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥都有天然的黄籽种质存在，然而甘蓝型油菜黄籽资源缺乏，现有甘蓝型黄籽油菜的黄籽性状不稳定，自交多代仍有黑籽出现，色泽不鲜艳。许多研究者利用远缘杂交、辐射诱变及人工合成等多种方法积极创造甘蓝型油菜黄籽种质。通过对甘蓝型黄籽变异株的定向选择，品种间和种间杂交，辐射诱变，组织培养等途径和方法可选育出优良的甘蓝型黄籽油菜。因此将黄色种皮和高含油量、低纤维素、低芥酸、低硫苷等品质性状结合在一起，与杂种优势利用、生物技术相结合，进行综合性状育种，培育一种全新油菜品种，已成为提高种子含油量，改进油菜品质，增加种籽产量，提高产量潜力的一条重要途径。
然而甘蓝型黄籽油菜种皮色泽遗传极不稳定，遗传机制十分复杂，环境和外界因素影响较大。传统的表现型选择的育种方法，受到环境条件影响，存在许多缺点，效率低。分子标记辅助选择是一种高效的育种方法，与传统表型选择相比，它可在任何生长期进行，不受环境条件影响，可排除非等位基因相互作用而造成的干扰，具有快速、经济，效率高、准确性强等优点。在甘蓝型黄籽油菜育种过程中将分子标记技术与回交育种相结合，借助分子标记对黄籽性状的基因型进行直接而快速地选择，以排除环境和外界因素的影响。同时对背景进行选择，这样可加快遗传背景恢复速度，缩短育种年限和减轻连锁累赘的作用。
在甘蓝型油菜中，Van Deyzne等人(Van Deynze等，The identification of restriction fragment lengthpolymorphisms linked to seed colour gene in Brassicca napus.，Genome，1995，38534-542)鉴定了一个与种皮颜色连锁的RFLP标记。Somers等(Somers D J等，.Identification of a major gene and RAPD marker foryellow seed coat colour in Brassica napus.，Genome，2001，441077-1082)采用RAPD和BSA(Michelmore等，Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysisa rapid methoddetect markers in specific genomic regions by using segregating populations.，Proc Natl Acad Sci USA，1991，889828-9832)结合的方法，找到一个与种皮色泽相关的主基因，获得了8个与种皮色泽连锁的RAPD标记，其中一个与色素基因(黑籽)共分离，两个与黄籽基因紧密连锁。这些工作为分子标记辅助选择选育黄籽油菜品种奠定了基础。目前分子标记辅助选择(MAS)在甘蓝型油菜中应用并不多，在甘蓝型黄籽油菜中尚未见有MAS的报道。

发明内容
本发明的目的在于利用DNA分子标记并结合BSA分析方法，找到与油菜黄籽基因紧密连锁的RAPD和AFLP标记，并将它们转化成更稳定的显性SCAR标记或共显性CAPS标记。应用该SCAR和CAPS标记对黄籽基因进行快速而又准确的选择，同时应用RAPD和AFLP标记对其遗传背景进行选择，以加快黄籽油菜新品种的选育。
本发明通过以下技术方案实现一种制备与甘蓝型油菜黄籽基因紧密连锁的油菜分子标记的方法，包括下列步骤1)双单倍体(DH)分离群体的获得以恢5148-2为母本(该品系于2006年1月18日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC-P200601)，以黄籽品系No.2127-17(该品系于2006年1月18日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC-P200602)为父本，杂交，取F1植株的花粉进行小孢子培养(小孢子培养方法参见文献，余风群等，提高甘蓝型油菜小孢子胚状体成苗率的某些培养因素研究，作物学报，1997，23(2)165-168)，获得双单倍体(DH)分离群体。
2)构建DH分离群体的基因池用集团分析法(bulked seregation analysis，简称BSA，参见文献Michelmore RW等，Identification ofmarkers linked todisease resistance gene by bulked Segregant analysisa rapid method to detect markers inspecific genomic regions using segregating population.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，889829-9832)，构建黄籽集团和黑籽集团两个基因池。
3)利用上述步骤2)中构建的DH分离群体的基因池，筛选与甘蓝型油菜黄籽基因紧密连锁的RAPD和AFLP标记用两亲本间有差异的引物对上述2中构建的两个DNA池进行PCR扩增，在两个池间表现有差异的引物再对池间的各个单株的DNA样品进行PCR扩增和电泳检测。确定为该性状的连锁标记后，然后对DH群体的各个单株的DNA样品进行PCR扩增和电泳检测。
4)回收、克隆、测序上述3中筛选到的与甘蓝型油菜的黄籽基因紧密连锁的RAPD和AFLP标记的片段。
