专利名称：：一种泡桐肉桂酰CoA还原酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种肉桂酰CoA还原酶(cinnamoylCoAreductaseCCR)基因及其应用，属于生物工程领域，特别涉及到泡桐科(Paulowniaceae)泡桐属(Paulownia)白花泡桐〔Paulownia.fortunei(Seem)Hemsl〕)编码CCR基因及其应用。
背景技术：
：1、关于泡桐及其泡桐木材的材质改良泡桐(Paulownia)为泡桐科(Paulowniaceae)泡桐属(Paulownia)落叶乔木，原产我国，除个别种[白花泡桐(P.fortunei(Seem)Hemsl.]分布到越南、老挝外，其他各种均为我国所特有。泡桐是世界三大优质、速生用材树种之一，分布范围很广，二十三个省、市、自治区都有。不少地区作为四旁植树、农桐间作、林网建设的主要树种；有些地方还逐渐向山地造林发展，栽培量很大，仅河南省栽植的泡桐就达二亿株左右。泡桐生长快，如果管理得好，泡桐五六年即可成材。泡桐材质轻，纹理鲜明美观，易干燥，易加工、不翘、不裂、不易变形、不易燃烧，绝缘性好，耐酸耐腐，防湿隔热，导音性能好等优点，是单板与人造板生产的重要原料；特别适合制作航空、舰船模型、救生器械及乐器及家具制作等，不但用于工农业及日常生活等各个方面，而且也是我国传统的出口物资，在我国林业生产中占有特殊地位。但是应该看到，泡桐木材材质的另一面轻(容重低)，强度与硬度低，严重限制了它在建筑、交通、家装、家具、造纸等方面的应用范围与应用价值。因此，改良泡桐的材质，提高其强度与硬度，拓宽其应用范围具有重大的应用与经济价值。泡桐的材质改良有两个方向。一是提高其强度与硬度，拓宽其木材建筑、交通、家装与家具等方面的应用；二是提高木材中纤维素的含量，降低其木质素的比率，以提高纸浆的产量、降低对环境的污染，更适用于造纸。2、关于木材的材质改良肉桂酰CoA还原酶基因的关系我们知道木材的材质或特性主要是由木纤维的基本组分--木质素、纤维素的单体种类、性质及其比率与总量决定的。纤维素约占木材干重的4050%，木质素约占1536%，二者总计占到木材总中的70%以上，且二者均直接或间接来源于光合作用产生的光合产物。纤维素是纤维素则是木材中的骨架、韧性成分，是由葡萄糖组成的大分子多糖。木质素是由对香豆醇、松柏醇、5-羟基松柏醇、芥子醇四种醇单体形成的一种复杂酚类聚合物。木质素是木材细胞间的粘合剂、刚性原料和保持性物质。木质素生物合成是一个极其复杂过程，涉及苯丙氨酸裂解酶(PhenylalanineammonialyasePAL)、4-香豆酸CoA连接酶(4-coumarate:CoAligase4CL)、肉桂酰CoA还原酶(cinnamoyl-CoAreductaseCCR)等多个基因。这些基因的功能、作用不同，并分处在木质素生物合成的源头、中、下游不同位置，其中PAL是位于源头的第一个酶，处于最高端；4CL位于中游，而CCR则处于较下游的位置。这些酶中的任何一种酶，都不能缺失、不能替代；任一种酶的失常都将影响木质素的合成，导致材质的变化，且影响的范围、形式与结果不同。木材材质改良的实质，就是通过改变木质素、纤维素生物合成关键酶基因，调控木质素、纤维素单体种类、性质及其比率与总量。CCR是木质素特异途径的第一个关键酶，催化羟基肉桂酰-辅酶A硫酯还原成相应的肉桂醛，是木质素合成途径的碳向木质素分配的控制关节点，对木质素单体的生物合成起着重要作用。增强CCR基因的表达，提高CCR酶的活性，可以提高木质素在木材中的比率，可以提高其强度与硬度；反之，沉默或抑制CCR基因，会降低其在木材中的比率，提高纤维素的比率，用于造纸则可提高纸浆的产量，降低木质素对环境的污染。
