专利名称：防治多种细菌性病害的生防菌株4at8的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种防治多种细菌性病害的生防菌株4AT8，属于农作物防病治病领域，专用于蔬果类多种细菌性病害的无公害防治。背景技术：
细菌性病害是不同于真菌性病害的另一类植物病害，在温室蔬菜作物上发生极为普遍。而且几乎全为土传性病害，在防治上应严格实行土传病害的综合防治措施。但是，又不同于土传真菌性病害，植株一旦染病，多是整株感染，且病情发展迅速，会很快死亡。在茄科植物上通常发生的有番茄青枯病，番茄溃疡病、番茄软腐病、番茄疮痂病、辣(甜椒)青枯病、辣(甜椒)软腐病、辣(甜椒)疮痂病、茄子青枯病等；黄瓜的细菌性果斑病等是瓜果类作物上较常发现的一类病害；水稻白叶枯、水稻细菌性条斑病等也是影响粮食产量质量的重要病害。属于世界性病害之一的茄科作物青枯病，是由Wh/ ⑶ari 引起的细菌性枯萎病，该病多在结果期开始发病，发病初期白天萎蔫，夜晚恢复，2 — 3天后，不再恢复，枯萎死亡，但植株仍保持绿色；发病植株的茎基部维管束变褐，用手挤压，有乳白色粘液渗出。该病菌可危害50多科300多种植物。一般以番茄、马铃薯、芝麻、花生、大豆、辣椒等茄科蔬菜以及烟草、香蕉等经济作物受害较重。随着新寄主的发现，以及气温转暖等因素， 青枯病发生越来越普遍，并且日趋严重，每年在全球范围内造成的经济损失不少于120亿兀。番茄溃疡病也是比较常见的细菌病害之一，多为整株染病，发病初期植株下部叶片向上纵卷，凋萎下垂，部分植株出现萎蔫现象，发病后期，病叶叶缘枯黄，叶脉间变黄，全叶变褐枯萎，但不脱落；而且会导致茎部出现狭长条斑，后期病斑开裂；还会产生大量气生根，茎干髓部中空腐烂，散发出臭味，严重时植株枯死。番茄溃疡病是一种毁灭性病害，自 1985年在北京市发现后，已相继在内蒙古、山西、河北、黑龙江、吉林、辽宁等省、自治区发生为害。严重发病的地块番茄减产达25% — 75%。我国已将其列为检疫对象以防止和控制病害的发生蔓延。瓜果类的细菌性角斑病也是温室棚栽条件下发病比较严重的病害之一，该病菌为假单胞菌，在大棚和露地黄瓜的整个生育期均可发生。主要危害叶片，也危害茎蔓和果实。 叶片受害时，叶正面病斑淡褐色，背面受叶脉限制呈多角形，表面可见乳白色菌脓；果实上的病斑可向内扩展，蔓延至种子。在大棚和露地，发病都比较严重，在3(Γ50%之间，严重时可达100%。严重危害水稻的水稻白叶枯是由黄单胞菌属引起的细菌性病害。植物初期叶尖及边缘有黄绿色斑点，之后沿叶脉形成苍白色、黄褐色长条斑，最后变灰白色而枯死。发病株容易倒伏，会严重影响稻穗结实率。一般会使水稻减产20 30%，严重时可达50飞0%。。目前，对于细菌性病害，在化学防治上，长期以来，多用农用链霉素、可杀得、甲霜铜、DTM等。但是由于长期使用此类药品，多数细菌性病害已经对其产生了很强的抗药性， 再用这类药品进行防治，效果差，已经难以控制病菌危害与发展。同时，细菌性病害，多为土传病害，具有寄主范围广，抗逆性强，难以防治等特点，在生产中，缺乏有效的化学农药进行防治，而且化学农药会污染水、土壤等，破坏土壤结构，影响生态环境；直接危害非靶标的微生物，对人畜极不安全，这些因素都使得化学农药的使用得到严重的限制。因此，非化学性防治措施目前已成为防治细菌性病害的核心，而生物防治则是其中最有前途的方法。现有技术中按照本实验室的菌体保藏液方法，菌体可室温保存2 3年。
发明内容
技术问题本发明的目的是针对当前防治植物多种细菌性病害使用化学农药污染严重，使用成本过高，并且现有技术中没有对多种细菌性病害同时具有较高防效的生防制剂等问题，提供一种防治多种细菌性病害的单一生防菌菌株及制剂，该菌剂的防效在60%以上。技术方案
一种防治多种细菌性病害的生防菌株4AT8，荧光假单胞菌(作洲而膨/？浙 /Azore1S⑶/^)，2010年5月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO. 3834。地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。生防菌株4AT8用于制备生防菌剂的方法，
1)将该菌株接种到LB培养液中30°C培养ISOrpm振荡培养，12 16小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；
