专利名称：云南铁皮石斛的一种组织培育方法
技术领域：
本发明涉及云南铁皮石斛的一种组织培育方法。
背景技术：
铁皮石斛是传统名贵中药材，具有2000多年的药用历史，原植物为兰科石斛属铁 皮石斛(Dendrobium officinale)。被列入《濒危野生动植物国际贸易公约》濒危植物后， 我国对采挖、收购、经营石斛进行了严格限制和管理，野生的药用石斛资源稀少、生长慢，已 逐渐成为濒临消亡的珍稀濒危物种。现有的人工种植因规模小、产量低，根本不能满足市场 需求，因此价格昂贵原料极其紧缺，出现大量的假冒铁皮石斛。由于铁皮石斛原球茎分化率 低、增殖系数低、繁殖时间长、生产成本高等问题，限制了铁皮石斛试管苗生产和发展；导致 了种植市场的铁皮石斛种苗全部为种子生产实生苗，需要不断采集野生资源的果实，使其 野生资源逐年减少濒临灭绝；而且种子生产实生苗有性繁殖还存在品种杂，变异大，产品 标准不规范，品质无法保证。为此，解决铁皮石斛原球茎分化率低、增殖系数低、繁殖时间 长、试管苗生产成本高等技术瓶颈，成为当务之急。
发明内容
本发明的目的是提供云南铁皮石斛的一种组织培育方法，该方法利用组织培养的 技术原理，选择铁皮石斛优质外植体，进行无性繁殖；攻克了铁皮石斛原球茎分化率低、增 殖系数低、繁殖时间长、试管苗生产成本高的瓶颈难题。为铁皮石斛资源可持续利用和发 展、确保中药材种植市场种苗供应，满足铁皮石斛原料需求，实现物种资源保护、再生，及可 持续利用和发展提供了有效的方法。本发明的技术方案如下一、快繁技术材料经过铁皮石斛多糖含量分析后，选择含量高优质植株外植体，建立单株无菌 体系，确保种苗品质的一致性，确保铁皮石斛优质种源。1)对外植体消毒取健状植株外植体冲洗1小时——75%乙醇擦植株——放到超净工作台上按以下 步骤操作用0. 升汞液浸泡10-15min，放入装有无菌水的瓶子摇洗6次，用消毒镊子取 出在用消毒刀片先切芽头部分，然后顺着芽头往下0. 5公分切下，切面成正圆形，将切面向 下沿瓶边插入MS培养基中，每瓶放一株外植体。盖紧瓶盖，用保鲜袋封好瓶口。2)组培①培养基配制以MS为基本培养基，根据组培目的，附加不同浓度的植物激素 (如Naphthalene acetc acid,6-benzyladenine, kinetin, Indole-3-butyric acid, Indole-3-actic acid, adenine)蔗糖 10 30g/L、琼脂粉 6. 0-8. 0g/L、PH 值=5. 6—6. 4， 生根培养基中加入活性炭lg/L。配制过程按照常规方法，培养瓶为玻璃瓶或透明塑料瓶。 灭菌采用121°C灭菌30分钟高压湿热灭菌。
②组培条件组培室温度25°C、置于光照培养箱中，在温度为25V 士2，光照时间 为12小时，光照强度为1000 2000 μ M m_2 s—1条件下培养。本发明的有益效果优选多糖含量高的优质植株为外植体进行单株组培，可确保种苗品质的一致性， 确保铁皮石斛中药材优质种源。诱导出的原球茎分化率为100%，增殖系数为6-10倍以上， 有效缩短生长周期，降低了生产成本。原球茎分化小苗和继代培养将原球茎分化小苗，转 接到壮苗、生根培养基中培养，生根达3-5厘米。逐步开盖炼苗5-7天后，大田种植的适应 性强，成活率达95%以上，解决了组培试管苗增殖系数低、繁殖时间长、生产成本高的技术 难题。用铁皮石斛种子进行有性繁殖种苗，容易出现退化变异，而且品种杂、质量不稳 定。利用多糖含量高的铁皮石斛优质植株为外植体进行单株组培，在一年内即可培育三批 组培试管苗，确保了种苗品质。此发明创造技术与现有其他技术相比，具有生长周期短、生 产成本低、品质好、可规模化生产种苗的特点。有利于铁皮石斛物种资源可持续利用和发展。
具体实施例方式实施例1 外植体培养健壮的铁皮石斛休眠芽，经酒精、升汞消毒后，接种到含有生长素、细胞分裂素和 200ml/L椰汁、3%活性炭的MS蔗糖琼脂培养基上，在光照培养室中培养2 3周后大部分都 能萌发长出新芽，在NAAO. 5mg/L+6-BA 1. 0-2. Omg/L的培养基中都有较高的萌发率和良好 的生长，2个月后，苗高达1.5cm-3. Ocm0实施例2 原球茎诱导及其培养利用已经建立了无菌体系的组培苗，把茎切成小段继续诱导分化原球茎，在 0. 2-0. 5mg/L NAA和1. 