专利名称：一种利用混合藻类构建人工藻结皮的方法
技术领域：
本发明涉及利用生物材料构建人工生物结皮的生物技术领域，具体的说，本发明涉及利用混合藻种来快速构建藻结皮的技术领域。
背景技术：
近年来我国是世界上沙漠化最严重的国家之一，沙漠化土地总面积已达373万平方公里，年扩展率为2460平方公里，荒漠化越来越严重，每年因沙漠化造成的直接经济损失高达540亿元。针对这严重的现状，寻求有效的途径防止土地资源沙化已是当务之急。传统的防风固沙措施如植树造林、草方格沙障和粘土沙障表面上看是有效的，但不能从根本上解决沙化和沙漠化土地的治理问题。主要是因为高等植物生长缓慢，生长周期长，难以在短时间内起到防风固沙的作用。另外，每棵高等植物因其巨大的抽水作用使本已贫乏的地下水更加贫乏。生物结皮作为干旱荒漠地区特殊环境的产物，是由微生物、藻类、真菌、地衣、苔藓与土壤颗粒形成的有机复合体。生物结皮在其发育过程中，积极参与土壤的形成，对于增加土壤养分和盐分，提高抗侵蚀性能、促进种子植物的植入发挥着重要的生态与地学效应。生物结皮在荒漠生态系统中所具有的重要生态功能引起了生态学家的普遍重视。生物结皮的相关研究成果又为荒漠化防治提供了低成本、高效益的新途径。实现人工生物结皮的快速繁殖对沙漠治理和生态环境改善具有重要的科学意义和现实意义。藻结皮是生物结皮的早期阶段，也是沙漠固定的首要标志。而在人工藻结皮的恢复中，国内藻类学家多是先将藻种纯化分离，经规模化培养，再将若干个优势藻种混合后接种构建藻结皮(胡春香等，荒漠藻对流沙的固定方法，2004)，此方法在野外也取得较好的固沙效果，但是在藻种分离、培养过程周期较长，投入较大等不足。
发明内容
针对国内外本领域中普遍存在土壤藻类分离步骤复杂，培养过程容易污染，且耗费大量的人力物力的现状。本发明的目的在于提供了一种利用生物结皮中藻类进行混合培养，然后返接裸沙中形成生物结皮的方法，成功地避开了藻类的纯化分离问题，在人工藻结皮的构建中效果良好，在荒漠恢复中发挥重要作用。本发明具体提供了一种利用混合藻类构建人工藻结皮的方法，其具体构建方法步骤如下(I)在沙漠选择充分发育的藻结皮，采集，风干后研磨，然后将土样收集；土样中所含藻类以具鞘微鞘藻、鞘丝藻、席藻、颤藻、念珠藻、单歧藻、伪枝藻丝状蓝藻为主体，其中具鞘微鞘藻是优势物种，还有以土生绿球藻、小球藻、色球藻等球形藻类常见物种。(2)在培养盘中接入配制好的BG11液体培养基，将裸沙过O. 2mm筛后按照每升培养基加入IOOg裸沙加入培养基中，加入裸沙将培养盘底铺满，置于培养架上；然后将上述步骤(I)的研磨结皮土样加入液体培养基进行培养，接种量是50g干土 /升培养基，培养温度是室温，光照强度80μ E · m_2 · S—1，3周后将藻种和所固着的沙粒一并收集；经镜检，其培养的混合藻类中，优势物种是以微鞘藻、鞘丝藻、席藻为主的丝状藻占总生物量的80% ;除此以外，还有颤藻、土生绿球藻、小球藻、衣藻、舟形藻和菱板藻等属的一些物种占总生物量的 20%。
