专利名称：一种双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法
技术领域：
本发明属于食用菌培植技术领域，具体涉及一种双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法。
背景技术：
双孢蘑菇(Agaricus bisporus)是一种广泛栽培的食用菌，在现有的技术中，双孢蘑菇的生产一般采用固体菌种，但固体菌种具有明显的缺陷，主要表现在生长周期长、菌龄不一致、发菌速度慢、栽培种需用量大、生产成本高等方面，显然不能满足大规模的双孢蘑菇栽培需求。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法，以满足高效培育双孢蘑菇的使用需求。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下一种双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法，包括以下步骤(1)取活化的0. 5cm2斜面母种接种到装有60 120mL液体培养基的250mL培养瓶中，控温21 27°C，90 180rpm振荡培养5 7d得一级摇瓶菌种，按接种量为5 10%转接一级种子到二级培养液进行培养，再将培养好的二级摇瓶液体菌种转接到三级液体培养液进行培养，相同方法依次进行各级培养得种子液；其中，各级摇瓶培养条件相同，液体培养基配方为碳源，氮源 10 20g，KH2PO4 1 3g，MgSO4 0. 5 1. Sg5VB1 IOmg,/K IOOOmL, PH5 7 ；碳源为20 30g的麸皮、玉米粉、葡萄糖、果糖、甘露糖或蔗糖，或20 30mL麦芽汁；氮源为蛋白胨、酵母粉、玉米粉、硫酸铵或硝酸钾；(2)将步骤(1)所得的种子液按5%的接种量接种至装有6L发酵培养基的IOL 发酵罐进行发酵培养，25°C培养5 6d，即可；其中，发酵培养基配方为麦麸30g，玉米粉 10g，蛋白胨 lg，磷酸二氢钾 0. 5g、硫酸镁 IgJB1 10mg/L，水 IOOOmL, ρΗ6· 5。步骤(1)中，碳氮比(g/g或mL/g)优选为3 1或2. 5 1. 5 ；步骤(1)中，碳源优选为麸皮、玉米粉或麦芽汁；一级培养最优选使用麦芽汁，二级培养最优选使用玉米粉。步骤(1)中，氮源优选为蛋白胨、酵母粉或玉米粉，最优选为玉米粉。步骤(1)中，一级培养时，液体培养基的优选配方为麦芽汁30mL，玉米粉10g， KH2PO4 lg, MgSO4 0. 5g, VB1 10mg,7jC IOOOmL, pH6. 5。步骤(1)中，二级培养时，液体培养基的优选配方为玉米粉10g，蛋白胨20g， KH2PO4 lg, MgSO4 0. 5g, VB1 10mg,7jC IOOOmL, pH6. 5。步骤(1)中，培养条件优选为装液量为90mL，控温25°C，150rpm振荡培养5 6d，
接种量为5%。有益效果与现有的固体培养双孢蘑菇菌种方法相比，本发明的双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法具有的明显优势包括生产周期短、菌龄一致、生产成本低、接种简便，一支试管种通过五级种培养就可以放大200000倍，液体二级菌种生长速度明显优于固体传统栽培种，速度提高了 33%，同时，液体种各级之间的生长速度并没有太大差异，平均满瓶时间是27. 5d，完全可以在工厂生产中实际应用，具有很好的实用性，能够产生很好的经济效益和社会效应。
图1是碳源对菌丝球生长量结果图；图2是碳源对菌丝球数量影响结果图；图3是碳源对菌丝球直径影响结果图；图4是氮源对菌丝球生长量结果图；图5是不同碳氮比对菌丝球生长量结果图；图6是pH值对生物量的影响结果图；图7是培养过程中pH值变化曲线图；图8是接种液体菌种与固体菌种生长速度比较图；图9是不同浓度的无机盐培养结果图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例所使用的材料和方法为试验材料菌种为双孢蘑菇。按照有机肥料中国人民共和国农业行业标准NY525-2002测定各种原料含碳量和
