专利名称：：耐大豆疫霉根腐病的数量遗传位点确定方法及该位点应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及分子辅助育种领域，尤其是涉及选择及其利用与耐大豆疫霉根腐病相关的数量基因遗传位点(QTL)进行辅助育种，以提髙耐大豆疫霉根腐病育种效率。
背景技术：
：大豆疫霉根腐病(户A^o/力t/oraW"of5by力ea/7)是由大豆疫霉菌(尸Ar^/7力"oras^'朋)引起的一种对大豆危害较大的土传性真菌病害。该病危害严重，减产明显。感病品种可造成产量损失可达25-50%,有时达10096,是毁灭性的病害之一，而且有逐年增加的趋势。大豆疫霉根腐病于1948年首次在美国的印地安那州发现，而后在澳大利亚、加拿大、巴西、阿根廷、印度、中国等二十几个国家都相继发生，可见，由尸力j^o/7力Mora^j3e引起的大豆疫霉根腐病已成为一个主要的世界性大豆病害。我国由于病原菌分离技术等方面的原因，直到1989年才由沈崇尧和苏彦纯首次在中国大豆主产区黑龙江省分离成功，证实了该菌在我国的存在。到1997年，大豆疫霉根腐病已在黑龙江省的29个县(市)和4个国营农场发生，发病面积达120万亩；1998年黑龙江省的34个县、5个国营农场分局、460万亩大豆田出现该病害(张淑珍，2002)。近几年，大豆疫霉根腐病在黑龙江省的发病面积呈扩大蔓延趋势。近些年来，随着分子标记辅助育种技术发展，提供了一种定向快速有效的育种途径，例如该方法在水稻上辅助选育新品种已有成功的先例，且在提高育种速度和加快育种进程方面优势明显。彭应财等(2003)利用分子标记辅助选择技术把白叶枯病抗性基因iai7导入到强优恢复系辐恢838中，选育出抗白叶枯病恢复系中恢218，组配出强优势杂交中晚稻新组合协优218。该组合具有产量较高、抗白叶枯病、易制种等特性，于2002年2月通过江西省品种审定。曹立勇等(2005)利用分子标记辅助选择育种技术育成带有抗白叶枯病基因Iai7的恢复系中恢8006，再与印水型胞质不育系中9A组配的中晚兼用杂交稻新组合。并于2004年3月通过江西省品种审定，2004年10月通过国家审定，定名为国稻l号。但因为耐大豆疫霉根腐病相关的主效QTL挖掘的困难，至今尚未有与耐大豆疫霉根腐病相关的主效QTL的报道。
发明内容本发明的目的是提供一种耐大豆疫霉根腐病的数量遗传位点的确定方法和应用，从而从遗传基因上对大豆疫霉根腐病进行阻击，通过辅助育种，以提高耐大豆疫霉根腐病育种效率。本发明的目的是这样实现的一种耐大豆疫霉根腐病的数量遗传位点的确定方法，用耐病品种和感病品系进行杂交并获得重组自交系，提取DNA用不同引物进行扩增，分离后获得基因型数据，分析并构建大豆遗传连锁图，通过回归计算确定与耐大豆疫霉根腐病相关的主效数量遗传位点QTL，确定表现型与基因型之间的关系并选育耐病品种、系。所述的耐大豆疫霉根腐病的数量遗传位点的确定方法，所述的用耐病品种和感病品系进行杂交并获得重组自交系，是用耐病品种作为早本和感病品系作为父本^进行杂交，得到杂种F^由杂种F,代自花授粉获得子代，通过子代单粒传法SSD获得F6代重组自交系。所述的耐大豆疫霉根腐病的数量遗传位点的确定方法，所述的提取DNA用不同引物进行扩增，分离后获得基因型数据，为分别提取每个重组自交系大豆叶片的DNA，采用随机引物RAPD、简单重复序列引物SSR和序列特征应用区间引物SCAR进行PCR扩增，再进行电泳分离，获得每个重组自交系基因型数据。所述的耐大豆疫霉根腐病的数量遗传位点的确定方法，所述的分析并构建大豆遗传连锁图，通过回归计算确定与耐大豆疫霉根腐病相关的主效数量遗传位点QTL,是对每个重组自交系基因型数据分析、构建大豆遗传连锁图，用混合菌株进行接种鉴定并且统计病害损失率，用表现型数据分析，与大豆遗传连锁图谱进行QTL分析，将通过回归计算QTL存在的阙值，确定与耐大豆疫霉根腐病相关的主效数量遗传位点QTL。一种耐大豆疫霉根腐病的数量遗传位点在防止大豆根腐病方面的应用。本发明的优点研究表明大豆疫霉菌与大豆品种之间互作具有基因对基因的特性(Whisson等，1995)。