(3)将收集的藻种自然风干后，利用手动石磨低速研磨成藻粉，手动石磨可以保证低速研磨，有效地保护藻细胞的完整性。藻粉装入封口塑料袋，置于冰箱内_20°C保存。(4)在土壤温度为20°C时即可接种，利用上述步骤(3)培养后收集的混合藻种在裸沙上接种，接种量是80g · m_2，在前15天内每天施加水分，施水量是3L · m_2，一个月内可初步形成藻结皮，3个月内形成稳定的藻结皮。本发明中，每升BG11 培养基组分如下=NaNO3 I. 5g，，K2HPO4 O. 04g, MgSO4 · 7H20O. 07g，CaCl2 · 2H20 0. 036g,柠檬酸0. 006g,柠檬酸铁胺0. 006g,乙二胺四乙酸钠盐O. OOlg，碳酸钠O. 02g，微量元素么5溶液lmL。其中，A5溶液组分每升重蒸水中加入H3B032.86g, MnCl2 · 4H20 I. 86g, ZnSO4 · 7H20 0. 22g, Na2MoO4 · 2H20 0. 39g, CuSO4 · 5H20 0. 08g,Co (NO3) 2 · 6H20 0. 05g。通过实施本发明具体的技术内容，可以达到以下有益效果。I.通过本发明提供构建人工藻结皮的方法可以迅速扩繁藻种，从野外收集的自然藻结皮，其平均生物量是O. 016±0. 005mg叶绿素a/干土，在BG11液体培养基中经室内培养2-3周后，藻种及沙粒经收集干燥后，其生物量是O. 663±0. 054mg叶绿素a/干土，生物量扩大了 124倍之多。2.通过本发明构建人工藻结皮的方法培养的混合藻种接种在裸沙上，经前期管理后，在3个月内能形成稳定的藻结皮，其形成藻结皮的藻类生物量、结皮厚度、抗压强度分别是5. 77 ± O. 87mg叶绿素a/干土，2. 75 ± O. 42mm, 2. 77 ± I. OON cm_2。与相同生物量接种的单藻种、混合藻种和野外自然藻结皮藻种相比较，其形成藻结皮的生物量、结皮厚度、抗压强度、土壤肥力和酶活性均无显著差异，这说明该技术的可行性和巨大的应用潜力。
图I为是不同藻种处理形成藻结皮的生物量、结皮厚度和抗压强度图，图中，A，B，C，D是指不同的藻种处理，图中相同小写字母表示不同处理间差异不显著。
具体实施例方式下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。实施例一利用混合藻类构建人工藻结皮本发明具体提供了一种利用混合藻类构建人工藻结皮的方法，其具体构建方法步骤如下(I)接种材料的准备在沙漠选择充分发育的藻结皮，采集，风干后研磨，然后将土样收集。土样中所含藻类以具鞘微鞘藻、鞘丝藻、席藻、颤藻、念珠藻、单歧藻、伪枝藻丝状蓝藻占优势，其中具鞘微鞘藻是优势物种，另外、土生绿球藻、小球藻、色球藻等球形藻类常见物种。 (2)培养在培养盘中接入配制好的BG11液体培养基，将裸沙过O. 2mm筛后按照每升培养基加入IOOg裸沙加入培养基中，加入裸沙将培养盘底铺满，置于培养架上；然后将上述步骤的研磨结皮土样加入液体培养基进行培养，接种量是50g干土 /升培养基，培养温度是室温，光照强度80μ E · m_2 · s—1，3周后将藻种和所固着的沙粒一并收集；经镜检，其优势物种是以微鞘藻、鞘丝藻、席藻为主的丝状藻类占总生物量的80%，是形成生物结皮的关键物种；除此以外，还有颤藻、土生绿球藻、小球藻、衣藻、舟形藻和菱板藻等属的一些物种占总生物量的20%，它们保持了生物结皮中藻类的物种多样性。(3)藻种处理与保存收集的藻种自然风干后，利用手动石磨低速研磨成藻粉，手动石磨可以保证低速研磨，有效地保护藻细胞的完整性。藻粉装入封口塑料袋，置于冰箱内-20°C保存。(4)接种在土壤温度为20°C时即可接种，利用上述步骤(3)培养后收集的混合藻种在裸沙上接种，接种量是80g · m_2在前15内每天施加水分，施水量是3L · m_2，一个月内可初步形成藻结皮，3个月内形成稳定的藻结皮。