发明内容本发明提供了一种来源于泡桐科(Paulowniaceae)泡桐属(Paulownia)白花泡桐(Paulowniafortunei(Seem.)Hemsi)的肉桂酰CoA还原酶基因序列及其相应的氨基酸序列。提供了含有CCR的克隆载体PUc19/CCR和含有这种载体的E.coli细胞JM109/pUC19/CCR。泡桐CCR的DNA序列或其片段通常可以依据本发明提供的mRNA、氨基酸序列信息资料以PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核昔酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，按本领域技术人员己知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。获得有关的序列后，用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工化学合成的方法来合成有关序列。在本申请之前，现有技术已完全可以通过先合成多个多核昔酸小片段，然后再进行连接而获得编码本发明CCR基因的核昔酸序列。然后，可将该核昔酸序列引入本领域中各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。利用本发明成果，可以构建CCR基因工程菌，用于植物的基因转化，达到改良植物品质或材质的目的。本发明中CCR基因的克隆，采用的技术方案是基于基因的同源性，利用简并寡核苷酸引物的RT-PCR法，以白花泡桐RNA为模板，首先用简并引物引物，通过RT-PCR的方法，得到了CCR基因的部分cDNA片段。然后，据此片段提供的cDNA序列信息，设计了2条反向嵌套式引物与2条正向嵌套式引物，用RACE方法获得了未知的5'和3'端基因片段。最后，将获得的3条cDNA序列进行拼接，获得了白花泡桐CCR全长cDNA序列。将获得的4CL基因片段与和专用的克隆载体pMD19-T连接，获得pMD19-T-CCR质粒。利用热激法将这一质粒导入感受态E.coli细胞JM109，成为含有pMD19-T-CCR的大肠杆菌细胞JM109/pMD19-T-CCR。白花泡桐CCR基因全长cDNA序列已在GenBanK数据库注册，注册号为EU338487，见SEQIDNo:2。CCR基因全长1243bp，CDS999(103-1101),起始密码子ATG位于103-105bp处，终止密码子TAG位于1099-1101bp处；推测共编码332个氨基酸，见SEQIDNo:l。通过GenBanKBLAST比对的结果，显示泡桐与山杨(Populustrichocarpa)CCR基因编码序列的同源性为79%。泡桐与山杨CCR酶氨基酸序列(CAC07424.11)同源性为84%。含有本发明基因的表达载体、细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。本发明的效果和益处在于该CCR是首次被提取、克隆和测序的白花泡桐〔Paulowniafortunei(Seem.)Hemsi〕CCR基因。该基因编码的CCR参与、影响植物木质素合成代谢过程，所以该基因的克隆可用于构建表达CCR的基因的表达载体及其工程菌。将该基因转入植物体并使之整合于植物的基因组，将严重影响其木质素、纤维素的合成、代谢的过程与结果，达到改良陆生植物，特别是用材林木树种木材的理化特性，扩大应用范围，提高经济价值的目的。图1为本发明泡桐CCR简并引物RT-PCR扩增片段电泳结果图片。具体实施例方式一、本发明泡桐肉桂酰CoA还原酶基因mRNA的克隆具体程序与方法程序、步骤这些步骤仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列步骤中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等《分子克隆实验指南》、《实验室手册》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例h泡桐部分CCR编码序列的克隆和测序1、简并引物的设计通过GenBanKBLAST系统分析了植物CCR蛋白氨基酸的同源性，选取其完全同源部分，优选了2对简并引物，下面列出了本发明所涉及的所有PCR引物。