专利名称：一种川芎种质的离体保存方法及川芎离体保存培养基的制作方法
一种川芎种质的离体保存方法及川芎离体保存培养基
发明内容
本发明属于栽培领域，涉及一种川芎种质的离体保存方法及川芎离体保存培养基。
背景技术：
川弯为伞形科植物川弯Ligusticum chuanxiong Hort.的根莖，为我国的传统中药，也是著名的川产道地药材，具有近两千年的栽培和使用历史。历代医家均作为治头痛、活血行气、祛风止痛药使用。2005版《中国药典》一部中收载的成方制剂和单味制剂共564种，其中使用川芎的有85种，约占药典收载中成药的15%。在2010年版《中国药典》收载的1039个成方制剂和单味制剂中，含川芎的有155个，占所载成方制剂总数的14.92%。两版药典使用川芎的收载处方增加了 82.35%，说明川芎使用量和需求量在不断提高。现代临床上主要用于治疗心脑血管系统的疾病，效果显著，如“速效救心丸”等。川芎除供药用外，还用于保健品、美容化妆品、饲料添加剂、烟用香料添加剂及天然防腐剂等，国内外市场需求量大。川芎是无性繁殖，生产上用膨大的地上茎节(苓种或芎苓子)作为繁殖材料。长期以来，川芎种植基本处于自发状态，苓种繁育仍然停留在自繁自用，缺乏统一的生产技术规程和科学的组织管理，且没有苓种分级标准和检验规程，导致川芎苓种质量良莠不齐，使产区川芎药材的产量和质量受到极大影响。经过上千年的栽种，加上缺乏选种育种，存在一定程度的种质退化。蒋桂华等，“川芎种质资源的调查收集与保存研究”，中草药，2008年4月第39卷第4期与高农等，“川芎苓子繁育技术”，药用植物.特种经济动植物2004年第10期均报道了的川芎种质的保存方法，但均为传统的田间保存方法，存在耗费人力物力，容易损失，成本闻，保存效果不佳等缺点。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明提供了一种川芎种质的离体保存方法其离体保存培养基。本发明川芎种质的离体保存方法，它包括如下步骤:(I)取川芎茎尖，消毒灭菌；(2)将步骤(I)处理后的川芎茎尖接种于川芎离体保存培养基中保存，保存条件为:温度4 25°C，光照强度60(Tl5001x，光照时间l(Tl4h/d ;所述保存培养基以1/2MS培养基为基础培养基，添加2(T30g/L蔗糖，或者以MS培养基为基础培养基，添加2(T60g/L蔗糖。其中，所述步骤(I)包括如下步骤:I)消毒:取川芎茎尖，用消毒粉消毒其表面；2)灭菌:取步骤I)处理后的川芎茎尖，用70%乙醇灭菌30s，再用HgCl2灭菌2 5min，或者先用70%乙醇灭菌15s， 再用HgCl2灭菌5min。
其中，步骤(2)所述保存培养基以1/2MS培养基为基础培养基，添加20g/L蔗糖，或者以MS培养基为基础培养基，添加40g/L蔗糖。其中，步骤(2)所述保存培养基中含有植物生长抑制剂。植物生长抑制剂:是抑制或破坏植物顶端分生组织的分裂与膨大的一类化学物质，它能延缓细胞分裂和伸长，达到控制部分生长、刺激花芽分化、延缓衰老等目的。所述植物生长抑制剂为多效唑、矮壮素、烯效唑或者青鲜素。优选地，所述多效唑的浓度不低于0.5mg/L ;所述矮壮素的浓度为(T40mg/L。进一步优选地，所述多效唑的浓度为0.5mg/L ;所述矮壮素的浓度为40mg/L。其中，步骤(2)所述保存条件为:温度为25°C，光照强度为8001x，光照时间为12h/d0本发明川芎离体保存培养基，它以1/2MS培养基为基础培养基，添加2(T30g/L蔗糖，或者以MS培养基为基础培养基，添加2(T60g/L蔗糖。其中，所述保存培养基以1/2MS培养基为基础培养基，添加20g/L蔗糖，或者以MS培养基为基础培养基，添加40g/L蔗糖。其中，所述保存培养基中还添加有植物生长抑制剂。所述植物生长抑制剂为多效唑、矮壮素、烯效唑或者青鲜素。优选地，所述多效唑的浓度不低于0.5mg/L ;所述矮壮素的浓度为(T40mg/L。进一步优选地，所述多效唑的浓度为0.5mg/L ;所述矮壮素的浓度为40mg/L。本发明保存方法实现了离体保存川芎种质，操作方便，成本低廉，可以保证川芎的遗传稳定性，从而保留优质的川芎资源，具有良好的市场应用前景。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
图1不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗存活率柱状图(I月)图2不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗株高柱状图(I月)图3不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗存活率柱状图(2月)图4不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗株高柱状图(2月)图5不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗存活率柱状图(3月)图6不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗株高柱状图(3月)图7不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗存活率柱状图(4月)图8不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗株高柱状图(4月)图9不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗存活率柱状图(5月)图10不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗株高柱状图(5月)图11不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗存活率柱状图(6月)图12不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗存活率柱状图(6月) (不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗株高(6月))图13不同培养基和蔗糖浓度在不同保存时间对试管苗存活率的影响图14不同培养基和蔗糖浓度在不同保存时间对试管苗株高的影响图15不同浓度PP333对川芎试管苗存活率的影响图16不同浓度PP333对川芎试管苗株高的影响图17不同浓度CCC对川芎试管苗存活率的影响图18不同浓度CCC对川芎试管苗株高的影响图19川芎再生苗(4号)图20 