酿酒酵母在水果采后病害防治的应用及使用方法
【专利摘要】本发明涉及酿酒酵母在水果采后病害防治的应用及使用方法，属于生物防治【技术领域】。本发明的酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，保藏菌株编号为CGMCC?No.7129。利用其进行水果采后病害防治及贮藏保鲜方法，其特征在于按照下述步骤进行：将酿酒酵母活化、发酵培养，离心得到菌体；将菌体用无菌水稀释制备成菌悬液；将水果放入菌悬液中，浸泡30秒的时间后马上取出，再风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温或冷藏条件下存放。可以明显的抑制葡萄、草莓等产生腐烂腐败的病原菌，防止水果采后发生腐烂，并且具有不产生毒素、可以和化学杀菌剂共同使用等优点。
【专利说明】酿酒酵母在水果采后病害防治的应用及使用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物防治【技术领域】,涉及一种酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)以及该菌种对水果采后病害防治的应用。
【背景技术】
[0002]水果在采摘、运销、储藏过程中因腐烂造成的损失是巨大的，也是全球关注的问题。据报道，在发达国家有10% - 30%的新鲜产品由于采后病害导致腐烂，而在缺乏贮运冷藏设备的发展中国家，果实采后腐烂率则高达40% — 50%。国外水果贮藏保鲜量占水果总产量60%以上，目前我国果品贮藏量800多万吨，不到总量的15%，其中冷藏库和气调库的贮藏量为70万吨，仅占总产量的7%。我国水果采后腐烂率一般在20% - 30%,高者甚至达到50%。水果腐烂主要归因于病原微生物的致病作用，这些病原微生物主要有灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、葡枝根霉(Rhizopus stoloniger)、青霉属(Penicillium spp.)、毛霉属(Mucorspp.)、链格抱(Alternaria spp.)、曲霉(Aspergillus spp.)和软腐细菌(Erwinia sp.)
坐寸ο
[0003]目前最常用的控制水果采后腐烂的方法是低温和化学杀菌剂处理。近年来虽然冷藏技术在我国得到了广泛的发展和应用，但是在低温条件下仍有相当数量的致病菌可以生长从而引起腐烂。例如，能引起多种水果灰霉病的灰葡萄孢(Botrytis cinerea),也称灰霉菌，在-0.5°C时还能生长繁殖，引起许多水果腐烂变质，造成严重经济损失。而那些对低温敏感的水果，因只能在不低于使产品受冷害的温度下贮藏，病原物的生长、繁殖不能得到有效地抑制，腐烂相当严重。化学杀菌剂的使用，虽然防治病害可以起到立竿见影的效果，但是在杀死病原菌的同时也杀死了有益微生物，且水果上的化学杀菌剂残留对人体健康造成影响、对环境造成污染。美国 科学院(National Academy of ScincesMtJ—份报告显不，在用于处理食品的杀菌剂中，60%有致癌的危险性。目前多种杀菌剂(如CaptaruBenomyl等)已被美国环保局明令禁止使用或者在部分水果产品上限制使用。为了保证农产品的卫生和安全，各国科学家都在积极的探索能代替化学杀菌剂的水果采后病害防治新技术。近年来，美国、意大利等发达国家对水果采后病害生物防治的研究已经取得了阶段性的成果，生物防治的应用潜力巨大，使得它成为一种取代化学杀菌剂的有效方法。
[0004]我国水果采后病害生物防治研究起步较晚。范青等(2001)对果实病害生物防治拮抗菌进行了筛选和分离，结果表明:季也蒙假丝酵母(Candida guiliermondii)、朽1樣形克勒克酵母(Kloeckera apiculata)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)对甜樱桃褐腐病都表现出显著的抑制效果，季也蒙假丝酵母和柠檬形克勒克酵母能有效地防治核果类果实软腐病；田世平等(2004)研究，在甜樱桃采前喷洒I X 108CFU/mL的丝孢酵母(Trichosporon pullulans),罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)和粘红酵母(Rhodotorula glutinis),分别在25°C,0°C以及气调忙藏下，丝孢酵母在果实上繁殖数量最高，抑菌效果最好；张红印等(2005)研究了不同温度下，罗伦隐球酵母对灰霉病的防治效果，结果表明，25°C下，梨灰霉病的发病率为16.7%，结合CaCl2使用效果更显著。[0005]从国内外文献中可知当前以有效微生物取代化学杀菌剂用于水果采后病害的防治已显示出巨大的应用前景，水果采后病害的生物防治成为一个新的研究热点。但到目前为止，已实际应用于生产的拮抗菌种类不多，只有Biosave和Aspire等少数几种产品上市，而我国目前尚没有拮抗菌应用于实际生产。主要原因在于商业生产条件下，目前已报道的拮抗微生物的防治效果往往不如化学杀菌剂的效果，从而达不到保鲜要求。这些因素影响了拮抗菌作为果蔬保鲜剂在生产中的使用。为了尽快地将拮抗微生物应用于水果贮藏保鲜实际生产上，还需进一步筛选拮抗效果好、抗病谱广的微生物，同时需要深入探讨拮抗微生物防治水果采后病害的机理，在此基础上进一步提高拮抗微生物的抑菌能力，开展拮抗微生物扩大培养、保存和商品化应用技术的研究。