含氮量。菌丝体生物量测定将生长良好、无污染的摇瓶培养发酵液，经4层纱布过滤，菌丝球生物量湿重为浙干后取固体物在电子天平上称重，菌丝球生物量干重则是直接过滤烘干称重。菌球直径测定取ImL发酵液用水稀释10倍，随机取20个菌球在培养皿中沿固定的直线排成一行，用卡尺测定总长度，重复3次，求其平均值。菌球密度测定取ImL均勻的发酵液用水稀释10倍，于培养皿下垫置黑色方格纸计数。pH值测定采用酸度计测定pH值。还原糖测定取发酵液上清液按3，5- 二硝基水杨酸比色法测定还原糖。菌丝生长速度固体栽培种或是液体菌种相同接种量接种后，观察菌丝在菌种瓶中萌发，向下生长，直至生长至瓶底的时间，即满瓶时间。发酵罐参数测定IOL全自动气升式搅拌玻璃发酵罐装液量为6L，以摇瓶试验得出的最佳液体培养基配方配置液体发酵培养基，在发酵罐中经过空消和发酵罐自身蒸汽 121°C下灭菌20min，待罐内培养基温度下降至25°C左右，按照5%接种量接种已经活化好的液体菌种种子液，通入无菌空气开始控制培养发酵。按1 为间隔定时无菌取样，其菌丝球生物量、菌丝球密度、菌丝球直径，溶氧浓度和pH值以电极测量。
实施例1取活化的斜面母种约0. 5cm2的小块接种到液体培养基中，于25°C恒温振荡培养得一级摇瓶菌种，再将培养好的一级摇瓶液体菌种转接到各处理的二级液体菌种摇瓶中，依次进行各级培养，若无特殊说明，各级摇瓶培养条件均为250mL三角瓶装液量IOOmL,接种量5% (V/V)，摇床转速150r/min，25°C振荡培养5 7d,同样，其余各级液体菌种也是相同的培养方式。双孢蘑菇液体菌种的液体培养基配方为氮源，碳源，KH2PO4 3g, MgSO4 1.5g， VB1 10mg，水1000mL，pH自然，121°C灭菌30min。用作双孢蘑菇斜面培养的PDA通用培养基配方马铃薯200g，蔗糖20g，水IOOOmL, pH自然，121°C灭菌20min，。(1)在液体培养基中，氮源为20g蛋白胨，碳源选择麦芽汁、麸皮、玉米淀粉、果糖、 葡萄糖、甘露糖和蔗糖分别进行培养，其中，麦芽汁为30mL，麸皮、玉米淀粉、果糖、葡萄糖、 甘露糖和蔗糖均为30g。对双孢蘑菇液体菌种菌丝球生物量进行分析，结果如图1所示，在所测碳源中，双孢蘑菇对麦芽汁的利用效果较好，双孢蘑菇菌丝球生物量达15. 25g/100mL, 其次是麸皮、玉米淀粉，而对果糖的利用效果最差，生物量为3. 96g/100mL，利用率仅为麦芽汁的1/4。显然，无论是从理论基础还是生产实际出发，麦芽汁来源广泛，成本远远低于化学试剂糖类价格，从而用复合碳源麦芽汁的经济成本远远低于糖类。不同碳源培养基对菌丝球数量、菌球直径有重要影响，如图2和图3所示，菌球直径最小的是麦芽汁培养基，菌球直径平均为1. 7mm，单位体积发酵液中含有菌球数目465个/mL，其次是麸皮菌球直径2. 1mm、 365个/mL，玉米淀粉菌球直径2. 2mm,345个/mL。复合碳源的培养基能够培养出大量的菌丝球，且菌球直径较为均一，因此，在生产中复合碳源麦芽汁效果最佳。复合碳源营养成分丰富，里面含有较多的固形物质，从而在菌丝利用时产生多种物质使得黏度增大，在一定是黏度范围内，黏度增大有利于菌丝的形成，有利于新的菌丝片段成长为新的菌丝球萌发点，过高或过低的黏度都对菌球的生长和繁殖无益。而低分子碳源，由于其能直接被菌丝吸收利用，在菌丝生长过程中提供充足的营养，使菌丝分枝、延伸， 菌丝生长以变粗变大为特征，从而在后期出现营养不足，并引起菌丝内部缺氧，形成较大的菌丝片段，以致影响了菌球的形成，致使菌球数目急剧降低，菌丝片段多，菌丝球较少，并且直径不统一。(2)在液体培养基中，碳源为30mL麦芽汁，氮源选择蛋白胨、酵母粉、玉米粉、牛肉膏、尿素、硫酸铵和硝酸钾分别进行培养，其中，氮源各为20g。分别接种双孢蘑菇，在25°C下摇瓶培养，测定双孢蘑菇液体菌丝球生物量，结果如图4所示，有机氮与无机氮相比，双孢蘑菇对大多数有机氮的利用效率较高，生物量都较高，玉米粉和蛋白胨都是不错的氮源。对部分无机氮尿素等的利用效率最差，生物量为零。 在以上氮源中，玉米粉与其他氮源相比，产生的泡沫最少，泡沫增多会影响溶氧系数，严重时造成大量逃液，增加污染几率，所以最佳氮源是玉米粉或蛋白胨，由于玉米粉在增加粘性以及成本上的优势，选择玉米粉为氮源。