据有关报道，已在7个位点发现13个具有抗病作用Rps基因。据此，世界绝大多数国家采用选育具有垂直抗性的品种，但目前为止还没有发现抗所有生理小种的基因(Ward1990,Anderson和Buzzell，1992)且大豆疫霉菌在与寄主抗病性互作中，其毒力也在演变和快速进化，新的生理小种不断出现，国际上已报道了63个大豆疫霉菌生理小种(Morgan,1965;Leitz和Hartman，2000)。更为严重的是新出现的生理小种往往对已有的抗病基因具有巨大的毒害作用。因此选育具有耐病基因的新品种，减轻新出现生理小种巨大压力，已是亟待解决的问题(Shafer1971，Thomisoneta1.1988)。但通过常规育种选育耐大豆疫霉根腐病品种(系)十分困难，因为自然发病的大豆疫霉根腐病鉴定圃很难获得，耐病性品种的鉴定受生态环境影响极大、年际间变化极大，选出的品种不稳定，而且需耗费大量人力和物力进行多年多点进行鉴定。这是耐大豆疫霉根腐病育种进展缓慢的主要原因之一。本发明正是在这种情况下作出了显著的突破。与耐大豆疫霉根腐病相关的数量遗传位点(QTL)获得后，利用用耐病品种Conrad(早)和感病品系0X760-6-1(6)进行杂交所得的R代进行耐病性的预测，先从各家系的叶片中分离DNA，然后分别利用简单重复序列标记引物(SSR)Satt334和Satt509进行PCR扩增，通过检测是否存在数量遗传位点(QGP1，QGP2，QGP3，QFP1)来预测这些家系是否存在耐病性。用来自中国黑龙江省鸡西、双鸭山、建三江和北美的混合菌株进行接种鉴定并且统计病害损失率，三次重复。并与预测结果进行对比(表l)。预测结果与实际结果非常吻合。基因型与表现型非常吻合(表l)。表l与耐大豆疫霉根腐病相关的数量遗传位点的应用家系L6L9L10LllL3L34L10L86L8L9准确4482性鸡西12.12.9.410.9.84.97909589损失率(％)16044495663.64.67..4371双鸭山7.98.723.8.69.89.81.78.8582损失率(％)5856731579693.4.956建三江20.1810.12.2996.88.87.8985损失率(％)76.969696.8789622.9.6557北美17168.11178783879599损失率(％).5.3493.89..92.33.89..4.342266Satt334VVVVVSatt509V>/VVV100%100%本发明能够克服耐病性鉴定受环境影响大，且缺少稳定耐病性鉴定圃的缺点。本发明得到的基因在苗期就能够通过分子标记对大豆品种(系)的大豆疫霉根腐病耐病性进行预测和筛选、淘汰感病植株，减少人力和物力的浪费，提高育种效率。图l:为与耐大豆疫霉根腐病相关的数量遗传位点(QTL)，图中B用来自中国黑龙江建三江混合菌株在室温鉴定；A用来自中国黑龙江鸡西混合菌株在室温鉴定；女用来自中国黑龙江双鸭山混合菌株在室温鉴定。附图2:为与耐大豆疫霉根腐病相关的数量遗传位点(QTL)，的国外技术情况:參在北美Weaver于2000年的田间鉴定；令在北美Weaver于2000年的田间鉴定。具体实施方式实施例l:与耐大豆疫霉根腐病相关的数量遗传位点(QTL)的确定(1)Conrad重组自交系的构建及耐病性鉴定用耐病品种Conrad(早)和感病品系0X760-6-1($)进行杂交，得到杂种F,;由杂种Fi代自花授粉获得子代，通过子代单粒传法(SSD)获得Fe代重组自交系；用来自中国黑龙江省鸡西、双鸭山、建三江和北美的混合菌株进行接种鉴定并且统计病害损失率，三次重复。(2)遗传图谱构建及QTL分析选取在父母本间具有扩增多态性39个随机引物(RAPD)、89个简单重复序列标记引物(SSR)和l对序列特征应用区间引物(SCAR)进行PCR扩增，根据条带在群体中的分离情况，将有母本类型条带的个体记为"A"，有父本类型条带的个体记为"B"，杂合的和缺失不清的记为"_"。利用Mapmaker/EXP3.0作图软件，构建分子标记连锁图谱。