【发明内容】
[0006]本发明为了克服上述现有技术中的不足，发明人在前期广泛研究的基础上，提供了一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株,具有较强生物防治效力。
[0007]本菌株系从镇江市世业洲农业生态果园筛选分离到一株对葡萄采后病害具有显著防治作用的拮抗酵母912菌株，经系统分类鉴定，鉴定为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
[0008]本发明的酿酒酵母912菌株已经于2013年I月11日该菌株于送交位于中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏菌株编号为CGMCC N0.7129。
[0009]本发明同时提供了一种利用酿酒酵母进行水果采后病害防治及贮藏保鲜方法；步骤如下:将酿酒酵母912活化、发酵培养，离心得到菌体；将菌体用无菌水稀释制备成1.0X106个/ml-1.0X IO9个/ml的菌悬液；将水果放入菌悬液中，浸泡30秒的时间后马上取出，再风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温或冷藏条件下存放。
[0010]本发明还提供该酿酒酵母菌株的用途，可以用其对水果的进行采后病害防治及贮藏保鲜；尤其适合于葡萄、草莓等水果`的采后病害防治及贮藏保鲜。
[0011]本发明的酿酒酵母912菌株采用常规的菌种斜面保藏方法，采用培养基首选为NYDA培养基(牛肉膏0.8%，酵母浸出物0.5%，葡萄糖1%，琼脂2%)，也可以使用马铃薯琼脂培养基(马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15 — 20克，自来水1000毫升)。在pH7.0-9.0，26°C -28°C，培养36h。在发酵培养时，可将斜面菌种直接接种至发酵培养基NYDB或者麦芽汁培养基中(将大麦芽粉碎称重，加入4倍重量的水，在65°C的水浴锅中保温糖化3-4h，糖化时每隔5分钟用玻璃棒搅拌一次，直至糖化完全(检查方法:取0.5ml的糖化液，加2滴碘液，如无兰色出现，即表示糖化完全)。糖化液用4-6层纱布过滤，滤液中加入1%重量的鸡蛋清，将滤液置于高压灭菌锅里，升温至115°C下并保持5min，使糖化液中的蛋白质沉淀下来，再用4-6层纱布过滤，除去沉淀，用手持糖度计(WYT-4型，泉州中友光学仪器有限公司)检测糖化液残糖浓度，加水稀释将糖化液浓度调整至12°Brix，自然ρΗΟ,ρΗ?.0-9.0，温度260C -28°C，摇床转速180r/min的培养条件下，培养24_30h。一般在24h左右可以达到最大生物量。
[0012]本发明的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)912,可以明显的抑制葡萄、草莓等产生腐烂腐败的病原菌，防止水果采后发生腐烂，并且具有不产生毒素、可以和化学杀菌剂共同使用等优点，可以广泛地用于水果采后病害的生物防治过程中，减少采后病害造成的损失。
[0013]通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为本发明酿酒酵母912ITS区序列进化关系图。
【具体实施方式】
[0015]本发明菌株通过以下方法得到，从镇江市世业洲农业生态园生产的桑葚中分离得至|J。通过分离、筛选、培养、离体试验和活体试验，得到具有较强生防效力的微生物菌株912。经过形态学培养、生理生化特征试验和小亚基5.8S rDNA和内转录间隔区ITSl和ITS2区喊基序列分析，鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0016]本发明的菌株酿酒酵母912菌株(菌株编号=CGMCC N0.7129)具有以下微生物学特性:
[0017]1.形态学特征
[0018](I)在YEro固体培养基平板(酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL,琼脂20g，pH6.0，115°C湿热灭菌20min)上28°C培养48h，菌落呈卵圆形、边缘整齐、乳白色、表面光滑、质地均匀、易挑起。
[0019](2)在麦芽汁液体培养基中培养24h后，不形成醭，菌液浑浊，有沉淀，镜检酵母细胞呈椭圆形，细胞大小(3.5-5.3) X (2.7-4.5) μ m,芽殖，单边出芽。
[0020]2.生理特性`
[0021]本发明菌株碳源能够同化葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖纤维、木糖，不能同化淀粉。氮源能够同化硝酸盐，37°C可以生长。其生理特性结果见下表1。
[0022]3.分子遗传学鉴定