5)根据上述步骤4)中的测序结果设计特异引物(引物序列见实施例所述)，将筛选到的与甘蓝型油菜黄籽基因紧密连锁的RAPD和AFLP标记转化为SCAR标记。
6)将上述步骤5)中未成功转化的SCAR标记发展为CAPS标记。
当上述步骤5)中候选SCAR引物不能扩增出多态性，则进行CAPS酶切分析。用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，酶切产物电泳分离同SCAR分析。
7)将上述步骤3)，5)，6)中的RAPD标记，AFLP标记，SCAR标记和CAPS标记进行群体分析和连锁遗传分析。
8)利用上述步骤7)中的分子标记及辅助选择的方法将黄籽基因导入到甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育的恢复系中，选育出黄籽型油菜恢复系。
更详尽的技术方案由以下所述1、油菜小孢子培养方法在油菜的初花期取F1植株上3-4mm左右的蕾，放入已灭菌的小烧杯中(所需器件及液体均须灭菌且在无菌条件下操作)，加入70％酒精消毒1min，用0.1％HgCL2消毒10min，然后用无菌水冲洗3次，每次5min。取消毒好的花蕾放入试管中，加入1ml的B5-13(B5液体培养基，蔗糖浓度为13％)提取液，用玻棒碾成匀浆，倒入装有0.44μm尼龙膜的漏斗中过滤，用10ml的离心管收集滤液。加B5提取液至所需刻度，离心5min，转速1000rpm/min。弃上清液，加B5-13提取液重新悬浮，离心5min，转速500rpm/min，重复该步骤一次。弃上清液，加入NLN-16培养基(含13mg/L秋水仙碱)重新悬浮，分装到直径为6cm的培养皿中，密度为2蕾/ml，每皿2ml，放入32℃，暗培养两天。每皿加新鲜的NLN-13培养基2ml，放入25℃继续暗培养2-3星期。待肉眼可见胚，置于25℃恒温摇床上，在振荡培养1星期，转速为55rpm/min，达到子叶期的胚转入固体B5pG(含0.1mg/LGA3)培养基上继代培养，成苗后适时移栽。
2、构建黄籽集团和黑籽集团两个DNA池利用色彩色差计CR-300(日本美能达公司生产，主要原理是仪器具有8毫米直径测量头，6个高灵敏2硅光电管，采用漫射照明和0度观察角，混合室里的脉冲孤灯为样品表面提供照明，有仪器的双光束反馈系统用来测量入射光和反射光，并给出相应的亮度值)，对DH群体的种子进行种皮颜色测量，所有样品测量值从17到50呈连续变化。我们在对大量样品进行测量后，参照前人黄籽分类研究结果，并结合肉眼目测，将所有的样品由黄到黑分成6级，分别是1级(最黄)亮度值为大于40，2级亮度值为35-40，3级亮度值为30-35，4级亮度值为25-30，5级亮度值为20-25，6级(最黑)亮度值为小于20(附图1)，以同一人按同样方法和标准分单株记录自交种子级别。在DH分离群体中，根据各个DH系种皮色泽测量和颜色分析结果，在1级中选取10份DH系和在6级中选取10份DH系，分别将其DNA等量混合构成黄籽基因池(Yellow-seeded bulk)和黑籽基因池(Black-seededbulk)。
3、RAPD分析和AFLP分析RAPD分析RAPD引物购自上海生物工程有限公司(方法参见Rohrer G A等，The useof a randomly ampllified polymorphic DNA marker RAPD in an analysia of susceptibility to heamonchus andcoccidia infestations in goats，jounrnal of animal science，692-3，1991，)。经优化试验，RAPD分析确定如下最优PCR反应体系1×PCR buffer，1.35mmol/L MgCl2，0.08mmol/L dNTPs，1.0U Taq polymerase(上述四者均为MBI Fermentas，Lithuania)，0.45μmol/L 10-mer RAPD引物(上海生物工程有限公司)，50ng DNA模板，加ddH2O至终体积20μl。反应于PTC-225扩增仪(MJ Research，USA)上进行。热循环参数为94□3min；94□30s，40□45s，72□60s，38个循环；72□10min；4□保存。扩增产物在水平电泳槽(北京六一仪器公司)上，使用1×TAE缓冲液，电压3V/cm，电泳2.5h左右，1.2％琼脂糖凝胶(含EB)电泳分离，利用Lambda DNA/HindIII+EcoRI marker估算扩增产物大小。电泳完毕，于凝胶成像系统(UVP)拍照保存，记录多态性结果。
AFLP分析(1)总DNA的酶切与连接按表1配制反应体系总DNA 200ng，2U EcoRI和2U MseI(MBI Fermentas，Lithuania)限制性内切酶，终体积为20μl。先在37℃水浴5hrs-8hrs，后转入65℃水浴45min，完全酶切后加入5μl连接混合液，将酶切连接混合液置于22℃连接过夜。连接完毕，70℃灭活10min，再用ddH2O将反应液稀释10倍作为PCR预扩增的底物；(2)AFLP接头和引物序列设计均按Vos等(1995)报道方法进行，由上海生物工程公司合成。接头制备先将EcoR I、Mse I接头的左右引物(F，R)按照OD值的多少加入一定数量灭菌ddH2O统一溶解稀释为100μmol/L，后将等体积的左右引物(F，R)混合于同一灭菌0.5ml离心管中，进行复性。复性参数为65□10分钟，37□10分钟，25□10分钟，一个循环，在DNA-Thermal Cycler 480PCR仪(Perkin elmer Ltd.，USA)上进行，后置于冰上10分钟，最后置于-20□保存备用。