本发明所涉及的PCR引物如下(1)简并引物BCF5，-ayacmaagaaytggtaytgctatgg-3，BCR5'-gcmacrtcyytracatgvacatargc-3，(2)5，RACE引物Outer弓|物5，-taccgtcgttccactagtgattt-3，Inner弓|物5，-cgcggatcctccactagtgatttcactatagg-3，C.5GSP15，-gaagcagtgggccaagaaccaacac-3，C.5GSP25'-cccatgctgcttgttcagccacagc-3'(3)3，RACE引物3，RACEOuter弓|物5，-taccgtcgttccactagtgattt-3，Inner弓|物5，-cgcggatcctccactagtgatttcactatagg_3，C.3GSP15'-gttggttcttggcccactg-3C.3GSP25'-atgccaactccgtccaagc-3'(4)反义片段CR414F5，-aggatcccatatgagtgagggactacgcattggag-3，CR515R5'-gtctagagctccgtccgcacagatgaaaggtc-3'(5)检测引物(F、R引物分别设计于启动子CaMV35S、终止子Nos-Ter长870bp)4ceF5'-gaaggtggctcctacaaatgc-3'4ceR5'-caagaccggcaacaggatt-3，2、泡桐总RNA的提取取生长旺盛的幼嫩白花泡桐枝条，剥去韧皮部，用清洁刀片刮取木质部外周形成层部分的细胞，液氮研磨成粉，加入TaKaRa公司生产的总RNA提取试剂RNAisoReagent(D312)，提取RNA。3、反转录采用TAKARA公司生产的反转录酶XL(ReverseTranscriptaseXLAMV)，以OligodT为引物，以提取的总RNA为模板，进行反转录反应，合成c靈。反转录反应液组成:泡桐总RNA1ul5XRTBuffer4uldNTPMixture(各lOmM)2ulRNaseInhibitor,/u1)0.5ulOligad(T)isPrimer(2.5uM)1ulAMV(5U/ul)2ulRNaseFreedH209.5ulTotal20ul反转录液加完后轻轻混匀，离心。反转录反应程序室温放置10分钟；42'C恒温槽中保温1小时；冰水中急冷2分钟。3、PCR反应用TaKaRaLATaqHotStarVersion试剂盒进行PCR。PCR反应物组成如下(50u1):TaKaRaLATaqHS(5U/ul)0.5ul10XLAPCRBuffer5uldNTPMixture(各2.5mM)8ulBCFPrimer(100mM)1ulBCRPrimer(100mM)1ul反转录反应液2uldH2032.5ulTotal50ul反应程序为:94°C30sec55°C30sec72°C40sec30Cycles72°C5min。反应结束后，取8ul进行电泳鉴定。结果显示，扩增出0.3kb左右的片段参见图1。CCR简并引物扩增片段1、DL-2000DNAMarker2、CCR简并引物RT-PCR扩增片段，0.23kb左右将此片段回收，插入pMD19-Tvector、转化，挑单菌落鉴定、测序。扩增片段长229bp，显示了简并引物的位置，与预期相符。以此DNA片段序列推测可编码75个氨基酸，其氨基酸序列与美洲山杨、家杨的同源性均达到81%，可以确认这两个序列均为泡桐CCR基因的部分mRNA序列。实施例2:泡桐4CLmRNA5，上游未知序列的获得一个优选的方案是使用TaKaRa公司出品的5，-FULLRACEkit(CodeNo:D315)。这种技术系统第一步是磷酸化，第二步是去帽子，第三步才是加接头，从理论上讲其第一步就淘汰了所有丢失了"帽子"的、中间断裂的、残缺的、不完整的mRNA，致使所克隆的5'未知末端是完整的，所克隆的mRNA才有可能是全长的。同时采用了加特异性接头与嵌套PCR等技术，使之可以高灵敏度、高特异性地扩增cDNA的5'末端的全长序列。