应用Gro叩命令进行连锁分析和分组(L0D=5.0)，连锁标记少于8个的用Compare命令进行优化排序，多于8个的用Ripple命令排序，错误检测水平设为1%，利用Kosambi函数将重组率转化为遗传图距(cM)。根据已由Cregan(1999)等定位的SSR标记作为锚定标记以确定相应的连锁。将通过回归计算QTL存在的阙值为27.14(1000atP^0.05),确定与耐大豆疫霉根腐病相关的主效数量遗传位点(QTL)。与耐大豆疫霉根腐病相关的主效数量遗传位点(QGPl,QGP2，QGP3，QFP1,见具体区间见图l),分别采用引物Satt334和Satt509进行PCR扩增，扩增在6%的聚丙烯凝胶(100毫升聚丙烯凝胶含有5.7克丙烯酰胺，0.3克双丙酰胺)电泳上分离后，它们所得产物分别为231bp和344bp.表l与耐大豆疫霉根腐病相关的数量遗传位点的应用<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求1.一种耐大豆疫霉根腐病的数量遗传位点的确定方法，其特征是用耐病品种和感病品系进行杂交并获得重组自交系，提取DNA用不同引物进行扩增，分离后获得基因型数据，分析并构建大豆遗传连锁图，通过回归计算确定与耐大豆疫霉根腐病相关的主效数量遗传位点QTL，确定表现型与基因型之间的关系并选育耐病品种、系。2.根据权利要求1所述的耐大豆疫霉根腐病的数量遗传位点的确定方法，其特征是所述的用耐病品种和感病品系进行杂交并获得重组自交系，是用耐病品种作为早本和感病品系作为父本^进行杂交，得到杂种F,;由杂种R代自花授粉获得子代，通过子代单粒传法SSD获得F6代重组自交系。3.根据权利要求1或2所述的耐大豆疫霉根腐病的数量遗传位点的确定方法，其特征是所述的提取DNA用不同引物进行扩增，分离后获得基因型数据，为分别提取每个重组自交系大豆叶片的DNA，采用随机引物RAPD、简单重复序列引物SSR和序列特征应用区间引物SCAR进行PCR扩增，再进行电泳分离，获得每个重组自交系基因型数据。4.根据权利要求1或2所述的耐大豆疫霉根腐病的数量遗传位点的确定方法，其特征是所述的分析并构建大豆遗传连锁图，通过回归计算确定与耐大豆疫霉根腐病相关的主效数量遗传位点QTL，是对每个重组自交系基因型数据分析、构建大豆遗传连锁图，用混合菌株进行接种鉴定并且统计病害损失率，用表现型数据分析，与大豆遗传连锁图谱进行QTL分析，将通过回归计算QTL存在的阙值，确定与耐大豆疫霉根腐病相关的主效数量遗传位点QTL。5.根据权利要求3所述的耐大豆疫霉根腐病的数量遗传位点的确定方法，其特征是所述的分析并构建大豆遗传连锁图，通过回归计算确定与耐大豆疫霉根腐病相关的主效数量遗传位点QTL，是对每个重组自交系基因型数据分析、构建大豆遗传连锁图，用混合菌株进行接种鉴定并且统计病害损失率，用表现型数据分析,与大豆遗传连锁图谱进行QTL分析，将通过回归计算QTL存在的阙值，确定与耐大豆疫霉根腐病相关的主效数量遗传位点QTL。6.—种耐大豆疫霉根腐病的数量遗传位点在防止大豆根腐病方面的应用。全文摘要耐大豆疫霉根腐病的数量遗传位点的确定方法及该位点应用。利用随机引物(RAPD)及简单重复序列引物(SSR)和序列特征应用区间引物(SCAR)对耐病性品种(♀)×感病品系(♂)的后代家系的DNA进行分析(基因型数据分析)。再用国内外混合菌株对后代家系进行接种鉴定并且统计病害损失率(表现型数据分析)。通过回归计算大豆疫霉根腐病的耐病数量遗传位点(QTL)存在的阙值，利用WinQTLCarter2.0检测是否存在大豆疫霉根腐病的耐病数量遗传位点(QTL)。通过对母本及其家系或衍生品种的DNA测定，来判断该家系或衍生品种是否含有该数量遗传位点(QTL)，可预测该家系或衍生品种是否存在耐病性，从而加快耐大豆疫霉根腐病品种(系)的选育速度。文档编号A01H1/02GK101372710SQ200710072698公开日2009年2月25日申请日期2007年8月24日优先权日2007年8月24日发明者李文滨,滕卫丽,韩英鹏申请人:李文滨