本发明中，每升BG11 培养基组分如下=NaNO3 I. 5g，，K2HPO4 O. 04g, MgSO4 · 7H20O. 07g，CaCl2 · 2H20 0. 036g,柠檬酸0. 006g,柠檬酸铁胺0. 006g,乙二胺四乙酸钠盐O. OOlg, CaCO3 0.02g，微量元素、溶液ImL0其中，A5溶液组分:每升重蒸水中加入H3BO32. 86g, MnCl2 · 4H20 I. 86g, ZnSO4 · 7H20 O. 22g, Na2MoO4 · 2H20 0. 39g, CuSO4 · 5H20 0. 08g,Co (NO3) 2 · 6H20 0. 05g。该发明利用BG11液体培养培养的混合藻种，最大限度地保持了自然藻结皮中的物种多样性，它们不仅有具鞘微鞘藻、隐鞘鞘丝藻、席藻、小颤藻、美丽颤藻、颤藻、眼点伪枝藻等丝状藻类，是形成生物结皮的关键物种；还具有不同类型的球形藻类，如色球藻、集球藻、土生绿球藻、小球藻和衣藻；另外，还发现一些硅藻，如舟形藻和菱板藻等。混合藻类中丰富的藻类物种多样性，包含了更多抗干扰的物种，接种形成的地表生物结皮系统更稳定，有利于抵抗干扰。实施例二 本发明利用混合藻类构建人工藻结皮的效果试验利用土壤中叶绿素a的含量表示藻类生物量，测定方法参见文献(Xie et al.，2007, Soil Biology&Biochemistry, 567-572),根据接种量和土壤中藻类生物量含量,计算
出接种的藻类总生物量，收获藻种生物量是藻种生物量含量与收获藻种土壤重量的乘积。
蔟种扩大样教=顏性雛L觀中M = 0.663 X (50+ 100)
接种藻类生物量含量X接种量 0.016x50'通过本发明提供构建人工藻结皮的方法可以迅速扩繁藻种，从野外收集的自然藻结皮，其平均生物量是0. 016±0. 005mg叶绿素a/克干土，在BG11液体培养基中经室内培养2-3周后，藻种及沙粒经收集干燥后，其生物量是0. 663±0. 054mg叶绿素a/克干土，生物量扩大了 124倍之多。实施例三本发明利用混合藻类构建人工藻结皮的效果试验本实验在大棚中设置4个2. 5mX 2. 5m的样方，铺上厚度为IOcm的流沙，然后分别采用不同的藻种处理
A具鞘微鞘藻B :几种生物结皮中常见的优势藻种按常规比例混合C自然藻结皮经液体培养形成的混合藻种D :自然藻结皮藻种。藻种经研磨后，測定叶绿素含量，将其藻类生物量折合相等，用总生物量均为IOOmg叶绿素a的藻种进行接种，其他条件均相同。培养3个月后，采集土样，土样深度为
O.5cm,自然干燥后測定叶绿素a含量。采用游标卡尺測定所形成藻结皮的厚度，抗压强度采用抗压カ计(TE-3，南京，中国)进行測定，每个样方均5个重复。数据统计方法藻类生物量、结皮厚度和抗压强度不同样方处理之间的差异显著性采用单因素方差分析检验，软件采用SPSS(13.0)完成。參见附图1，通过本发明构建人工藻结皮的方法培养的混合藻种接种在裸沙上，在3个月内能形成稳定的藻结皮，其形成藻结皮的藻类生物量、结皮厚度、抗压强度分别是