依据获得的简并引物RT-PCR获得泡桐CCR部分编码序列，优选了2条特异的嵌套式PCR引物C.5GSP1、C.5GSI见实施例l中l(简并引物的设计)。具体的克隆程序包括a.泡桐总RNA的提取同实施例1中2(泡桐总RNA的提取)；b.泡桐总RNA去磷酸化处理；c.去帽子反应；d.5'RACE接头的连接；e.反转录反应；f.以外测的特异性引物GSP1与5'RACEOuter引物见实施例1中1(简并引物的设计)进行PCR反应g.以内测的特异性引物GSP2与5'RACEInner引物见实施例1中1(简并引物的设计)进行PCR反应。电泳结果显示，扩增的片段长0.64kb左右。电泳回收扩增的片段，克隆于pMD20-T载体，转化，菌落PCR鉴定、测序。测序结果见SEQIDNo:5。序列中显示出Inner引物与4.5GSP2引物的位置。序列中有效序列长644bp。实施例3:泡桐4CLmRNA3，下游未知序列的获得一个优选的方案是使用TaKaRa公司出品的3，-FULLRACECoreSetVer.20(CodeNo:D314)。这种技术系统使用加有特异性序列的Oligad(T)的接头及其引物等技术，使得通过已知的部分cDNA序列，可以更灵敏、特异地扩增cDNA的3'末端序列。依据获得的简并引物RT-PCR获得泡桐4CL部分编码序列，优选了2条特异的嵌套式PCR引物见实施例1中1(简并引物的设计)。具体的克隆程序包括a.泡桐总RNA的提取同实施例1中2(泡桐总RNA的提取)；b.套式PCR反应:先以外测的特异性引物C.3GSP1与3'RACEOuter引物见实施例1中1(简并引物的设计)，进行PCR反应，再以内测的特异性引物C.3GSP2与3'RACEInnerer引物见实施例1中1(简并引物的设计)进行PCR反应。电泳结果显示，扩增的片段长0.52kb左右。电泳回收扩增的片段，克隆于pMD20-T载体，转化，菌落PCR鉴定、测序。测序结果见SEQIDNo:6。序列中显示出Inner弓|物与C.3GSP2弓l物的位置。序列中有效序列长523bp。实施例4:序列的拼接及其泡桐4CL全长mRNA的获得将前述获得的三个泡桐4CLmRNA部分序列，即以(1)5，RACE、(2)以简并引物RT-PCR、(3)3'RACE分别获得的泡桐4CLmRNA部分序列进行拼接，获得的了泡桐4CLmRNA全长序列，见SEQIDNo:2。此后，利用一个优选方案，以3，RACERT-PCR反转录反应液(产物)为模板，CCRmRNA5，顶端部分序列作引物(5'-gaaaatatcattccctcgtacccac-3')与3，RACE的Inner引物进行PCR，将获得的片段插入pMD-19Vector,经转化、挑单克隆，菌落PCR鉴定、测序，获得了携带泡桐4CLmRNA全长序列的cDNA的质粒批pMD19-P4CL。二、关于克隆的泡桐CCR基因编码序列的功能鉴定1、泡桐CCR基因RNA干扰体的构建为验证克隆的CCR基因的功能，构建了CCR基因的反义基因。反义基因的启动子为CaMV35S，终止子为N0S-Ter;反义片段长502bp，位于泡桐编码序列的414-915bp处，5'端酶切位点为Xbal，3，端酶切位点为Ndel，见SEQIDNo:7。2、克隆载体为pMD20-TVector的自体连接质粒。表达载体为pCAMBIA3301。CCR基因RNA干扰体转化转化材料，烟草(K326);转化方法采用农杆菌介导法。3、CCR基因RNA干扰体转化泡桐株系的分子鉴定DNAPCR检测引物F、R引物分别设计在启动子CaMV35S、终止子Nos-TerCceF5，-gaaggtggctcctacaaatgc-3，CceR5'-caagaccggcaacaggatt-3'扩增片段长871bp4、CCR基因RNA干扰体转化泡桐株系木质素、纤维素的变化测定材料为经鉴定确认转化泡桐CCR反义基因的K312烟草。选取这些移栽后生长正常、株高30-40厘米的烟草3株，分别剪取第3-5叶片。叶片经100°C、5分钟杀青，60'C烘干5小时。取l克左右作试样。