专利名称：一种葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2及其在提高植物抗寒能力上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2及其应用。
背景技术：
低温是植物生长过程中遇到的主要环境胁迫因子之一，每年因低温寒害造成的各种农作物损失高达数千亿美元。葡萄是重要的经济型作物之一，它属于低温敏感型多年生落叶果树，我国北方种植的葡萄每年因低温寒害和倒春寒造成了巨大的经济损失。植物对低温的应激是一个复杂的过程，包括低温信号的感知、信号转导和转录调控等阶段。植物体可以通过质膜流动性的改变、质膜上的钙离子通透性通道、受体激酶和磷酸酯酶等感知低温。钙信使介导的信号途径是低温应答过程中重要的信号途径。在此途径中，因低温增加的胞质钙离子能被钙离子依赖的蛋白激酶(calcium ion-dependent protein kinase, CDPK)、磷酸酶和有丝分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK) 识别并传导，最终启动C重复结合转录因子(C-i^peat binding transcription factors, CBF)等抗寒基因的表达，提高植物的抗低温能力(Chinnusamy et al.，2006 Jan et al.， 2009)。当植物经过一段时间的零上低温处理后，体内发生一系列适应低温的形态和生理生化变化，使其抗寒能力得到增强，此过程被称为低温驯化。Guy等研究发现低温驯化能诱导和增加一些基因的表达，使多种基因表达发生改变，这些基因表达的产物可分为两类，一是调控蛋白，调控寒冷信号传导、抗寒基因表达和抗寒蛋白活性；二是功能蛋白，与植物抗寒性的提高直接相关。研究报道表明，在低温驯化过程中，植物体内经常伴随着Ca2+水平的迅速升高(张国增等，2009)，逆境激素水平的变化(曲凌慧等，2009 ；王三根，2000)，活性氧的积累和保护酶系统活性的提高。目前植物响应低温胁迫及低温驯化的信号转导机制的研究还刚起步，现已证明，1，4，5_三磷酸肌醇(1,4,5-trisphosphate, IP3)在低温信号转导途径中也起重要作用。磷酸肌醇代谢途径中编码肌醇多磷酸-1-磷酸酶的基因FRY 1如果发生缺失突变，则引起植物体内IP3的积累，激活下游信号系统，诱导冷调节基因的表达(Chinnusamy and Zhu，2002)。多磷酸肌醇激酶基因/三磷酸肌醇3激酶基因(inositol polyphosphate kinase/inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase，IPK2/IP3K)磷酸化 IP3 成为 1，3，4， 5-四磷酸肌醇(inositol 1，3，4，5-tetrakisphosphate，IP4)和 1，3，4，5，6-五磷酸肌醇 (1,3,4, 5，6-pentaki sphosphate，IP5)，IP4能够与IP3协同作用调节胞外钙离子入膜和维持细胞内钙离子平衡(Xia et al.，2005)。因此，IPK2在通过协调IP3和IP4水平维持钙离子稳态过程中起关键作用，并参与了多种生理过程的调控。如，^iang等O007)研究发现 AtIPK2参与生长素介导的拟南芥分枝过程。最近有研究报道，IPK2与植物对盐胁迫等非生物逆境的应答有关，在盐胁迫下转盐芥ThIPK2植株的各种胁迫响应标记基因转录水平均上升(Yang et al.，2008)，证明ThIPK2具有提高植物抗干旱和耐低温胁迫的能力(Zhu et al.，2009)。但目前尚未见到VvIPK2是否参与葡萄应答低温胁迫的报道。过氧化氢(hydrogen peroxi de，H2O2)是生物细胞代谢过程中产生的一种活性氧， 又可作为一种重要的第二信使参与对生物和非生物胁迫的响应及细胞程序性死亡等过程 (刘国华等，2009 ;Neill et al. ,2002 ；Laloi et al. ,2004 ；Cheng and Song, 2006) 近期，Yim等Q010)的研究表明H2O2参与水稻应答低温胁迫信号过程。在植物应答低温胁迫信号转导途径中，H2A和VvIPK2两者之间的具体关系以及他们在该途径中的作用机制还知之甚少，因此，致力于研究VvIPK2是否参与葡萄应答低温胁迫、H2A和VvIPK2两者之间的具体关系以及他们在该途径中的作用机制对于提高植物的抗寒能力有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2，及其在提高植物抗寒能力上的应用。