(3)在液体培养基中，碳源为30mL麦芽汁，氮源为20g蛋白胨，并添加玉米粉进行培养，观察玉米粉对双孢蘑菇液体菌种菌丝生长的影响，结果如表1所示，当不添加玉米粉的时候，双孢蘑菇菌丝生物量最小，菌球直径大、数量少；随着玉米粉添加量的增大，菌丝生物量也随之增大，当添加量达到2% (质量比，下同)时，菌球生物量反而变小，可能液体黏性过大，液体摇动振荡速率降低，影响液体中溶氧性，菌丝大量生长时由于没有得到充分的氧气而在后期生长缓慢。而玉米粉添加量在1%、1. 5%时，液体黏性较为合适，氧气供应充足，并且碳氮比均比较适合双孢蘑菇菌丝生长，菌丝适应强，很快诱导菌丝萌发生长，得到大量直径均一的菌丝球，并且生物量也处于最高点，因此，玉米粉添加量优选为1 %。玉米粉不仅可以作为氮源，也作为增黏剂，同时玉米粉还能提供一定的有机质营养，这样玉米粉可以同时满足几个生长因素，但这是相对最经济实惠的，玉米粉在其中被彻底利用，是对资源的充分利用。表1玉米粉含量对双孢蘑菇菌丝生物量影响
添加量(％ )0 I 0. 5 IITo~175~2. 0
生物量(g/100mL)3TT2 9 95 15. 12 13.96 9. 16
菌球直径(mm)279 Γθ h2 7 1.9
菌球数量(个 /mL) 53 268 569 514 351(4)在液体培养基中，碳源为麦芽汁，氮源为玉米粉，进行七个不同的配比方案培养，观察其对双孢蘑菇液体培养的影响。分别比较了不同配比下，对菌丝生物量的影响，从而初步确认最佳碳氮比，结果如图5所示，在碳源充足的情况下，随着氮源的增加，生物量也随之逐渐增加，当碳源比为3 1时(麦芽汁30mL，玉米粉IOg)，生物量达到最大值；而当氮源充足，碳源逐渐减少的时候，生物量随着碳源的降低而减少。同时对培养液的PH值研究发现，氮源过多时，灭菌后PH值会偏高；碳源丰富时，PH值会出现偏低，过高或者过低的PH值都不利于双胞蘑菇菌丝的生长。因此，碳源、氮源并非越多越好，而是要有一个适当的比例才是最适合双孢蘑菇液体菌种菌丝生长，优选比例为3 1或2.5 2.5。(5)在液体培养基中，碳源为30mL麦芽汁，氮源为IOg玉米粉，分别对硫酸镁和磷酸二氢钾做了十个不同浓度的培养。结果如图9所示，添加不同含量的硫酸镁和磷酸二氢钾对菌丝生长有一定的促进作用，当硫酸镁添加量小于0. 05%时，随着其含量的增加，双孢蘑菇生物量也成正比例增加，当含量为0. 05时，达到最大值；然后，生物量随着硫酸镁含量的增加成下降趋势。当磷酸二氢钾含量在0. 10%之前，生物量随着含量的增加而增大，当含量为0. 10%时，生物量达到最大值，这说明低浓度的无机盐对双孢蘑菇有促进作用，而高浓度反而不利于其生长。所以，在双孢蘑菇液体培养基中应添加硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾 0. 10%。(6)在液体培养基中，碳源为30mL麦芽汁，氮源为IOg玉米粉，硫酸镁为0. 5g，磷酸二氢钾为lg，改变培养基初始PH值以确定其液体培养最合适的初始pH值，实验结果由图 6和7所示，pH值对液体菌种生物量的影响呈现钟罩型的曲线，起始pH值不同导致培养结束时双孢蘑菇菌丝生物量的不同，并观察到双孢蘑菇生长PH值的上下临界点，当pH值小于 4或者大于8. 5的时候，双孢蘑菇菌丝不能生长，在pH值在6. 5之前，随着pH值的上升，菌丝生物量也随之增大；当PH值达到6. 5时，菌丝生物量达到最大值；随着pH值的逐步增大， 菌丝生物量也逐步降低。在PH6-7之间，pH值变化情况对菌丝生物量的影响尤为显著，因为初始PH值给微生物提供了一个适宜生长的环境，生物酶处于最适状态，菌丝不需经过长期的适应过程就直接开始新陈代谢作用。初始PH值6. 5培养的液体培养基，培养过程中，pH