0-2. Omg/L 6-BA激素范围，添加100ml/L椰汁的MS蔗糖琼脂培养基 上，置于光照培养室中培养1个月后，从母体周围长出原球茎，分化频率为100%，增殖系数 为10倍以上。按此方法每1个月继代培养，每个芽的年增殖系数理论上为1. OXIOki以上。实施例3 侧芽分化及其继代培养将上述小苗剪成广2cm长短的带叶茎段，接种在含生长素0. 2-0. 8mg/L NAA、细胞 分裂素1. 0-2. 5mg/L BAU00ml/L椰汁的MS蔗糖琼脂培养基上，在光照培养箱中培养1个 半月后，从茎段叶腋处长出腋芽，分化频率为100%，增殖系数为2倍以上。按此方法每1个 半月继代培养，每个芽的年增殖系数理论上为1.9X104以上。 实施例4 不定根诱导及炼苗 选取生长良好的无根苗，转接到含0.5-1. 0mg/L ΙΑΑ、0. 5-1. 0mg/L NAA、活性炭0. 3%的生根培养基上，在光照培养室中培养约1个月后，小苗基部或紧靠培养基的茎上长 出3-5条的不定根，生根诱导频率为98%左右，将生根苗移栽到细树皮碎砖块基质中炼苗， 约4周后即可定植，几乎所有苗都能移栽成活，良好生长。
权利要求
云南铁皮石斛的一种组织培育方法，其特征是包括材料选择采自生长在云南的野生铁皮石斛优质成株，外植体为生长健壮的休眠芽和成熟的果实。主要试剂大量元素和微量元素以及铁盐、肌醇、甘氨酸、脯氨酸、各种维生素、植物激素。组培条件在温度为25℃±2，光照时间为12小时，光照强度为1000～2000μM m-2s-1条件下培养；
2.云南铁皮石斛的一种组织培育方法，其特征为步骤如下1. 2. 1培养基配制基础培养基组分为MS (Murashige和Skoog，1962)培养基，碳源为广3%蔗糖，支撑物 为0. 6-0. 8%琼脂，pH为5. Γ5. 6，生根培养基中加入活性炭lg/L，根据不同的培养目的加 入不同种类、不同的外源植物激素。配制过程按照常规方法，培养瓶为玻璃瓶或透明塑料瓶。灭菌采用121°C灭菌30分钟 高压湿热灭菌。1. 2. 2外植体培养取健壮铁皮石斛休眠芽，用75%的乙醇表面消毒1-3分钟，再用0. 的升汞消毒 10-15分钟，灭菌蒸馏水洗三次，每次10分钟。然后，将消毒的外植体接种萌发培养基上，置 于光照培养箱中，在温度为25°C 士2，光照时间为12小时，光照强度为90μΜ m^s"1条件下 培养。1. 2. 3侧芽分化及继代将萌发的小苗剪成广2cm长短的带叶茎段，接种在不定芽分化和继代培养基中，在温 度为25°C 士2，光照时间为14小时，光照强度为ΙΟΟμΜ πΓ、—1条件下培养。1. 2. 4原球茎诱导把无菌茎段切成小块，接种在诱导分化原球茎的培养基上，在温度为25°C 士2，光照时 间为14小时，光照强度为ΙΟΟμΜ HT2s-1条件下培养。1. 2. 5不定根诱导选取生长健壮、高度为1. 5-3. Ocm的无根苗，转接到生根培养基中，置于光照培养箱 中，在温度为25°C 士2，光照时间为10小时，光照强度为ΙΙΟμΜ、—1条件下培养。
3.云南铁皮石斛的一种组织培育方法，其特征为具体炼苗方法将获得的再生小苗在自然光照、温度条件下放置5-8天后，从生根培养基中取出再生 小苗，用自来水洗去培养基。然后，将小苗移栽至树皮和砖块(按4 1混合)基质上，并 将其转移至温室中炼苗，前3飞天根据天气、温度、基质湿度情况，制定合适的浇水方案，保 持温室的光照强度为200 μ Mm 2^T1,气温为20-28°C，相对湿度为70-100%。
全文摘要
本发明涉及云南铁皮石斛的一种组织培育方法，选择采自生长在云南的野生铁皮石斛优质成株，外植体为生长健壮的休眠芽和成熟的果实。主要试剂用大量元素和微量元素以及铁盐、肌醇、甘氨酸、脯氨酸、各种维生素、植物激素。在温度为25℃±2，光照时间为12小时，光照强度为1000～2000μM m-2s-1条件下培养。打破了常规育苗受繁殖材料、季节、场地等的限制。本发明的方法可确保种苗品质的一致性，确保铁皮石斛中药材优质种源。解决了铁皮石斛原球茎分化率低、增殖低，试管苗长势弱的瓶颈难题。具有生长周期短、生产成本低、品质好、可规模化生产种苗的特点。
文档编号A01H4/00GK101822211SQ200910094930
公开日2010年9月8日 申请日期2009年9月3日 优先权日2009年9月3日
发明者侯军, 刘杨超, 吴超, 张抱琼, 张艳, 熊云昆, 陈昌祥, 黄曦 申请人:昆明优利丰园科技开发有限公司