2)当培养至OD值在0.5 0.8之间时，将种子菌液以1:100体积比加入LB培养液中，30°C 250rpm振荡培养20 24小时。然后4000rpm离心IOmin,每IOOOml培养液获得 13 16g湿菌，每克湿菌含4X 101° IO15个菌体。取湿菌与菌体保藏液按1 g :40ml配成菌剂，成品中活菌总浓度为IXlO9 lX1012cfu/mlo其中，种子培养LB培养液配方氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L， 调节PH值为7. 0 ；菌体保藏液为0. 01mol/L磷酸盐缓冲液，还含有浓度为0. 001mol/L的 Tween20o所述生防菌剂可以用于防治茄科作物青枯病、溃疡病、瓜果类细菌性角斑病、水稻白叶枯等细菌性病害。有益效果
本发明的优点和积极效果表现在本发明是专门针对茄科植物的青枯病、番茄溃疡病、 黄瓜细菌性果斑病、水稻白叶枯等多种细菌性病害开发的生防制剂。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于蔬果类及水稻等农作物的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于相关产品的出口贸易。生防菌4AT8菌体和上清在平板拮抗试验中显示对番茄青枯病、番茄溃疡病、黄瓜细菌性条斑病、水稻白叶枯病原菌有较好的抑制作用；温室试验表明，该菌剂对番茄青枯病、番茄溃疡病、黄瓜细菌性条斑病、水稻白叶枯病均有显著的防治效果；温室大棚试验表明，该菌剂对番茄青枯病、番茄溃疡病、黄瓜细菌性条斑病、水稻白叶枯病具有较好的防效， 防效在60 75%。该菌剂用湿菌与本实验室的菌体保藏液按1 :40(g/ml)配成菌剂，可室温保存2 3年。该菌剂除了可以再移栽时灌根使用外，还可以在移栽前与有机肥混合制成堆肥，然后随肥料在整地过程中埋到土壤中使用。四
图1生防荧光假单胞菌4AT8菌体和发酵上清对青枯病病原菌的拮抗结果； 图2生防荧光假单胞菌4AT8菌体和发酵上清对番茄溃疡病病原菌的拮抗结果； 图3生防荧光假单胞菌4AT8菌体和发酵上清对水稻白叶枯病原菌的拮抗结果。五
具体实施例方式
一种防治多种细菌性病害的生防菌株4AT8，荧光假单胞菌(作洲而膨/？浙 fluorescens),从河北小麦根围土中分离得到。生防菌株4AT8用于制备生防菌剂的方法，
1)将该菌株接种到LB培养液中30°C培养ISOrpm振荡培养，12 16小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；
2)当培养至OD值在0.5 0. 8之间时，将种子菌液以1 :100体积比加入LB培养液中， 300C 250rpm振荡培养20 M小时，。然后4000rpm离心lOmin，每IOOOml培养液获得 13 16g湿菌，每克湿菌含4X 101° IO15个菌体。取湿菌与菌体保藏液按1 g :40ml配成菌剂，成品中活菌总浓度为IXlO9 IX 1012CfU/ml。其中，种子培养LB培养液配方氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为7. 0 ；菌体保藏液为0. Olmol/L磷酸盐缓冲液，还含有浓度为0. 001mol/L的Tween20。上述生防菌剂用于防治茄科作物青枯病、溃疡病、瓜果类细菌性角斑病、水稻白叶枯等细菌性病害。实施方法(1)荧光假单胞菌4AT8菌体和上清平板拮抗试验
选择供试病原菌番茄青枯菌 ZJ3721 (Malstonia solanacearum, JG Li et al.，2010， Popff of Ralstonia solanacearum, a new two-domain harpin targeting the plant cell wall)、番茄溃疡ACCC 01233 iClavibacter組义力/识/？日/？從，购买于中国农业微生物菌种保藏中心)、白叶枯ACCC 03530 {Xanthomonas orj^ae，购买于中国农业微生物菌种保藏中心)。将病原菌番茄溃疡菌、白叶枯在NA培养液(牛肉浸膏3g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉 lg/L，蔗糖10g/L，pH=7. 0)，将病原菌番茄青枯菌在YGPA (葡萄糖10g/L，酵母浸粉5g/L， 蛋白胨5g/L,，pH=7. 