EcoR I接头序列左引物(EF)5＇-CTC GTA GAC TGC GTA CC-3＇右引物(ER)3＇-CTG ACG CAT GGT TAA-5＇；Mse I接头序列
左引物(MF)5＇-GAC GAT GAG TCC TGA G-3＇右引物(MR)3＇-TA CTC AGG ACT CAT-5＇。
表1本发明的DNA酶切、连接体系设计

(3)预扩增在20μl PCR反体系中，含有0.125mmol/L dNTPs，1U Taq polymerase，1.35mmol/L MgCl2，1×PCR buffer(四者均为MBI Fermentas，Lithuania)，50ng EA和50ng MC(或者MG)预扩引物，3μl酶切连接产物(表2)。PCR循环参数为；94□30s，56□30s，72□1min，20个循环，PTC-225 PCR仪上完成。取4μlPCR产物于1.0％琼脂糖凝胶检测，若呈弥散状(Smear，50bp-1000bp)，表明预扩增效果好。剩余产物稀释10-15倍，作为下一步PCR选择性扩增的模板。
对应的预扩增引物序列为EA为5＇-GAC TGC GTA CCA ATT CA-3＇；MC为5＇-GAT GAG TCC TGA GTA AC-3＇；MG为5＇-GAT GAG TCC TGA GTA AG-3＇(4)选择性扩增在15μl PCR反应体系中含有3μl预扩稀释增产物，37.5ng EA+2引物(为EA预扩引物另加2个选择性碱基，以下类似)和37.5ng MC/MG+2引物，0.15mmol/L dNTPs，0.75U Taqpolymerase，0.45mmol/L MgCl2，1×PCR buffer(后四者均为MBI Fermentas，Lithuania)(表3)。PCR循环参数为第一个循环94℃30s，65℃30s，72℃表2预扩增及选择性扩增反应体系


表3本发明的AFLP选择性扩增引物设计

1min，此后每个循环复性温度下降0.7℃，共计13个循环；然后94℃30s，56℃30s，72℃1min共23个循环，PTC-225 PCR仪上完成。选择性扩增引物序列和编号见表3。
(5)扩增产物的电泳检测用洗涤剂将电泳玻璃彻底洗净，先以去离子水淋洗，后用无水乙醇淋洗并晾干。在长胶板上用光滑的餐巾纸均匀涂抹2ml硅化液(AMRESCO)。在短胶板上均匀涂1ml反硅化液(95％乙醇，0.5％冰乙酸，2μl反硅化剂)，5min后用95％乙醇轻轻擦洗，除去多余的硅化液和反硅化液并晾干5min。将玻璃装配好并以边条(0.4mm)隔开，装配好电泳系统。用注射器将80ml变性凝胶液(6％丙烯酰胺，7mol/L尿素，0.5×TBE缓冲液，灌胶前加入300μl 10％过硫酸铵和30μl TEMED并迅速混匀)从制胶夹底部小孔缓缓注入，最后插入梳子并加夹子保护，凝聚2hrs后即可电泳。
将电泳槽底部的制胶夹板取下，擦净电泳槽玻璃外侧，将其垂直固定于底座上，上槽和下槽分别加0.5×TBE缓冲液1000ml和500ml，将梳子拔出后立即冲洗点样孔，接通电源120W电泳预热30min，电泳所用仪器为Sequi-Gensequencing cell(Bio-Rad，USA)。选择性扩增产物加入等体积的上样缓冲液(98％去离子甲酰胺，10mmol/L EDTA，0.005％二甲苯青FF，0.005％溴酚蓝)，95℃变性5min后立即冰浴冷却，点样2.2μl。85W左右电泳，当二甲苯青FF跑过2/3胶板时中止电泳(约需2hrs)。
电泳完毕，小心剥下胶板，将其浸入到2L固定液(10％冰乙酸)中，轻轻摇动30min或至指示剂消失为止，然后用去离子水漂洗胶板2次，每次5min。洗毕，转至2L染色液中(0.1％AgNO3，0.056％HCHO)中轻轻摇动染色30min。取出胶板，在双蒸水中迅速漂洗10s，马上转入到2L预冷(10℃)显影液(3％Na2CO3，0.056％HCHO，2mg/L Na2S2O3·5H2O)中，轻轻摇动至条带清晰可见，后取出放回固定液(10％冰乙酸)中停止显影，再用第二次漂洗的双蒸水漂洗5min，室温下自然晾干，拍照保存。
4、目标片段回收扩增的目标片段从1％的琼脂糖胶上用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生物工程公司)进行回收。操作程序按试剂盒提供的方法用刀片挖出目标片段放入1.5ml的离心管，加入Bing Buffer，置于50-60℃水浴中加热10min，每隔2min混匀一次；将融化的胶转移至套在收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min，8,000rmp离心1min；倒掉收集管中的废液，加入500μl Wash Solution，8,000rmp室温离心1min，次步骤重复一次；倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，12,000rmp离心15sec；将UNIQ-10柱放入一根新的1.5ml的离心管中，在柱子膜中央加30μl Elution Buffer或水(pH＞7.0)，室温或37℃放置2min；12,000rmp离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。