SOD图谱，从左到右:川芎再生苗CK2 CKl (11号)图21 POD-VC图谱，从左到右:CK1 CK2川芎再生苗(14号)图22 POD-愈创木酚图谱，从左到右:CK1 CK2川芎再生苗(4号)图23 CAT图谱(经典法)，从左到右:CK1 CK2川芎再生苗(11号)图24 CAT图谱(高锰酸钾法)，从左到右:CK1 CK2川芎再生苗(14号)
具体实施例方式缩略语:PP333:多效唑；CCC:矮壮素。实验材料:消毒粉、洗洁精、PP333、CCC、MS培养基、1/2MS培养基，均为市售品。实施例1外植体的筛选实验1、实验方法分别选择川芎茎节、顶端幼嫩茎尖作为外植体在MS培养基中离体培养。茎尖:用去污粉浸泡，清水冲洗20min，在无菌操作台上用70%酒精消毒60s，升汞消毒 7min30s。茎节:用去污粉浸泡，清水冲洗20min，在无菌操作台上用70%酒精消毒70s，升汞消毒8min。2、实验结果两周内，大多数茎节褐化并产生霉菌，而茎尖仅有少部分褐化死亡，污染较少，说明川芎的茎尖可以作为离体保存的外植体，而茎节不适合作为离体保存的外植体。实验说明，本发明保存方法中，使用川芎茎尖作为川芎种质进行保存是有效的。实施例2消毒灭菌方法的选择1、实验方法取川芎茎尖作为外植体， 按照表I，对外植体外表面消毒灭菌方法进行考察:表I川芎茎尖灭菌方法对比
权利要求
1.一种川芎种质的离体保存方法，其特征在于:它包括如下步骤: (1)取川芎茎尖，消毒灭菌； (2)将步骤(I)处理后的川芎茎尖接种于川芎离体保存培养基中保存，保存条件为:温度4 25°C，光照强度60(Tl5001x，光照时间l(Tl4h/d ;所述保存培养基以1/2MS培养基为基础培养基，添加2(T30g/L蔗糖，或者以MS培养基为基础培养基，添加2(T60g/L蔗糖。
2.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于:所述步骤(I)包括如下步骤: O消毒:取川芎茎尖，用消毒粉消毒其表面； 2)灭菌:取步骤I)处理后的川芎茎尖，用70%乙醇灭菌30s，再用HgCl2灭菌2 5min，或者先用70%乙醇灭菌15s，再用HgCl2灭菌5min。
3.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于:步骤(2)所述保存培养基以1/2MS培养基为基础培养基，添加20g/L蔗糖，或者以MS培养基为基础培养基，添加40g/L蔗糖。
4.根据权利要求1或3所述的保存方法，其特征在于:所述保存培养基还添加有植物生长抑制剂。
5.根据权利要求4所述的保存方法，其特征在于:所述植物生长抑制剂为多效唑、矮壮素、烯效唑或者青鲜素。
6.根据权利要求5所述的保存方法，其特征在于:所述多效唑的浓度不低于0.5mg/L ；所述矮壮素的浓度为(T40mg/L。
7.根据权利要求6所述的保存方法，其特征在于:所述多效唑的浓度为0.5mg/L ;所述矮壮素的浓度为40mg/L。
8.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于:步骤(2)所述保存条件:温度为25°C，光照强度为8001x，光照时间为12h/d。
9.一种川芎离体保存培养基，其特征在于:它是以1/2MS培养基为基础培养基，并添加2(T30g/L蔗糖，或者以MS培养基为基础培养基，并添加2(T60g/L蔗糖。
10.根据权利要求9所述的培养基，其特征在于:所述保存培养基以1/2MS培养基为基础培养基，添加20g/L蔗糖，或者以MS培养基为基础培养基，添加40g/L蔗糖。
11.根据权利要求9或10所述的培养基，其特征在于:它还添加有植物生长抑制剂。
12.根据权利要求11所述的培养基，其特征在于:所述植物生长抑制剂为多效唑、矮壮素、烯效唑或者青鲜素。
13.根据权利要求12所述的培养基，其特征在于:所述多效唑的浓度不低于0.5mg/L ；所述矮壮素的浓度为(T40mg/L。
14.根据权利要求13所述的培养基， 其特征在于:所述多效唑的浓度为0.5mg/L ;所述矮壮素的浓度为40mg/L。
全文摘要
本发明公开了一种川芎种质的离体保存方法，它包括如下步骤(1)取川芎茎尖，消毒灭菌；(2)将步骤(1)处理后的川芎茎尖接种于川芎离体保存培养基中保存，保存条件为温度4～25℃，光照强度600～1500lx，光照时间10～14h/d；所述保存培养基以1/2MS培养基为基础培养基，添加20～30g/L蔗糖，或者以MS培养基为基础培养基，添加20～60g/L蔗糖。本发明还公开了一种川芎种质的离体保存培养基。本发明川芎种质的离体保存方法操作方便，操作简单，保存效果优良。
文档编号A01N3/00GK103210904SQ201210475218
公开日2013年7月24日 申请日期2012年11月21日 优先权日2012年11月21日
发明者蒋桂华, 马逾英, 张俊, 唐琳, 梅兰菊, 朱玲玲, 陈佳妮 申请人:成都中医药大学