0)中培养16-24 h至CFU为108/ml)，加入熔化冷却至40°C左右的相应固体培养基中，体积比1:200，再1:200加入10%TTC (氯化三苯四氮唑)染料。将培养基每20mL倒入9 cm直径的平板中。待冷却凝固后，牙签接种生防菌4AT8或打孔加入4AT8 生防菌发酵上清lOOul。24 h后记录抑菌圈环径。(2)温室试验中，培养基质中播种番茄，黄瓜，待番茄、黄瓜长至4叶期，选长势一致的植株移栽到塑料杯中进行试验。将4AT8菌剂稀释浓度至lxl08CFU/ml后灌根使用，7 天后，将病原菌稀释浓度为lxl07CFU/ml灌根使用，其中黄瓜细菌性角斑病使用发病田块的土壤。(3)温室大棚试验
田间试验共设三个处理A、生防菌剂4AT8 ；B、化学药剂(70%农用链霉素SP1000倍液和25%叶枯宁400倍液);C、空白对照。每个小区16m2，小区间设三行隔离区，各处理按完全随机区组排列，重复4次，全试验共12个小区。试验前按试验方案分好小区，开好隔离沟，每亩使用量为1000毫升109CFU/ml的生防菌剂4AT8。分别统计各种病害的病害严重度，并且计算防效。试验结果
(1)生防菌4AT8拮抗病原菌试验结果生防荧光假单胞菌4AT8菌体和发酵上清对青枯病(图1)、溃疡病(图2)以及水稻白叶枯(图3)显示较好的平板抑制效果。(2)温室试验表明，生防菌4AT8在温室内对青枯病(表1 )、溃疡病(表2)以及黄瓜细菌性角斑病(表3)的防效在80%以上，对病原菌起到了很好的控制作用。(3)田间试验表明，生防菌4AT8对生防菌4AT8在温室内对青枯病(表4)、溃疡病 (表5)、黄瓜细菌性角斑病(表6)以及水稻白叶枯(表7)都有较好的抗病效果。表1 生防菌剂4AT8对番茄青枯病的温室防治效果
权利要求
1.一种防治多种生防细菌性病害的生防菌株4AT8，是荧光假单胞菌(作洲而膨/？浙 /Azore1S⑶/^)，2010年5月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO. 3834。
2.用权利要求1所述生防菌株4AT8制备的生防菌剂。
3.权利要求2所述生防菌剂在防治茄科作物青枯病、溃疡病、瓜果类细菌性角斑病、水稻白叶枯等细菌性病害中的应用。
4.权利要求2所述生防菌剂的制备方法，包括1)将权利要求1所述生防菌株4AT8接种到LB培养液中30°C培养ISOrpm振荡培养， 12 16小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；2)当培养至OD值在0.5 0. 8之间时，将种子菌液以1 :100体积比加入LB培养液中， 300C 250rpm振荡培养20 M小时，然后4000rpm离心lOmin，每IOOOml培养液获得13 16g湿菌，每克湿菌含4X 101° IO15个菌体，取湿菌与菌体保藏液按1 g :40ml配成菌剂， 成品中活菌总浓度为IXlO9 lX1012cfu/mlo
5.根据权利要求4所述的的方法，其中，种子培养LB培养液配方氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为 7.0 ；菌体保藏液为0. 01mol/L磷酸盐缓冲液，还含有浓度为0. 001mol/L的Tween20。
6.根据权利要求4所述的方法，其主要特征在于，所用LB培养液配置方法为氯化钠 10g/L,胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为7.0。
全文摘要
本发明涉及一种防治多种细菌性病害的生防菌株4AT8，属于植物保护技术领域。该菌是荧光假单胞菌，将该菌接种于本实验室研发的培养液中，30℃250rpm发酵20～24小时，然后6000rpm离心10min，取湿菌与菌体保藏液按140(g/ml)配成菌剂，成品中活菌总浓度为1×109～1×1012cfu/ml。对茄科作物青枯病、溃疡病、瓜果类细菌性角斑病、水稻白叶枯等细菌性病害的田间防效在60-75%，同时该菌剂还有改善土壤微环境等作用。
文档编号A01N63/02GK102154157SQ20101060866
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月28日 优先权日2010年12月28日
发明者严芳, 杨明明, 郭坚华, 陈云 申请人:南京农业大学