5、回收片段克隆和测序取上述回收的目标片段3μl作模板，用相应的引物进行PCR扩增，在1％的琼脂糖胶检测扩增片段是否为所需的目标片段。如果不是则需要重新扩增回收；如果是所需目标片段则进行下一步TA-克隆操作。回收的目标片段连接在pGEMT-easy载体(购自美国Promega公司，北京原平皓生物公司代理)。操作程序按试剂盒提供的方法；试剂盒中试剂在使用前先短暂离心将其收集在管底部；在0.5ml的离心管中建立如下连接反应体系表4目标片段连接在pGEMT-easy载体的反应体系

用移液管来回吸几次混匀，放在4℃冰箱进行过夜连接反应；准备SOC培养基(该培养基成分及用量参见文献)和LB培养基(含有ampli，IPTG和X-Gal)；从-70℃冰箱中取出感受态细胞放在冰上待它慢慢解冻(大约5min)；离心收集连接反应液，取2μl反应液加入到一个已经灭菌的1.5ml离心管(放在冰上预冷)；用手指轻弹装有感受态细胞的管底混匀，取50μl感受态细胞加入装有2μl连接反应液的1.5ml离心管，用手指轻弹混匀，放在冰上20min；在42℃水浴中热激90sec(勿摇动)，然后在冰上放置2min；加950μl的SOC培养基后在37℃振荡培养1.5hrs(150rmp/min)；吸取振荡培养后的转化液100μl涂在无菌的LB培养基(含ampli，IPTG和X-Gal)上，在37℃放置16-24hrs；蓝、白斑筛选，挑选阳性克隆在无菌的液体LB培养基(含ampli)振荡培养16-24hrs；在超净工作台上吸取400μl变浑浊的菌液，其中200μl菌液加200μl 50％无菌的甘油在1.5ml无菌的离心管中于-70℃编号保存，剩余200μl菌液离心收集沉淀，加200μl无菌水混匀，吸3μl菌液作pCR模板，用相应的引物扩增，在1％的琼脂糖胶上检测目标片段是否转化成功。如果转化成功，取相应的编号送给测序公司进行序列测定。
6、SCAR标记的转化SCAR引物设计根据全部序列的信息，在因特网上用Primer3引物设计软件(http://redb.croplab.org/modules/redbtools/primer3.php)设计不同引物，要求GC含量为40％-70％，Tm值为60□-70□，引物内无二级结构，引物间不能相互配对，候选SCAR引物的正反两个方向(Forward，Reverse)长度20bp-25bp，由上海生物工程公司合成。
SCAR标记分析PCR反应体系1×PCR buffer，1.35mmol/L MgCl2，0.08mmol/L dNTPs，1.0U Taqpolymerase(四者均为MBI Fermentas，Lithuania)，50ng DNA，0.45μmol/L正反向引物(Forward，Reverse)，ddH2O补充至终体积20μl。热循环参数为94℃3min；94℃30s，最优复性温度45s(用两个亲本作DNA模板作预备试验，优化复性温度)，72℃60s，38个循环；72℃10min，1个循环4℃保存，反应在PTC-225PCR仪上完成。扩增产物在水平电泳槽上1.2％琼脂凝胶(含EB)分离，使用1×TAE缓冲液，电压3V/cm，电泳1.5hrs左右。电泳完毕，凝胶成像系统(UVP)拍照保存，记录多态性结果。
7、CAPS标记的发展当候选的SCAR引物不能扩增出多态性，则进行CAPS酶切分析，体系为10μlSCAR-PCR扩增产物，1.5μl 10×digested buffer(MBI Fermentas，Lithuania)，1.5U识别4碱基的限制性内切酶(Bsh1236I，HaeIII，RsaI，Sau3AI，AluI，MseI，MBI Fermentas，Lithuania)，37℃酶切3hrs-6hrs。酶切产物电泳分离同SCAR分析8、标记的群体分析和连锁遗传分析用RAPD标记，AFLP标记，SCAR标记和CAPS标记对DH分离群体中的DNA样品逐个进行PCR扩增和电泳检测，计算遗传图距和分析连锁关系。种皮颜色在本研究中表现为单基因差异，按照MAPMAKER软件要求，将黄籽性状赋值为“A”，黑籽赋值为“B”，参与连锁图的构建。理论上，分子标记在DH群体后代只能出现2种带型，即双亲之一带型，对应双亲的带型分别记录为“A”和“B”，难以判读或缺失的带型记为“-”。数据分析用MAPMAKER/EXP Version 3.0(Lander et al，1987；Lincoln et al，1992)软件进行，种皮基因和分子标记间重组值和遗传图距用两点测验计算，标记和基因的连锁图和顺序用三点或多点测验进行(LOD＝4.0，r＝0.3)，遗传图距用Kosambi函数加以转换(Kosambi，1944)。结果表明标记与基因间呈紧密连锁关系，各标记与基因间的重组值在2.4％-9.4％。连锁图覆盖基因组的大小为53.8cM，平均距离为5.4Cm。标记与基因间的顺序和距离详见附图29、田间杂交和分子标记辅助选择以分子标记技术为基础，通过MAS与传统表型选择相结合，辅之以田间表型观察和品质分析，通过杂交—回交—自交的方法，将No.2127-17的黄籽基因导入到恢5148-2，选育出黄籽恢复系。具体过程按附图3所示的分子标记辅助选择回交育种方案进行，进行三次前景选择和三次背景选择。整个过程包括3次杂交，2次回交和1次自交。首先以1141A(该品系于2006年1月18日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC-P200603)与恢5148-2杂交，再以其F1杂种为母本，与由恢5148-2×No.2127-17经小孢子培养而来的黄色种皮DH系(经MAS选择背景偏恢5148-2)作父本杂交，配制三交组合，保证每一代中中选单株均有恢复基因。三交F1与恢5148-2进行两次回交，并自交一次。在此程序中，各个回交世代的每一个单株均进行PCR分析和收获期的考种分析，选出黄籽单株种植下去。
