专利名称：一株能促进木麻黄营养元素吸收的内生真菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株能促进木麻黄营养元素吸收的内生真菌。
背景技术：
植物内生菌的研究始于19世纪末,Vogl从黑麦草Lolium temulentum L.种子中分离出第一株内生菌[1]。但真正开始大量研究植株中的内生菌起始于上世纪八十年代，主要是在温带地区、亚热带地区和热带地区的植被中开展研究。前人从大部分植物中都能分离出内生菌，因此可以推测内生菌在植株中是普遍存在的。在全世界范围内至少在80多个属290多种的禾本科农作物中发现了内生菌[2]。目前从植物中分离的内生菌根据其具有的独特功能可以分为:固氮菌、固钾菌、固磷菌等植物促生菌[3~4]、具有抗病虫害的生防菌[5~7]和具有促进植物对不良环境的修复能力的抗性菌。当前沿海木麻黄防护林在生产发展中遇到的主要难题是林分更新困难，连载使得生产力大幅下降，以致于防护功能的减退，土地的贫瘠以及人为的破坏导致木麻黄自身生态系统的循环受到严重影响。本章通过测定水培接菌方式下不同菌株处理苗木体内营养元素的含量，探讨内生真菌的接种是否能够缓解木麻黄自身营养不足导致的生产力下降的问题，从而为今后木麻黄林地可持续发展提供可靠的理论与实践依据。木麻黄科植物是兼有弗兰克氏菌菌(Frankia)、内生菌根菌和外生菌根菌的共生营养型植物，因此，关于木麻黄真菌学方面的研究方向目前较多涉及弗兰克氏菌(Frankia)、青枯菌(Solanasearum)、青枯假单胞杆菌(Pseudomonas solanacearum Smith)等，虽然木麻黄人工接种菌根菌后的促生效果已毋庸置疑，但是仅停滞于根瘤菌根菌的研究，木麻黄内生真菌方面的研究尚未见报道[8_9]。前人的研究中应用菌株，多为外生真菌，同时也没有从促进营养元素吸收能力的因素去寻找内生真菌，提高其科学性和可靠性[1°]。证实能促进营养元素吸收的内生菌方面尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一株能促进木麻黄营养元素吸收的内生真菌。本发明提供的一株能促进木麻黄营养元素吸收的内生真菌，所述功能内生真菌为曲霉sp.)木麻黄根际真菌13,已于2012年6月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC N0.6306。该菌的分离、纯化包括:
A、材料:将采集得到不同年份的根、枝条、鳞状叶小枝分成三个部分，用自来水清洗干净，分装到自封袋内，于4°C冰箱保存；
B、消毒:70%酒精浸泡30s——无菌水浸`洗一次——10%次氯酸钠浸泡7min——无菌水浸洗一次。当样品最后一次浸洗后的水盛于灭菌的小烧杯中，在平板上划线作为对照，以检验样品的消毒是否彻底，若干天后如有菌落生成，则表明样品表面消毒不彻底，需继续调整消毒方法[11_13];
C、接种部位的选择:鳞状叶小枝:分取植株的上、中、下三个部分的鳞状叶小枝，每个鳞状叶小枝又分为枝尖部、枝中部和枝基部3个处理；枝条:上中下分为3部位，其中第3部位为枝莖交接处；根部:分为根尖和根基2个部分；
D、接种:将消毒后的外植体用接种刀切开，铺放在培养基表面，于28°C恒温培养箱内培养5— 7天后观察菌落生长状况。有的菌株繁殖迅速，可先将其产生的菌株进行分离纯化；生长缓慢且数量较少的菌株可延长观察时间，直到其生长稳定后纯化。固体培养:使用改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂14.0g/L、其它为无菌水，pH值6.4±0.2，培养温度为28°C，培养方式为平板培养，培养时间为48h ；
E、将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯化、转接后得到单一菌种的上述的Aspergillus sp.功能菌株；
其在平面培养基上，菌落为白色毡状绒毛，菌落中镶嵌有墨绿色颗粒状突起绒毛，基质颜色为黄绿色。分生孢子梗直立，简单，顶端球形，顶部着生小梗；分生孢子(梗孢子)单孢，球形；参照真菌鉴定手册将其鉴定为曲霉属(Aspergillus sp.),保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.6306。上述的一种能促进木麻黄营养元素吸收的内生真菌应用菌液的制备方法，是将上述的菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28°c，培养时间48 72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0X106cfu/ml即为成品备用；液体培养基:为改良马丁培养基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。上述的一种能 促进木麻黄营养元素吸收的内生真菌应用菌液的应用方法，是应用该菌株的菌液，苗木栽植前期蘸根和用于林地浇根。