6值有一定逐渐变小的趋势，初始阶段变化不太明显，至培养3d后，pH值开始明显下降；培养末期，PH值大约比初始pH值6. 5降低1左右，pH值的降低，培养液酸性增强，会对代谢过程产生一些反馈抑制，降低生物各种酶的活性，影响菌丝生长；同时使液体培养基更容易被其他细菌污染，影响整个发酵过程，所以应该适当缩短液体培养时间，降低污染率，因此选择 PH值6. 5作为液体培养基的初始pH值。至此，得出双孢蘑菇液体菌种的优选培养基配方为麦芽汁30mL，玉米粉10g， KH2P043g MgSO4L 5g, VB1IOmg,水 IOOOmL, ρΗ6· 5。(7)在双孢蘑菇液体菌种的优选培养基(麦芽汁30mL，玉米粉10g，KH2P043g MgSO4L 5g，VB1IOmg,水lOOOmL，pH6. 5)中，选择不同的培养温度培养双孢蘑菇液体菌种，实验结果如表3所示，从表中数据可以看出，25°C时，除了菌球直径并非最佳结果外，其余标准均处于最佳水平菌丝球生物量9. ^g/100mL，菌丝球密度421个/mL，同时还可以发现，在 25°C上下波动范围之内，对菌丝生物量并没有直接显著的影响，因此，选择25°C作为最适培养温度。表2培养温度对双孢蘑菇菌丝生物量的影响
培养温度菌丝球生物量菌丝球密度(个^菌丝球直径~
(0C)(g/100mL)/mL)(mm)
219 3389L09
239 8382L20
25926421ΓΤθ
278^91393 Λ
29 2273L26(8)在双孢蘑菇液体菌种的优选培养基(麦芽汁30mL，玉米粉10g，KH2P043g MgS041. 5g，VBllOmgjjC lOOOmL，pH6. 5)中接种培养双孢蘑菇，通过改变摇瓶的装液量和摇床转速，考察溶氧水平对双孢蘑菇菌丝球生物量、菌丝球密度、菌丝球直径等参数的影响， 结果如表3所示，摇床转速为150r/min时，菌丝生物量处于最大值，而装液量分别在90mL、 120mL、250mL时，差别并不是特别明显，考虑到装液量过多会造成溢液从而容易导致培养液的污染，因此，最佳装液量为90mL/250mL，摇床转速为150r/min。表3装液量和摇床转速对双孢蘑菇生物量的影响生物量菌丝球密度(个菌丝球直径
(g/100mL)/mL)(mm)
Γ^Ο 6^98258L22
~60 SM3ΠL23
装液量 926386L09
(mL/250mL) 120 9Λ7389ΓΤΙ
"Τ50 8Λ7314U3
" δΟ 743297Γ 4
90 497151L59
二一、…士 1205Α4263L51
摇床转速____
15010.263661.10
(r/min)----
1803.711391.00
Ο23 9103091实施例2试管种转接到液体培养液中，需要及时从培养液中获取丰富的营养，才能迅速适应液体而非先前生长的固体斜面培养基环境，因此，需要一级液体培养液中能够提供充分的营养，缩短菌丝生长适应过程，得到比较符合标准的液体菌种。当以一级液体种作为种子继续扩大培养时，需要考虑其生长环境的改变，此时不同的碳源对其生长的影响最为明显。 按一定的接种量将实施例1最佳培养条件下培养至对数生长期的液体种接种到二级液体培养液中，在二级液体培养液中和选择不同碳源进行培养，其结果如表4所示，一级液体种中最合适的碳源麦芽汁对二级种的作用并不十分显著，相反倒是麸皮与葡萄糖对菌丝生物量影响明显。在以上各种不同碳源培养时，菌球生长的形态都有各自的特点，其中蔗糖、甘露醇、麦芽汁作为碳源时，菌丝球大小不均，而麸皮和葡萄糖中的菌丝球大小一致，直径大约是Imm左右，呈典型的圆形菌球。经过比较分析可知，以麸皮作为碳源培养的菌丝球无论是生物量还是菌丝球密度、菌丝球直径各个方面都适合液体菌种生产的要求，所以选择麸皮作为二级液体种的碳源。二级液体培养其余的营养成分及培养条件均与一级液体菌种各个条件一致，即玉米粉作为氮源(添加量为)、磷酸二氢钾0. 05%、硫酸镁0. 10%、VBl 少量。培养条件培养温度25°C、初始pH值6. 5、装液量90mL/250mL、摇床转速150r/min。表4不同碳源对双孢蘑菇二级液体菌种的影响
生物量(g/100mL) 菌丝球密度(个/mL) 菌丝球直径(mm)~ 葡萄糖11.23395 ΓΟΟ
麦芽汁3 432940 8权利要求