配制三交组合时，还未找到与黄籽基因连锁的分子标记，故只能在田间选择农艺性状优良，表现与恢5148-2最相似的DH系配制比较多的三交组合。成熟收获后，对DH系逐个进行粒色考种和品质分析，选择12个优质黄籽DH系进行背景选择，从中选择两个优良DH系，相应地将其配制三交组合种植下去，其余组合被淘汰。BC1F1中用黄籽基因特异标记S1129和S1130，BC2F1中用SCS1130、S1130和S1129对每一单株进行黄籽基因选择(前景选择)，每一代结合田间考察，淘汰大约一半非目标单株(黑籽单株)。对中选单株采用两步法进行背景选择，其中BC1F1用RAPD标记，BC2F1用AFLP标记进行分析，最后每代中选3个单株，同时套袋自交，对这些中选单株和杂交当代种子进行品质分析，根据各个组合的田间表现，选择其中一个组合进行MAS分析。BC2F2中存在着黄籽性状分离，用共显性标记SCA1进行纯合黄籽单株的选择。中选单株与1141A配制组合，进行比较试验本发明的积极效果本发明寻找到与黄籽性状紧密连锁的RAPD和AFLP分子标记，并将其中的两个转化成稳定的显性SCAR标记和共显性的CAPS标记，利用该分子标记进行黄籽油菜的辅助育种，可以克服黄籽油菜育种过程中根据表型选择的缺点，大大的减少工作量，缩短育种年限，快速的培育新品种。


图1油菜籽粒种皮颜色划分为6个级别，图中括号内的值为色度值图2甘蓝型黄籽油菜种皮基因的RAPD，AFLP，SCAR和CAPS标记的遗传连锁图。左边为图距，用cM表示，右边为标记图3黄籽性状回交导入到恢5148-2的分子标记辅助选择选育方案图4 S1130(RAPD，A)和EA07MC13(AFLP，B)在构成基因池的各个DH系上的扩增效果图。泳道1为No2127-17，泳道2为黄籽基因池，泳道3为黑籽基因池，泳道4为恢5148-2，泳道5-14分别为构成黄籽基因池的各个DH系，泳道15-24分别为构成黑籽基因池的各个DH系，M示分子量大小，箭头所示为分子标记，*示交换DH系图5 SCS1130(SCAR，A)和SAC1(CAPS，B)标记在构成基因池的各个DH系上的扩增效果图。泳道1为No.2127-17，泳道2为黄籽基因池，泳道3为黑籽基因池，泳道4为恢5148-2，泳道5-14分别为构成黄籽基因池的各个DH系，泳道15-24分别为构成黑籽基因池的各个DH系，M示分子量大小图6 RAPD引物S86在BC1F1群体中的背景选择效果图。P1为黄籽亲本No.2127-17，P2为黑籽亲本恢5148-2，其余为不同的单株，箭头所示为多态带图7 SCS1130的在部分BC2F1群体的单株前景选择的效果图。P1为黄籽亲本No.2127-17，P2为黑籽亲本恢5148-2，其余为不同的单株，箭头所示为黄籽单株的特异带图8 SCA1在BC2F2群体中的部分单株选择结果。P1为黄籽亲本No.2127-17，P2为黑籽亲本恢5148-2，其余为不同的单株，箭头所示为纯合的黄籽单株。
具体实施例方式
实施例11)建立双单倍体(DH)群体在本实施例中，以恢5148-2作母本，甘蓝型黄籽油菜No.2127-17作父本进行杂交，得到F1，利用F1植株的花粉经小孢子培养(小孢子培养方法参见文献，余风群等，提高甘蓝型油菜小孢子胚状体成苗率的某些培养因素研究，作物学报，1997，23(2)165-168)得到127个双单倍体(简称DH)群体。
2)DNA的提取和基因池的建立从步骤1得到的群体中的小苗中提取和纯化DNA，具体制备方法参照李佳等(李佳等，一种有效提取油菜叶片总DNA的方法，华中农业大学学报，1994，13(5)521-523)报道的方法进行。黄籽基因池和黑籽基因池的构建方法参见上述详尽的技术方案中的2中所述。
3)集团分析法(BSA)与RPAD和AFLP技术相结合筛选与油菜黄籽基因紧密连锁的分子标记在810条RAPD引物(S1-S410，S1000-S1400，购自上海生物工程有限公司)中有240(29.6％)条表现出多态性，240条RAPD引物和512对AFLP引物组合(EA/MC和EA/MG组合，AFLP接头和引物序列设计均按Vos等(Vos et al.AFLPa new technique for DNA fingerprinting.Nucleic Acids Res，1995，234407-4414)报道方法进行，由上海生物工程有限公司合成)在双亲及基因池间进行筛选表明，4个RAPD和16个AFLP组合在两个基因池间表现出多态性。进一步分析表明，2个RAPD和8个AFLP标记与黄籽基因紧密连锁，在构成基因池的20个DH系上重组值小于15％(见图4)。10个标记在127个DH系的群体上连锁分析表明，10个标记在同一连锁群上，其中2个RAPD和5个AFLP与黄籽基因呈相引连锁，另外3个AFLP标记与其呈相斥连锁(附图2)，各标记的特征见表5。
表5与黄籽基因连锁的RAPD、AFLP标记的引物序列，相位，大小和遗传图距