5.77±O. 87mg叶绿素a/干土，2. 75±O. 42mm, 2. 77± 1. OONcnT2。与相同生物量接种的具鞘微鞘藻、以常规比例组合的混合藻种和野外自然藻结皮藻种相比较，自然藻结皮经液体培养形成的混合藻种形成藻结皮的生物量、结皮厚度、抗压强度、土壌肥カ和酶活性均无显著差异。该技术具有的明显优势是在最小限度破坏自然藻结皮的条件下快速扩繁藻种，并且最大限度地保持了自然藻结皮的藻类物种多祥性，这充分说明该技术的可行性和巨大的应用潜力。
权利要求
1. 一种利用混合藻类构建人工藻结皮的方法，其特征在于，其具体方法包括以下步骤 (1)在沙漠选择充分发育的藻结皮，采集，风干后研磨，然后将土样收集；土样中所含藻类以具鞘微鞘藻、鞘丝藻、席藻、颤藻、念珠藻、单歧藻、伪枝藻丝状蓝藻为主体，其中具鞘微鞘藻是优势物种，还有以土生绿球藻、小球藻、色球藻等球形藻类常见物种； (2)在培养盘中接入配制好的BG11液体培养基，将裸沙过O.2_筛后按照每升培养基加入IOOg裸沙加入BG11液体培养基中，加入裸沙将培养盘底铺满，置于培养架上；然后将上述步骤(I)的研磨结皮土样加入液体培养基进行培养，接种量是50g干土 /升培养基，培养温度是室温，光照强度80μ E · m_2 · s—1，3周后将藻种和所固着的沙粒一并收集；经镜检，其培养的混合藻类中，优势物种是以微鞘藻、鞘丝藻、席藻为主的丝状藻占总生物量的80% ;除此以外，还有颤藻、土生绿球藻、小球藻、衣藻、舟形藻和菱板藻等属的一些物种占总生物量的 20% ； (3)将收集的藻种自然风干后，利用手动石磨低速研磨成藻粉，藻粉装入封口塑料袋，置于冰箱内-20°C保存； (4)在土壤温度为20°C时即可接种，利用上述步骤(3)培养后收集的混合藻种在裸沙上接种，接种量是80g · m_2，在前15天内每天施加水分，施水量是3L · m_2，一个月内可初步形成藻结皮，3个月内形成稳定的藻结皮； (5)本发明中，每升BG11培养基组分如下为，NaNO3I. 5g，，K2HPO4 O. 04g, MgSO4 · 7H20.O. 07g，CaCl2 · 2H20 0. 036g,柠檬酸0. 006g,柠檬酸铁胺0. 006g,乙二胺四乙酸钠盐.O. OOlg, CaCO3 0.02g，微量元素、溶液ImL;其中，A5溶液组分为每升重蒸水中加入H3BO3.2. 86g, MnCl2 · 4H20 I. 86g, ZnSO4 · 7H20 O. 22g, Na2MoO4 · 2H20 0. 39g, CuSO4 · 5H20 0. 08g,Co (NO3) 2 · 6H20 0. 05g。
全文摘要
本发明公开了利用混合藻类构建人工藻结皮的方法，通过在沙漠选择充分发育的藻结皮，采集，风干后研磨，将裸沙过0.2mm筛后按照每升BG11液体培养基加入100g裸沙中，接种量是50g干土/升培养基，在室温，光照强度4000lux，3周后将藻种和所固着的沙粒一并收集；培养的混合藻，优势物种是以微鞘藻、鞘丝藻、席藻为主的丝状藻占总生物量的80％；颤藻、土生绿球藻、小球藻、衣藻、舟形藻和菱板藻等物种占总生物量的20％；将收集的藻种风干后研磨成藻粉置于冰箱内-20℃；在土壤为20℃在裸沙上接种，接种量是80g·m-2，每天施加水分3L·m-2。本发明成功地避开了藻类的纯化分离问题，具有广泛的应用性。
文档编号A01G33/00GK102613065SQ20121008496
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者张丙昌, 张元明, 王敬竹 申请人:中国科学院新疆生态与地理研究所