1.一种双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤(1)取活化的0.5cm2斜面母种接种到装有6(Tl20mL液体培养基的250mL培养瓶中， 控温2广27°C，9(Tl80rpm振荡培养5 7d得一级摇瓶菌种，按接种量为5 10%转接一级种子到二级培养液进行培养，再将培养好的二级摇瓶液体菌种转接到三级液体培养液进行培养，相同方法依次进行各级培养得种子液；其中，各级摇瓶培养条件相同，液体培养基配方为碳源，氮源 10 20g，KH2PO4 广3g，MgSO4 0. 5 1. 5g，VB1 10mg，水 IOOOmL, pH5 7 ；碳源为 2(T30g的麸皮、玉米粉、葡萄糖、果糖、甘露糖或蔗糖，或2(T30mL麦芽汁；氮源为蛋白胨、酵母粉、玉米粉、硫酸铵或硝酸钾；(2)将步骤(1)所得的种子液按5%的接种量接种至装有6L发酵培养基的IOL发酵罐进行发酵培养，25°C培养5飞d，即可；其中，发酵培养基配方为麦麸30g，玉米粉10g，蛋白胨 lg，磷酸二氢钾 0. 5g、硫酸镁 IgJB1 10mg/L，水 IOOOmL, ρΗ6· 5。
2.根据权利要求1所述的双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于步骤(1) 中，碳氮比为3:1或2.5:1.5。
3.根据权利要求1所述的双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于步骤(1) 中，碳源为麸皮、玉米粉或麦芽汁。
4.根据权利要求1所述的双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于步骤(1) 中，碳源为麦芽汁。
5.根据权利要求1所述的双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于步骤(1) 中，氮源为蛋白胨、酵母粉或玉米粉。
6.根据权利要求1所述的双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于步骤(1) 中，氮源为玉米粉。
7.根据权利要求1所述的双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于步骤(1) 中，一级培养时碳源为麦芽汁，二级培养时碳源为玉米粉。
8.根据权利要求1所述的双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于步骤(1) 中，一级培养时，液体培养基配方为麦芽汁30mL，玉米粉10g, KH2PO4 lg, MgSO4 0. 5g，VB1 10mg,7jC IOOOmL, pH6. 5。
9.根据权利要求1所述的双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于步骤(1) 中，二级培养时，液体培养基配方为玉米粉10g，蛋白胨20g，KH2PO4 lg, MgSO4 0. 5g, VB1 10mg,7jC IOOOmL, pH6. 5。
10.根据权利要求1所述的双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于步骤(1) 中，培养条件装液量为90mL，控温25°C，150rpm振荡培养5飞d，接种量为5%。
全文摘要
本发明公开了一种双孢蘑菇菌种的液体发酵培养方法，包括(1)取活化的0.5cm2斜面母种接种到装有60~120mL液体培养基的250mL培养瓶中，控温21~27℃，90~180rpm振荡培养5~7d得一级摇瓶菌种，按接种量为5~10%转接一级种子到二级培养液进行培养，再将培养好的二级摇瓶液体菌种转接到三级液体培养液进行培养，相同方法依次进行各级培养得种子液；(2)将种子液按5%的接种量接种至装有6L发酵培养基的10L发酵罐进行发酵培养，25℃培养5~6d即可。该方法生产周期短、菌龄一致、生产成本低、接种简便，一支试管种通过五级种培养就可以放大200000倍，液体二级菌种生长速度明显优于固体传统栽培种，速度提高了33%，同时，液体种各级之间的生长速度并没有太大差异，平均满瓶时间是27.5d，完全可以在工厂生产中实际应用。
文档编号A01G1/04GK102550293SQ201210023708
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月3日 优先权日2012年2月3日
发明者刘耀鸿, 刘辉, 华国栋, 孟德龙, 李冠喜, 温以斌, 王多明 申请人:连云港市农业科学院