[0023]对筛选菌株酿酒酵母912小亚基5.8S rDNA-1TS区序列分析，在GenBank上检索，确定912为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。根据检索到的同源菌株，应用DNAStar软件的Mege5.1程序,构建生物进化关系树如图1。
[0024]表1酿酒酵母的生理生化特征
[0025]
菌号葡萄糖半乳糖麦芽糖蔗糖纤维二糖木糖淀粉硝酸钾产酸 37 °C
酿酒醉母 912++++++ ———+
[0026]本发明的酿酒酵母912，采用常规的菌种斜面保藏方法，采用培养基首选为NYDA培养基(牛肉膏0.8%，酵母浸出物0.5%，葡萄糖1%，琼脂2%)，也可以使用马铃薯琼脂培养基。在pH7.0~9.0，26°C~28°C，培养24h。在发酵培养时，可将斜面菌种直接接种至发酵培养基NYDB或者麦芽汁培养基中，pH7.0~9.0，温度26°C~28°C，摇床转速180r/min的培养条件下，培养24~30h。一般在24h左右可以达到最大生物量。
[0027]实施例1:利用酿酒酵母进行草莓的采后病害防治及贮藏保鲜方法
[0028]将活化后酵母接种在装有50mlNYDB(酵母膏5g，牛肉浸膏Sg，葡萄糖10g，纯化水 1000ml，pH7.0-9.0)的三角瓶中，28 °C、180r/min 摇床培养 24h。取菌液 7000r/min离心IOmin,弃上清，无菌水反复清洗3次，血球计数板计数配成浓度为IX IO6个/ml,I X IO7个/ml，I X IO8个/ml，I X IO9个/ml的菌悬液。在果实腰部用打孔器打3个直径为3m(宽)X3mm(深)的孔,每孔注30 μ I的拮抗菌细胞悬液,对照水果注入30 μ I无菌水。2h后分别接种病原菌匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子悬液30 μ I。晾干后将果实装入塑料筐内，保鲜膜封口保持95%的湿度，在室温下贮藏，3d后统计果实的发病腐烂率。每个处理36个果实，试验重复3次。
[0029]按照上述步骤试验，3d后统计草莓的腐烂率结果见下表2。
[0030]表2酿酒酵母912对草莓葡枝根霉的抑制效果
[0031]
【权利要求】
1.酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,保藏菌株编号为 CGMCC N0.7129。
2.权利要求1所述的酿酒酵母进行水果采后病害防治及贮藏保鲜方法，其特征在于按照下述步骤进行:将酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae活化、发酵培养,离心得到菌体；将菌体用无菌水稀释制备成1.0X IO6个/ml - 1.0X IO9个/ml的菌悬液；将水果放入菌悬液中，浸泡30秒的时间后马上取出，再风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温或冷藏条件下存放。
3.根据权利要求2所述的酿酒酵母进行水果采后病害防治及贮藏保鲜方法，其特征在于其中所述的水果为葡萄或草莓。
4.根据权利要求2所述的酿酒酵母进行水果采后病害防治及贮藏保鲜方法，其特征在于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株采用常规的菌种斜面保藏方法,采用培养基NYDA培养基(牛肉膏0.8%，酵母浸出物0.5%，葡萄糖1%，琼脂2%)，或马铃薯琼脂培养基(马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15 — 20克，自来水1000毫升)；在pH 7.0-9.0,26°C_28°C，培养36 h ;在发酵培养时，可将斜面菌种直接接种至发酵培养基NYDB或者麦芽汁培养基中，pH 7.0-9.0，温度26°C -28°C，摇床转速180 r/min的培养条件下，培养24-30h。
5.根据权利要求4所述的酿酒酵母进行水果采后病害防治及贮藏保鲜方法，其特征在于所述的麦芽汁培养基按照下述步骤制备得到:大麦芽粉碎称重，加入4倍重量的水，在65°C的水浴锅中保温糖化3-4h，糖化时每隔5分钟用玻璃棒搅拌一次，直至糖化完全，糖化液用4-6层纱布过滤，滤液中加入1%重量的鸡蛋清，将滤液置于高压灭菌锅里，升温至115°C下并保持5min，使糖化液中的蛋白质沉淀下来，再用4_6层纱布过滤，除去沉淀，用手持糖度计检测糖化液残糖浓度，加水稀释将糖化液浓度调整至120Brix，自然pH。
6.根据权利要求4所述的酿酒酵母进行水果采后病害防治及贮藏保鲜方法，其特征在于所述的采用培养基NYDA培养基以质量百分比计组成如下:牛肉膏0.8%，酵母浸出物0.5%，葡萄糖1%，琼脂2%;马铃薯琼脂培养基组成如下:马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15 — 20克，自来水1000毫升。
【文档编号】C12R1/865GK103820343SQ201310648466
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】张红印, 李强, 张晓云, 杨其亚 申请人:江苏大学