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现一种葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2，其具有序列表SEQ ID NO=I的碱基序列。一种葡萄多磷酸肌醇激酶，其具有序列表SEQ ID NO 1编码的SEQ ID NO 2的氨基酸序列。重组载体，其含有所述的葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2。所述重组载体为pMD18-T-VvIH(2 质粒或 pCAMBIA2301_VvIPK2 质粒。在克隆所述基因VvIPK2的特异性引物为VvIPK2-CDS-sense :5' -ATGCTTAAGGTCCCGGATCATC-3‘VvIPK2-CDS-antisense 5' -GCGTTATTCAGTGGTACCATTCTCC-3‘，本发明还提供了一种葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2在提高植物抗寒能力上的应用。用所述pCAMBIA2301-VvIPK2质粒载体转化植物，以产生转基因植物。所述转基因植物为转基因拟南芥。由于采用本发明的技术方案，本发明以酿酒葡萄砧木品种‘F-242’试管苗为材料， 克隆了其多磷酸肌醇激酶(inositol polyphosphate kinase, IPK2)基因VvIPK2。试验证明在低温胁迫下，葡萄叶片VvIPK2表达量明显升高，初步表明其参与了葡萄抗冷过程，并且成功将基因WIPK2转入拟南芥，为利用转基因技术提高葡萄抗性提供理论和实验依据。 本发明并通过试验分析了 VvIPK2在低温条件下的表达模式，测定了低温胁迫下葡萄叶片内源H2A含量的变化，并借助于药理学试验证明H2A位于VvIPK2上游发挥作用。本发明对于今后借助分子生物学、生物信息学及蛋白质组学研究两种信号元件对冷调节基因表达的影响、转录谱的变化及蛋白水平的变化，对于深入探究植物响应低温胁迫信号转导机制具有重要指导意义。
图1表明本发明中VvIPK2基因的PCR扩增(A)及酶切鉴定⑶图谱，M :DL2000 DNA Maker ；N 阴性对照；S 试验样品。
图2表明本发明中VvIPK2基因与其他物种IPK2基因的序列同源性分析㈧ 图和进化树(B)图，其中黑色表示完全相同的氨基酸残基，灰色程度越浅氨基酸残基保守性越低，拟南芥(Arabidopsis thaliana, GenBank accession No. AY147936)； 盐芥(Thellungiella salsugine, GenBank accession No. EFl10977)；亚麻(Linum usitatissimum, EMBL accessionNo. AJ310150) ；/K禾S (Oryza sativa, DDBJ accessionNo. AP005749) ； I和II分别指示高度保守的IP3结合结构域和ATP/Mg2+结合结构域。图3表明本发明低温对‘F-242，叶片中VvIPK2相对表达量的影响。图4表明本发明中LY-294002对‘F-242，叶片S OD活性(A)以及Cu/Zn SOD(B) 基因表达、VvIH(2(C)基因表达的影响。图5表明本发明中LY-294002对低温条件下‘F_M2’叶片MDA含量(A)和细胞膜相对透性(B)的影响。图6表明本发明中低温胁迫对‘F142’叶片H2A含量的影响。图7表明本发明中低温下H2A对‘F-M2’叶片SOD活性(A)及Cu/Zn SOD基因表达量(C)的影响；及AsA对‘F142’叶片SOD活性⑶及Cu/Zn SOD基因表达量⑶的影响。图8表明本发明中低温下H2A (A)和AsA(B)对‘F_M2’叶片中MDA含量变化的影响。图9表明本发明中低温下H2A (A)和AsA(B)对‘F_M2’叶片中细胞膜相对透性的影响。图10表明本发明中低温下NADPH氧化酶活性的变化。图11表明本发明中低温下H2A和AsA对‘F-242，叶片VvIPK2相对表达量的影响。图12表明本发明中低温下LY-294002对‘F-M2，叶片H2A含量的影响。图13是本发明中转化根癌农杆菌阳性克隆酶切鉴定结果。