E＝EcoRI primer，5’-GACTGCGTACCAATTC-3’；M＝MseI primer，5’-GATGAGTCCTGAGTAA-34)将上述步骤3)筛选到的与黄籽基因紧密连锁的RAPD，AFLP标记转化为SCAR标记和CAPS标记将AFLP差异片段先从PAGE胶上在各自的亲本带中回收。S1129和S1130的特异片段和8个AFLP标记重扩增产物在琼脂糖胶上分离，SK1131试剂盒(购自上海生物工程有限公司)进回收纯化。直接将纯化回收产物与pGEMT-Easy载体(Promega Corp，#A1360 Madison，Wis)连接转化大肠杆菌，涂布于LB(含amp)固体培养基平板上，37℃培养过夜。每个片段用牙鉴挑6-10个白色单菌落，接种在LB(含amp)液体培养上过夜，取5μl培养液作DNA模板，SP6/T7引物(购自上海生物工程有限公司)进行PCR检测，结果表明，10个标记片段均有90％左右的阳性克隆，获得了阳性重组子。每个片段选择两份阳性克隆的菌样送到上海生物工程有限公司测序。测序结果表明，各个AFLP标记序列5＇末端和3＇末端分别包含有Mse I和EcoR I酶切位点以及完整的AFLP引物序列；两个RAPD标记序列的两端含有相应的引物序列或互补序列。
根据它们序列测序结果，在整个序列信息基础上，用Primer3软件(http://redb.croplab.org/modules/redbtools/primer3.php)各设计一对最优引物。各引物先在亲本No.2127-17和恢5148-2之间扩增，优化PCR反应条件，确定退火温度，建立最优的反应体系。再在两亲本和两基因池间，并在各自最优条件下PCR扩增，寻找多态性，结果显示，S1130的SCAR引物在两亲本和两基因池表现出多态性(附图5)，表明S1130标记发展成了一个显性SCAR标记，命名为SCS1130。
未发展成SCAR标记的引物的PCR产物分别用相应的内切酶(MBI Fermentas，Lithuania)在两亲本和两基因池进行酶切，寻找差异。酶切结果显示，只有EA05MC12/Bsh1236I引物酶组合的产物揭示出多态性(附图5)，EA05MC12标记被发展成一个共显性的CAPS标记，命名为SCA1。SCS1130和SCA1的特征见表6所示。
表6 SCAR和CAPS标记的特征

上述分子标记SCS1130的DNA序列如序列表SEQ ID NO1所示；标记SCA1的DNA序列如序列表SEQ ID NO2所示。
用SCS1130和SCA1在定位群体上作连锁分析表明，它们仍处在黄籽基因两侧，遗传距离分别为3.2cM和3.9cM。MAPMAKER/EXP 3.0程序将这两个标记和原来10个RAPD和AFLP标记定位到同一连锁群，在连锁群上的顺序和距离见附图2选用一个有353个单株(169株黄籽和184株黑籽)的BC1F1回交群体对SCS1130和SCA1进行评价。表明这两个标记在甘蓝型黄籽油菜基因型的鉴定上有较强能力，能够准确选出黄籽基因型(表7)。
表7 SCS1130和SCA1标记在BCF1的分析结果表

注+/-，特异带的有无实施例2亲本材料分别为甘蓝型油菜恢5148-2、No.2127-17、Pol cms不育系1141A(来源如前所示)。各个单株DNA采用小量法提取。
在黄籽基因回交转育过程中，用SCS1130、SCA1进行前景选择(黄籽基因的跟踪)，遗传背景的选择选用RAPD和AFLP标记。具体过程按附图3所示的分子标记辅助选择回交育种方案进行，进行三次前景选择和三次背景选择。整个生育期内进行各组合和单株农艺性状观察，主要考察长势长相、株叶形态、整齐度、生育期等，对几个重要株系进行室内考种，比较中选株与恢5148-2的异同以及其配制组合与恢5148-2组合的异同。品质分析由华中农业大学油菜研究室品质分析分室完成，采用近红外分析方法。
每个单株根据带型有无分别赋值为1和0。按Nei和Li(Nei et al.Mathematical model for studying geneticvariation interms of restriction endonucleases.Proc Natl Acad Sci USA，1979，76269-573)的方法计算各材料与轮回亲本恢5148-2的相似系数和遗传距离。相似性分析采用UPGMA(Unweighted pair group witharithmetric average，算术平均数非加权类平均法)方法进行聚类分析。
具体步骤如下1)制三交组合以1141A为母本，恢5148-2为父本杂交得F1，选择DH(恢5148-2×No.2127-17)群体中的65个DH系做父本与F1杂交，得到三交组合。
2)RAPD引物对上述1中配制三交组合的DH系进行背景选择选用多态性最好的142条多态性RAPD引物，对12个品质较好、种子饱满、粒大并配制三交组合的黄色DH系进行遗传背景与恢5148-2的相似性分析。结果显示，共扩增出830条带，多态性带314条，并进行聚类分析，筛选出两个与恢5148-2遗传距离最小的DH系DH21和DH146，田间观察发现这两个DH系表现与恢5148-2最相似，与背景选择结果相一致。
3)上述2中中选的两个DH系配制的三交组合进行回交和自交将这两个DH系(DH21和DH146)配制的三交组合种植到田间，在花蕾期，选取可育单株，用恢5148-2与之回交，获得两个回交BC1F1(BC1-21F1，BC1-146F1)群体，并将三交组合自交获得三交组合F2(F2-21和F2-146)。