上述的一种能促进木麻黄营养元素吸收的内生真菌应用菌液的应用方法，是用9.0X105cfu/ml菌液，按每株IOOml在林地浇于每株木麻黄的根际。上述的一种能促进木麻黄营养元素吸收的内生真菌应用菌液的应用方法，是应用该菌株的菌液5.0X 105Cfu/ml在水培苗栽植前将苗蘸根lOmin。本发明涉及的菌株是从木麻黄植株中分离纯化得到的，目标菌株为曲霉(Aspergillus sp.)木麻黄根际真菌13,已于2012年6月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为CGMCC N0.6306。经接种于木麻黄水培苗，根据元素分析的各项指标综合评判，进一步证实木麻黄根际真菌13对元素吸收具有促进作用以及实际对木麻黄的干物质的增效作用，寻找到对促进元素吸收有益的功能内生真菌可应用于生产。通过菌液浸泡的方法接种于木麻黄幼苗，接种30天后用测定植株的磷、钾、镁、锌、锰元素含量。木麻黄根际真菌13所处理植株与对照相比，磷、钾、镁、锌、锰元素含量分别提高了 22.05%,270%,5.83%、220%和230%。表明其对于促进植株的元素吸收具有极显著效果。
图1为不同处理对木麻黄苗木N吸收的影响。图2为不同处理对木麻黄苗木P吸收的影响。图3为不同处理对木麻黄苗木K吸收的影响。图4为不同处理对木麻黄苗木Mg吸收的影响。图5为不同处理对木麻黄苗木H吸收的影响。图6为不同处理对木麻黄苗木Zn吸收的影响。
图7为不同处理对木麻黄苗木Mn吸收的影响。
具体实施例方式1、水培繁殖中的应用
取配制好的上述内生真菌(木麻黄根际真菌13，以下菌株13号)应用菌液，制成
5.0X105cfu/ml菌液，在水培苗栽植前蘸根lOmin。可提高植苗成活率10%以上。2、根际土壤浇施应用
试验材料为惠安一号水培苗，苗木于2011年7月盆栽于福建农林大学森林生态研究所田间试验地。水培苗根系长齐后，将其移入黄心壤土和沙以3:1的比例混合的土壤，并分装于约500个直径22cm，高15cm的花盆中。每盆放入相等质量的3.36KG混合土壤，为了保证后期苗木接菌的准确性，往每盆土壤中滴入1(Γ15滴甲醛(福尔马林)消毒液，并用塑料薄膜封盖盆口，消毒时间为24h。待土壤内甲醛渗透消毒完全，除去塑料薄膜，将剩余的甲醛蒸发，以免影响幼苗的移植成活率。经过一个月的恢复性生长，在木麻黄根际施入菌株浓度为9.0X 105cfu/ml的菌液100ml，重复3次，用蒸馏水溶液处理作为空白对照。菌液的制备:将菌株13号接入液体培养基，培养基为改良马丁培养基，每L含蛋白胨5.0g、酵母浸出粉2.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾1.0g、硫酸镁0.5g,其它为无菌水，pH值6.4±0.2。经过24h的培养，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成
1.0X 106cfu/ml至9.0X 106cfu/ml备用。接种后30天后进行各指标的测定，检测方法和结果如下:
2.1菌株浇施后木麻黄元素分析
将烘干的苗木全株用小型粉碎机全部粉碎至粉末状，采用硝酸一高氯酸混合液消煮，供磷、钾、镁、锌、锰的测定，氮、氢用EA3000 CHNS/0元素分析仪直接测定。^全磷采用钥锑抗比色法，结果计算為，式中:Wp为磷含量，g/kg ；二
e为工作曲线上查得显色液磷(JF )的浓度，yg/ml ;7为显色液体积，50ml ;&为分取倍
数■力烘干样质量，g;
钾、钙、镁、锌、锰用原子吸收分光光度计测定，结果计算:
r-cxfrx^iom,式中A为钾含量:，g/kg ；为工作曲线上查得测读液中钾()的浓
■T 17 IHXlCf一*度，μ g/ml ;F为测读液体积，即消煮待测液定容体积50ml: 为分取倍数； 为烘干样质量，g ;
gixj^x 蒙
③sV=^ixl00li，式中:W|为镁含量，g/kg;^为镁工作曲线上查得镁(Mg)的浓度，μ g/ml ; F为测读液体积，50ml 为分取倍数；》 为烘干样质量，g ；
④HF1，式中Jzn为锌含量，mg/kg ；为工作曲线上查得锌()的浓度，μ g/
- MtT
cΛ
ml ; F为测读液体积，50ml t力分取倍数； Β为烘干样质量，g ；
,式中=Wifo为锰含量，mg/kg ；为工作曲线上查得锰(M )的浓度，μ g/
ml P力测读液体积,50ml &力分取倍数；!《为烘干样质量，g。所有数据处理以及图表制
作均采用Excel和SPSS软件处理。3结果分析
植物的正常生长发育离不开各种营养元素，由于元素间的功能各不相同，且与植株本身的基因和生长环境等内外因素密切相关，因此在植物体内的含量分布也不同。N、P、K、Ca、Mg、C、H均是植物体 内的大量营养元素，维持着植物正常的生理需要:C、N、P、H是合成有机质的基础，N还是合成蛋白质和叶绿素的组成成分，K是酶的活化剂，能使细胞充水膨胀，有利于光合和代谢作用，Ca和Mg则参与植物体内一些调节生命的活动；Zn和Mn虽是植物体内的微量营养元素，却起到了不可或缺的作用，因为它们参与活化剂一酶和辅酶的组成，也可能存在于维生素和生长素中，对植物的新陈代谢起到重要调节作用。3.1不同处理对木麻黄水培苗吸收N、P、K、Ca、Mg等元素的影响