具体实施例方式通过参考附图和下述实施例，将有助于本发明更详细的说明。下述实施例中所使用的方法均为本领域常规操作。本发明所用的材料为葡萄砧木品种‘F-M2’试管苗，它由青岛农业大学生命科学学院植物逆境生理与分子生物学实验室培养并保存。将‘F-M2’试管苗置于25士 1°C培养室中；12h光照/12h黑暗；光照强度200 μ mol ·πΓ2 · s—1下培养。每3_4周将试管苗继代到新鲜的生根培养基(MS+0. 05mg · Γ1 NAA)上继代繁殖培养，备用。实施例1、测定低温对‘F-M2’叶片中VvIPK2相对表达量的影响1、克隆 VvIPK2 基因采用同源克隆的方法，以拟南芥多磷酸肌醇激酶基因AtIPK2i3 (AT5G61760)CDS 进行WU-BLAST序列比对，检索到葡萄中多磷酸肌醇激酶基因同源序列，DNAstar软件包分析其开放阅读框(open reading frame，0RF)，并以之为模板设计特异性引物VvIPK2-CDS-sense :5' -ATGCTTAAGGTCCCGGATCATC-3 ‘(如 SEQ ID No :3 所示)；VvIPK2-CDS-antisense 5' -GCGTTATTCAGTGGTACCATTCTCC-3‘，(如 SEQ ID No 4所示)由上海生工生物工程有限公司合成。 用CTAB法提取葡萄总RNA，大连宝生物公司RNA LA PCR Kit(AMV)Ver. 1. 1试剂盒反转录PCR。根据试剂盒要求，第一步反转录PCR反应的条件是3(TC，10min，42°C， 30min,99°C,5min,5°C,5mino第一步反应产物作为第二步反应的模板。第二步PCR条件为 940C 5min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin，30 个循环；72°C延伸 10min，4°C保存。用北京博
迈德试剂盒回收目的片段，用琼脂糖凝胶电泳检测其大小。第一步反转录PCR反应体系如下
权利要求
1.一种葡萄多磷酸肌醇激酶基因VVIPK2，其具有序列表SEQ ID NO :1的碱基序列。
2.一种葡萄多磷酸肌醇激酶，其具有序列表SEQ ID NO :1编码的SEQ ID NO :2的氨基酸序列。
3.重组载体，其含有权利要求1所述的葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为pMD18-T-VvIPK2质粒或 pCAMBIA2301-VvIPK2 质粒。
5.根据权利要求1所述的一种葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2，其特征在于克隆所述基因VvIPK2的特异性引物为VvIPK2-CDS-sense 5' -ATGCTTAAGGTCCCGGATCATC-3‘VvIPK2-CDS-antisense 5' -GCGTTATTCAGTGGTACCATTCTCC-3‘，
6.一种根据权利要求1、3、4或5所述的葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2在提高植物抗寒能力上的应用。
7.根据权利要求6所述的一种葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2在提高植物抗寒能力上的应用，其特征在于用所述pCAMBIA2301-VvIPK2质粒载体转化植物，以产生转基因植物。
8.根据权利要求7所述的一种葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2在提高植物抗寒能力上的应用，其特征在于所述转基因植物为转基因拟南芥。
全文摘要
本发明提供了一种葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2，它具有序列表SEQ ID NO1的序列，还提供了具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的葡萄多磷酸肌醇激酶。本发明克隆了酿酒葡萄砧木品种‘F-242’试管苗的多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2，本发明通过试验证明葡萄叶片VvIPK2参与了葡萄抗冷过程，并将基因VvIPK2转入拟南芥中，为利用转基因技术提高葡萄抗性提供理论依据。本发明证明H2O2位于VvIPK2上游发挥作用。本发明对于今后借助分子生物学、生物信息学及蛋白质组学研究两种信号元件对冷调节基因表达的影响、转录谱的变化及蛋白水平的变化，对于深入探究植物响应低温胁迫信号转导机制具有重要指导意义。
文档编号A01H5/00GK102161997SQ201110046648
公开日2011年8月24日 申请日期2011年2月18日 优先权日2011年2月18日
发明者侯丽霞, 刘新, 李希东, 赵方贵, 车永梅 申请人:青岛农业大学