对照为非转基因K312，其生长状况与处理同转基因烟草。纤维素(包括半纤维素)含量测定采用"造纸原料总纤维素含量测定"GB/T2677.10-1995。测定方法是在PH4-5时，用亚氯酸钠处理过抽出树脂的试样以除去所含木素，定量地测定残留物(即总纤维素)。木质素含量测定采用"造纸原料酸不溶木素含量测定"GB/T2677.8-94。用(72±0.1)%(m/m)硫酸水解经苯醇混合液抽提过的试样，然后定量的测定水解残余物(即酸不溶木素)质量。分析结果详见下表l。表1转基因烟草纤维素、木质素分析结果(样品量100mg)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>对转泡桐CCR反义基因烟草纤维素、木质素含量与比率的测定结果显示转化的泡桐CCR基因对烟草的木质素的含量降低了39.5-71.1%，平均降低了57.4%;纤维素升高7.6-24.6%，平均升高了17.9%。这些结果表明，克隆的泡桐CCR基因是有活性的，其反义基因抑制了烟草木质素的合成，降低了木质素含量与比率，导致纤维素含量与比率的提高。三.关于本发明CCR基因的应用说明1、关于相关基因的构建-由于本发明的公开，本领域的技术人员可以利用其公知的技术，构建成多种不同的基因与具有特殊功能的构建体，例如植物组织器官、发育阶段特异或者非特异表达的CCR基因。植物组织器官、发育阶段特异或者非特异表达的反义基因。植物组织器官、发育阶段特异或者非特异表达的CCR基因的RNA干扰体。当然，CCR基因可以构建的功能基因(或功能体)包括，但不限于这些。2、表达载体的构建及其应用-这些构建好的功能基因到其功能的实现，即将功能基因转入植物，到转建立已是常规技术，其程序包括四个部分(1)表达载体的构建将构建好的功能基因表达盒切出，插入植物表达载体pCAMBIA3301等质粒相应的酶切位点，构建成这些功能基因的表达载体。(2)将携带功能基因的表达载体以液氮冻融法转入根瘤农杆菌LBA4404。(3)利用农杆菌介导法将功能基因转化植物材料。(4)转化体选择与鉴定:包括抗性选择；组织化学、DNA、RNA及蛋白质水平的系统鉴定；生长特性、遗传稳定性、生物安全性及生产特性鉴定等，最终实现改良植物，建立具有目的性状或特性的新型植物。这些规程与技术已是本领域技术人员公知的，可以利用公知的技术完成、应用。序列表<110>河南省绿士达林业新技术研究所〈120>—种肉桂酰CoA还原酶基因的克隆及其应用<160〉2〈210〉1<211>332〈212>PRT〈213〉泡桐(Paulownia)<400〉1MetProSerValAlaGlyLysLeuValCysValThrGlyAlaGlyGly151015PhelieAlaSerTrpLeuValLysValLeuLeuGluLysGlyTyrThr202530ValArgGlyThrValArgAsnProGluAspProLysAsnSerHisLeu354045ArgGluLeuGluGlyAlaAspGluArgLeulieLeuCysLysAlaAsp505560LeuAsnAspTyrGluSerLeuArgGluAlalieAsnGlyCysAspGly65707580<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>260265270CysSerAspGluLysAsnProArgLysLysProTyrLysPheSerAsn275280285GinLysLeuLysAspLeuGlyLeuGluPheThrProValLysGinCys290295300LeuTyrAspThrValLysSerLeuGinGluLysGlyHisLeuProlie305310315320ProThrGinAsnGluGluProlieArglieGinSer325330<210〉2<211〉1243<212〉DNA〈213〉泡桐(Paulownia)<221〉cds<222〉(103)...