4)用SCS1130和SCA1对上述3中的组合进行前景选择用RAPD引物对上述3中的组合进行背景选择收获上述3中的组合，考种结果表明，三交组合F2(F2-21、F2-146)种皮颜色均为黄色，品质分析表明二者品质较好，含油量高，两个回交当代种子(BC1-21F0、BC1-146F0)品质分析较好，根据品质分析结果，结合田间两个BC1F1组合长势长相、叶片颜色和形状、整齐度等性状表现，选择其中一个与恢5148-2最相似的组合BC1-146F1进行MAS选择。用SCS1130和SCA1对BC1-146F1的单株进行黄籽性状的选择，检测结果S1129共检测到175个阳性黄籽单株，S1130共检测到170个阳性株黄籽单株，二者均检测到的阳性单株0 共169株(见表10)。
5)用RAPD引物对上述3中的组合进行背景选择结合田间单株生长情况，在上述4选择的169个单株中选择生长健壮，生长势旺盛的142株阳性单株作背景分析。先用多态性最好的30条RAPD引物对这142个阳性单株进行背景选择(附图6)，以此为资料进行聚类分析，筛选出46个与恢5148-2遗传距离最近的单株。另增加58条RAPD引物进行下一步背景选择。结合田间生长情况，最后选择生长健壮，与恢5148-2距离最小的3个单株25#，85#，49#(表8)。
6)上述4中选择的单株回交和自交将上述4中中选单株25#，85#，49#与恢5148-2回交，获得BC2F1群体(BC2-25F1，BC2-85F1，BC2-49F1)，同时将三株自交获得BC1F2(BC1F2-25，BC1F2-85，BC1F2-49)。3个BC1F2和回交当代(BC2F0)的种子颜色为黄色，与标记选择结果相一致，说明所选组合含有黄籽基因。
7)对上述5中收获的6份种子进行前景选择对上述5中收获的6份种子进行品质分析，结合田间3个BC2F1群体的生长情况、整齐度、株叶形态等表现，选取BC2-85F1群体，用SCS1130和SCA1进行新一轮MAS前景选择(附图7)，筛选含有黄籽基因的单株，选择结果表明SCS1130选择到107株阳性黄籽单株，S1130检测到108株，S1129检测到109株，三者之间无双交换发生，共同检测到107株单株。SCS1130由S1130发展而来，选择结果与S1130有较大同一性，特异性高，错选率低(表10)。并结合田间各单株生长情况，选择生长健壮的94株黄籽阳性单株作MAS背景分析。
8)用AFLP引物对上述6中选择的单株进行背景选择选用20对AFLP引物对上述6中中选的94个单株进行背景分析，筛选出与恢5148-2遗传距离最近的46个单株。另外增加40对AFLP引物，对这46个单株进行下一步背景选择，结合田间生长情况，选出3株与恢5148-2遗传距离最小的单株278#、248#、243#(表8)。
9)上述7中中选的单株进行自交和杂交对上述7中中选的3个单株278#、248#、243#套袋自交获得BC2F2(BC2F2-278，BC2F2-248，BC2F2-243)，并与1141A配制杂交组合，进行初步比较实验。
表8 BC1F1和BC2F1中与恢5148-2遗传距离最小的10个单株

10)对上述步骤9)中的自交和杂交组合进行前景选择对上述步骤9)中的3个BC2F2的种子进行品质分析和种皮颜色比较后，根据3个BC2F2群体的整齐度，生长势，株叶形态等田间表现，用共显性标记SCA1对其中一个整齐一致、生长势旺盛、品质较优的BC2F2-248群体进行MAS分析(见附图8)。用共显性标记SCA1对BC2F2-248群体的49个单株进行分析结果表明显性纯合(黄籽)∶杂合(黄籽)∶隐性纯合(黑籽)比例为9∶23∶17，卡平方值为2.79(x20.05，2＝5.99)，符合1∶2∶1的预期分离比，与BC2F2后代的表型鉴定结果基本一致，错选机率为6.12％(表10)结果表明显性纯合(黄籽)共有9株，其中2株后期不抗病、性状差予以淘汰。
11)对上述步骤10)中选择的单株进行自交和杂交对上述9中中选的7个纯合单株(402#，405#，422#，433#，440#，445#，447#)套袋自交，并与1141A配制杂交组合(包括恢5148-2)，进行下一步比较实验。收获7个纯合单株的BC2F2∶3，及其相应杂交组合进行品质分析和种皮颜色分析结果表明，7个单株种皮颜色均比亲本No.2127-17深，而所配杂交组合颜色比中选单株颜色深，含油量较恢5148-2均得到提高，与No.2127-17相当，芥酸降到零芥水平，硫苷含量较轮回亲本增加，约为两亲本均值，中硫水平，表明已经成功将No.2127-17的黄籽基因导入到恢5148-2中，硫苷水平需要作进一步的改良(品质性状分析见表9)。7个杂交组合正在一年多点比较实验，将最终决定当选单株。
表9不同材料的品质性状分析表


各个标记前景选择准确性比较各种分子标记选择结果与田间根据表型鉴定结果进行比较发现随着世代增加，每一个标记选择准确率降低，而且错选率均比标记重组值大，极不一致。多个单侧标记并未能较大提高准确率，标记与目标基因遗传图距越小，其选择准确率越高；双侧标记选择准确率比单侧标记的准确率要高得多。前景选择的准确性主要取决于标记与目标基因的连锁程度，标记与基因连锁的愈紧密，依据标记进行选择的可靠性愈高。因此在实际应用中，优先考虑选择2个位于基因两侧最近的分子标记，这样不仅可以提高准确率，而且可以增加中选个体与受体亲本遗传背景同质性(见表10)。
表10本发明的各标记对各世代的选择准确性比较表