试验通过标准的元素测定方法测得了水培接菌方式不同处理下木麻黄苗木体内的N、P、K、Ca、Mg、C、H元素含量,结果显示如图1所示。单因素方差分析显示，菌株13处理下木麻黄苗木体内的N相对含量与对照相比差异达到显著水平(sig=0.000，显著水平为0.05)，菌株13号为对照苗木N相对含量的12.78倍。如图2所示，菌株13号的磷含量较对照增加了 22.05%。方差分析结果表明，菌株13处理下苗木K含量与对照相比差异达到显著水平(sig=0.000，显著水平为0.05)，菌株13号处理苗木体内K元素的含量较对照苗木相比，达到3.7倍(图3)。Mg元素被称为植物的中量营养元素，有参与调节植物体的生命活动。菌株13处理下苗木体内的Mg含量较对照相比，增幅达到5.83% (图4)。H元素作为植物体生活物质的构成部分，但H主要来源于土壤，在植物体内平均含量排名第三，相对含量约为6%。方差分析显示，菌株13处理H含量与对照相比差异显著，菌株13号处理下木麻黄体内的H兀素相对含量达到对照苗木的9.5倍(图5)。3.2不同处理对木麻黄水培苗吸收Zn、Mn微量元素的影响
试验通过标准的元素测定方法测得了水培接菌方式菌株13处理下木麻黄苗木体内的Zn、Mn微量元素含量，见图6和图7。作为微量元素，植物体内Zn元素的含量约占植物体的0.002%,但是只要是细微的增加，都将有利于植物体的新陈代谢以及促进各种酶和辅酶的形成。方差分析结果显示，处理13 Zn含量与对照的差异达到显著水平(sig=0.000，显著水平为0.05)，说明内生真菌的接种有利于提高苗木对土壤中微量元素Zn的吸收，从图6可以看出，菌株13号对木麻黄苗木Zn含量的增长效果最显著，为对照苗木的3.2倍。与Zn元素相同，植物体内Mn元素的含量也很微小，约占植物体的0.005%, Mn含量的稀少并没有影响内生真菌发挥其促进增长作用，与Zn元素的测定结果较为一致，方差分析结果显示，处理间Mn含量的差异也达到显著水平(sig=0.000，显著水平为0.05)，说明内生真菌的接种同样有利于提高苗木对土壤中微量元素Mn的吸收，从图7可以看出，菌株13号处理下苗木体内的Mn元素含量为对照苗木的3.3倍以上。菌株13号所处理植株与对照相比，磷、钾、镁、锌、锰元素含量分别提高了 22.05%、270%,5.83%、220%和230%。表明其对于促进植株的元素吸收具有极显著效果。本发明发现一株能促进木麻黄元素吸收的内生真菌，将该株木麻黄内生真菌菌株采用蘸根或菌液浇施的方法接种于木麻黄幼苗。通过接种后植株的元素分析，得出菌株的提高元素吸收能力均较大程度高于对照，表明其对于促进植株的元素吸收作用效能具有很大功用，从而进一步证实得到该株内生真菌能促进木麻黄元素吸收。
参考文献
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权利要求
1.一株能促进木麻黄营养元素吸收的内生真菌，其特征在于:所述内生真菌为曲霉{Aspergillus sp.)木麻黄根际真菌13,已于2012年6月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC N0.6306。
2.一种如权利要求1所述的内生真菌的应用菌液，其特征在于:所述应用菌液的制备方法，是将所述的曲霉sp.)木麻黄根际真菌13接入液体培养基,摇床振荡培养，培养温度为28°C，培养时间48 72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0X106cfu/ml，备用；液体培养基:为改良马丁培养基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH 值 6.4±0.2。
3.—种如权利要求2所述的应用菌液的用途，其特征在于:所述应用菌液用于林地浇根或苗木栽植前期蘸根 。
全文摘要
本发明涉及一株能促进木麻黄营养元素吸收的内生真菌。所述内生真菌为曲霉(Aspergillussp.)木麻黄根际真菌13，已于2012年6月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCNo.6306。经接种于木麻黄水培苗，根据元素分析的各项指标综合评判，进一步证实木麻黄根际真菌13对元素吸收具有促进作用以及实际对木麻黄的干物质的增效作用，寻找到对促进元素吸收有益的功能内生真菌可应用于生产。
文档编号A01N63/04GK103173361SQ20131006879
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月5日 优先权日2013年3月5日
发明者洪伟, 吴承祯, 谢安强, 林燕青, 林晗 申请人:福建农林大学