专利名称：一种有机添加物对金线莲产业化快速繁殖关键技术的制作方法
技术领域：
本发明属于金线莲的产业化快速繁殖培养技术。
背景技术：
金线HShorthairyAntenoron)属兰科开唇兰属 YAnoectochilusroxburghii (wall.) Lindl]多年生珍稀中草药植物，中文学名是花叶开唇兰,索有“药王”、“金草”、“神药”、“乌人参”等美称。别名金丝线、金耳环、乌人参、金线虎头蕉、金线入骨消、金钱草、金线石松、金石蚕、少年红、小叶金耳环、麻叶菜。主要分布于中国、日本、斯单兰卡、印度和尼泊尔等国，生长在深山密林下或溪涧旁潮湿的草丛中或钓一林下，特别是阔叶林下的潮湿地带，一般呈稀疏、零星分布，很少成片密生，金线莲是我国传统的珍贵药材，因其叶脉呈金黄色的美丽脉纹，观赏价值极高，也具有开发为室内观叶小盆栽的广阔前景，金线莲含有多种化学成分，药理作用显著，临床应用十分广泛。分析其成分表明，其含有强心苷类、有机酸、氨基酸和多糖类、牛磺酸、留醇、生物碱、Sorghumol、黄酮苷及其衍生物、对羟基苯甲醛、阿魏酸、槲皮素、粗脂肪、胡萝卜有及微量元素如硒、钥等。具有凉血泻火、消肿止痛的功效，能调节体内分泌，抑制分泌过多的油质，促进皮肤细胞的新陈代谢，服用后对青春痘、粉刺、各种黑斑、雀斑、老人斑效果奇佳，具有降血糖、抗肾炎、护肝、利尿、镇静、降血压、抗氧化、改善骨质疏松等作用，其中多糖成分对癌细胞具有较好的杀伤作用，是非常有前景的抗肿瘤药物或辅助抗肿瘤药物。金线莲种子微小，胚发育不完全，在自然条件下极难出芽'，若以分根或扦插繁殖，则耗时长且繁殖系数低，金线莲赖以生存的自然环境发生变化，野生资源锐减，现已濒绝，并且自然环境生长的金线莲因人为大量采挖及鸟、鼠等动物啃食己大大降低了自然存量，种质资源稀缺，已濒临灭绝，不能满足临床需要。近年来人工繁殖金线莲的工作也相应广泛展开，组培快繁金线莲虽已有报道，金线莲的组培快繁技术在各个环节上的研究也取得较大进展，但目前生产中尚缺完备的组织培养技术体系，在规模化、产业化生产的关键技术上有待进一步研究和突破，本发明涉及一种金线莲产业化快速繁殖培养技术，通过应用本发明可以提供大面积种植的优良纯化组培苗，以期为金线莲产业化提供技术支撑。
发明内容
本发明的目的是提供一种金线莲产业化快速繁殖的组织培养方法，提供大面积种植的优良纯化组培苗，解决现有技术中种子微小，胚发育不完全，在自然条件下极难出芽繁殖系数低等问题，选择合适添加有机添加物的培养基繁殖对金线莲苗产品品质、成品苗品像产生直接影响，应用该方法培养增殖时间短、扩繁系数高、一次性成苗、苗健康、茎粗、根系发达、叶片颜色深厚有明显的绒布状，叶脉金线明晰，成活率高，每株重量达4.5-5.5克，具有显著的经济效益，同时应用本发明在实施规模化、产业 化生产的关键技术上得到了进一步突破，为金线莲种资源的推广和发展以及将其应用于植物基因工程和遗传转化体系的建立和完善具有重要意义。
一种有机添加物对金线莲产业化快速繁殖关键技术:
所述方法具体步骤包括:
O 取材:外植体材料为野生金线莲；在春秋季节采摘，采摘后将其用湿布包好带回实验室备用；
2)培养基的配制:
芽诱导培养基:MS +BA 0.5-2.0mg.L_1+KT 0.5_2mg.L、NAA 0.5_2mg.Γ1 + 蔗糖30g.Γ1+ 活性炭 l-2g.Γ1+ 琼脂 6.5g.Γ1 ；
丛芽诱导培养基:MS+BA 0.5-3mg.Γ1 +KT 0.5_2mg.Γ1 +NAA 0.5_2mg.Γ1 + 蔗糖30g.Γ1 + 香蕉汁 50-150 g.Γ1 + 蛋白胨 0.5-2.5g.Γ1 + 活性炭 l_2g.L-1 + 琼脂
6.5g.L 1 ；
芽增殖培养基:1/2MS+BA 0.5-3mg.Γ1 +KT 0.5_2mg.L-1+NAA 0.5_2mg.Γ1 + 香蕉汁50- 150 g.L—1 + 蛋白胨 0.5-2.5g.L-1 + 花宝 I 号 0.5-1.5g.L-1 + 蔗糖 30g.L-1 + 活性炭 0.5-1.5g.Γ1 + 琼脂 6.5g.Γ1 ；
生根培养基:1/3MS+ IBA 0.5-lmg.!/1 +NAA 0.5-lmg.!/1 + 马铃薯浆 50- 150 g *L_1+ 蔗糖 30g.Γ1 + 活性炭 0.5-2g.Γ1+ 琼脂 6.5g.Γ1 ；
所述香蕉汁的制备方法为:将香蕉去皮后粉碎成泥状；
所述马铃薯浆的制备方法为:将马铃薯去皮后粉碎成浆状；