注1)2)数据来自于分子标记评价实验；+/-，特异带的有无Note1)2)the data are from the two makers’validation experiment；+/-，presence/absence of the specific fragmen上述测试分子标记均为本发明所克隆的。
序列表<110>华中农业大学<120>人工合成的甘蓝型黄籽油菜的分子标记及其应用<130>
<141>2006-01-19<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>338<212>DNA<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)<220>
<221>gene<222>(1)..(338)<223>
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<221>primer_bind<222>(1)..(21)<223>
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<220>
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<400>2ttgctcaatg tgactcttgc tcccctcgag accccaaaac caagattgcc tcttttgtca 60agatctatag acctttccaa aatcttcaag gagcaaatgt tttttgggtt ctccgggagc120acgggtacga ccagaagtca tcaatatatt cttggttggt cactggctat aggcggaaaa180gcgcaaagcc ttgacatttc tcaggtaatg gatctccctc gaccgccacc tgatcactta240ccgcttatac tcgcggttgc atcagtagtt gctttcctga taatagcagg cggaatagcg300tacctttacc aacggaatag gtatgcggaa gtgtttgaac aatgggaatt acaatacagc360ccccagagat tctccttcag aaccctgtat aaagcaacca aaggtttcaa ggagaataga420gtgcttggag ctggaggttt cggcaaggtt tacagaggag agctt46权利要求
1.一种人工合成的甘蓝型黄籽油菜的分子标记SCS1130，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示；标记SCA1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO2所示。
2.权利要求1所述的人工合成的甘蓝型黄籽油菜的分子标记的制备方法，它包括下列步骤1)以甘蓝型油菜品系恢5148-2为母本，以黄籽油菜品系No.2127-17为父本杂交，得到F1种子，将所述的F1种子播种得到F1油菜植株，取该植株花粉进行小孢子培养，获得双单倍体(DH)分离群体；2)采用集团分析法构建油菜黄籽集团和黑籽集团两个基因池；3)设计两亲本间有差异的引物对上述步骤2)构建的两个基因池进行PCR扩增，选表现有差异的引物再对基因池间各单株的DNA样品进行PCR扩增和电泳检测，确定为其性状为连锁标记后，再对DH群体的各单株的DNA样品进行PCR扩增和电泳检测；4)回收、克隆、测序步骤3)筛选得到的与甘蓝型油菜的黄籽基因紧密连锁的RAPD和AFLP标记的片段；5)根据步骤4)的测序结果设计特异引物，将筛选到的与甘蓝型油菜黄籽基因紧密连锁的RAPD和AFLP标记转化为SCAR标记；6)将步骤5)中未成功转化的SCAR标记发展为CAPS标记；7)将步骤3)、5)和6中的RAPD标记、AFLP标记、SCAR标记和CAPS标记进行群体分析和连锁遗传分析；8)利用步骤7)的分子标记及辅助选择将油菜黄籽基因导入到甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育恢复系中，选育得到黄籽型油菜恢复系。
3.权利要求1所述的分子标记在油菜育种中的应用。
全文摘要
本发明属于油菜育种技术领域，具体地说属于利用分子标记辅助选育甘蓝型黄籽油菜新品种技术领域。本发明通过选择合适的亲本进行杂交得到F1植株，通过小孢子培养得到双单倍体(DH)分离群体，通过构建油菜黄籽集团和黑籽集团两个基因池、设计特异引物、PCR以及回收、克隆、测序等步骤筛选得到与甘蓝型油菜的黄籽基因紧密连锁的RAPD和AFLP标记的片段；该DNA片段命名为SCS1130和SCA1两个分子标记，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO1或2所示。已将上述分子标记成功地应用于甘蓝型黄籽油菜群体和连锁遗传分析。本发明还公开了该分子标记的制备及其用于辅助育种的方法。本发明为油菜的分子育种提供了新的实用标记基因和新的利用方法。
文档编号A01H5/12GK1840710SQ20061001825
公开日2006年10月4日 申请日期2006年1月19日 优先权日2006年1月19日
发明者涂金星, 傅廷栋, 陈宝元, 马朝芝, 李兴华 申请人:华中农业大学