(1101)〈400〉2GAAAATATCATTCCCTCGTACCCACCTTGTTCTCTCACGCACTATACATACATATATATA60CGTACACACACAGTATCAGCATCCGCAGCCACCMCTCCACCATGCCGTCGGTTGCCGGC120AAACTCGTCTGCGTCACCGGCGCCGGAGGCTTCATTGCTTCGTGGCTGGTTAMGTACTC180CTTGAAAAGGGCTACACAGTCAGAGGCACCGTCAG磁TCCAGAGGATCCGMGMTTCA240CATTTGAGAGAGCTTGMGGAGCAGATGAGAGGCTGATTCTGTGCAAGGCTGATCTTAAC300GATTATGAGAGTTTACGCGAAGCCATTMTGGCTGCGACGGTGTTTTCCACACTGCCTCG360CCTGTCACTGATGATCCAGAACAMTGGTGGAGCCGGCAGTGAATGGGGCCAMTATGTT420ATACGTGCAGCGGCAGMGCCAAGGTCCGCCGTGTGGTGTTMCCTCCTCMTTGGTGCA480ATATACATGGATCCCAACAGAGACCCTGAT磁GTTGTAGACGAGACTTGTTGGAGTGAT540CTTGMTTCTGCAAAAATAC嵐GAATTGGTATTGCTATGGAAAGGCTGTGGCTGAACM600GCAGCATGGGMGCAGCTGCGGAGTTGGGGGTGGACTTGGTGGCGATCAACCCAGTGTTG660GTTCTTGGCCCACTGCTTCAGCCAACTGTGMTGCCAGTGTTCTTCACATACTCMGTAC720TTGACTGGCTCTGCAAAGACTTATGCCAACTCCGTCCMGCCTATGTCCATGTCAAGGAT780GTGGCATTGGCACACATACTCTTGTTCGAGACACCGGCTGCGTCGGGGCGGTACCTCTGC840GCTGAGAGCGTACCCCACCGCGGCGATGTGGTGGAGATTCTTGCCAAGTTCTTCCCGGAA900TATCCCATCCCTACCAAGTGCTCAGATGAAMGMCCCAAGAAAG嵐CCTTACMGTTC960TC嵐CCMAAGCTAAAGGACTTGGGCTTGGAGTTCACACCAGTGAAGCAGTGTTTGTAT1020GATACAGTGAAAAGCCTTCAGGMAMGGCCATCTTCCAATCCCMCTCAGMTGAGGAG1080CCCATTCGTATTCAGTCTTAGCCTTTGTTGTCCATTGGGCTGCTCAACAATMAGCTTTT1140AAAATCTGGGCCCCCATCTACTATATGGGTCACCAATAGTATCAAGTTAGCMGAGAACA1200ATTCTTCTCCTTGTTCTTTTAAAAM嵐GAAAAAAAAMMA124权利要求1、一种泡桐肉桂酰CoA还原酶编码蛋白，其氨基酸残基序列如SEQID№1所示。2、一种泡桐肉桂酰CoA还原酶编码基因，其碱基序列如SEQIDNo:2所不o3、根据权利要求l所述的泡桐肉桂酰CoA还原酶的编码基因。4、含有权利要求3所述的泡桐肉桂酰CoA还原酶的编码基因的表达载体。5、含有权利要求3所述的泡桐肉桂酰CoA还原酶的编码基因的宿主菌。6、权利要求3所述的泡桐肉桂酰CoA还原酶的编码基因在泡桐及其他植物材质改良中的应用。全文摘要本发明公开了一种泡桐肉桂酰CoA还原酶基因及其应用。该泡桐肉桂酰CoA还原酶氨基酸残基序列如SEQIDNo1所示。利用这些信息可以构建成肉桂酰CoA还原酶基因、该基因的反义基因、或RNA干扰体，用于植物材质改良，可以建立起木质素含量高、或低的新种质材料。文档编号A01H1/00GK101434938SQ20081023147公开日2009年5月20日申请日期2008年12月23日优先权日2008年12月23日发明者刘双绂,刘志刚,叶金山,李荣幸,杨艳坤,王军军,陈占宽,陈昌民申请人:河南省绿士达林业新技术研究所