3)材料消毒处理:将采集 的野生金线莲用自来水冲洗干净，在距离芽点1-2厘米处剪取茎段，去除多余的叶片，置饱和漂白粉上清液中漂洗15min并用软毛刷轻轻刷洗，冲洗干净后，置于流水中冲滴0.5-1小时，再用双蒸水冲洗2-3次，在超净工作台内用75%的酒精消毒30s,加入0.lwt%HgCl2处理5-10min ;再用无菌水冲4_6遍后置工作台备用。4)芽诱导培养:将消毒后的材料放在灭过菌的培养皿上，用手术刀切掉与升汞接触的切口部分0.2-0.4cm，然后将材料切成l-2cm长的茎段分别接种于经高温、高压灭菌的诱导培养基中；培养条件:培养室温度为23±2°C,光照时间12h/d,光照强度500-10001x,芽诱导培养30天；得到丛生芽。5)增殖培养:将经步骤4)诱导培养所得到的丛生芽切开并剪成长度为1.5-2cm,分别接种在增殖培养基中；接种时将茎段平放在培养基上，经过50-70d增殖培养，将增殖后的丛生芽切割为芽数为5-10个的茎段进行为期50-70d的扩大增殖培养；整个过程的培养室温度为23±2°C，光照时间12h/d，光照强度1500-20001x ；
6)诱导生根:将步骤5)增殖培养出来的幼苗单株切下，带有2-3片叶子，株高l-2cm，转移到生根培养基中；生根培养时间为30天，培养室温度为23±2°C，光照时间12h/d，光照强度 1500-20001x ；
7)瓶苗移栽:经步骤6)诱导生根后，当植株长至IOcm时，将试管苗放在自然光下炼苗3-5天后，再打开瓶盖炼苗2-3天，然后从培养瓶中取出，洗去附着在根系的培养基，移入质量比蛭石和腐殖土质量比为1:2的混合基质中，温度控制在15-30°C，湿度应保持在70% -85%之间，避免阳光直射，透光率50%-60%。所述金线莲为采集自福建省漳州南靖县树海森林的野生金线莲。本发明的显著优点是:采用本发明方法进行，茎段经过诱导培养15 20天可萌发出带白色绒毛生长键壮的新芽；选择合适的培养基再经过50-70天的增殖壮苗培养，扩繁系数高；将高约3 -4cm健壮的无根苗分成单株，接种在生根培养基上诱导生根，I个月后即可生长成完整植株，有2-5cm的根长出，气生根明显，生根率可达99%，在产业化生产过程适时调整添加有机添加物，有机添加物用量50-150 g.Γ1，添加有机添加物的培养基对金线莲苗产品品质、成品苗品像产生直接影响，该方法培养增殖时间短、扩繁系数高、一次性成苗、苗健康、金线莲茎干植株粗大，根系发达，成活率高，叶片颜色深厚有明显的绒布状，叶脉金线明晰，每株重量达4.5-5.5克，具有显著的经济效益，可以提供大面积种植的优良纯化组培苗，解决现有技术中种子微小，胚发育不完全，在自然条件下极难出芽繁殖系数低等问题，应用本发明在实施规模化、产业化生产的关键技术上得到了进一步突破，为金线莲种资源的推广和发展以及将其应用于植物基因工程和遗传转化体系的建立和完善具有重要意义。
图1:芽诱导培养-茎段接种 图2，丛生芽的生长
图3，增殖培养 图4，诱导生根 图5，移栽金线莲
具体实施例方式实施例1
1)取材:外植体材料采集自福建省漳州南靖县树海森林的野生金线莲，
2)培养基的配制:
芽诱导培养基:MS +BA 2.0mg.L:+KT 0.5.mg.L:+NAA 0.5.mg.L 1 + 鹿糖 30g.L:+活性炭Ig.L—1+琼脂6.5g.Γ1 ；
丛芽诱导培养基:MS+BA 0.5mg.L 1 +KT 0.5mg.L 1 +NAA 0.5mg.L 1 + 鹿糖30g.Γ1 + 香蕉汁 100 g.L—1 + 蛋白胨 2.5g.Γ1 + 活性炭 Ig.Γ1 + 琼脂 6.5g.Γ1 ；芽增殖培养基:1/2MS+BA 0.5mg.Γ1 +KT 0.5mg.L、NAA 0.5mg.Γ1 + 香蕉汁 100g.L—1 + 蛋白胨 2.5g.Γ1 + 花宝 I 号 1.5g.Γ1 + 蔗糖 30g.Γ1 + 活性炭 1.5g.Γ1 + 琼脂 6.5g.L-1 ；
生根培养基:1/3MS+ IBA Img.Γ1 +NAA 0.5mg.Γ1 + 马铃薯浆 100 g.Γ1 + 蔗糖30g.Γ1 + 活性炭 2g.Γ1+ 琼脂 6.5g.Γ1 ；
香蕉汁的制备方法为:将香蕉去皮后粉碎成泥状；
马铃薯浆的制备方法为:将马铃薯去皮后粉碎成浆状；
3)材料消毒处理:将采集的野生金线莲用自来水冲洗干净并进行适当的修剪，在距离芽点1-2厘米处剪取茎段，去除多余的叶片，置饱和漂白粉上清液中漂洗15min并用软毛刷轻轻刷洗，冲洗干净后，置于流水中冲滴I小时；双蒸水冲洗3次，在超净工作台内用75%的酒精消毒30s后倒 去酒精，加入0.1%升汞(HgCl2)处理lOmin，将汞液倒入废汞瓶；用无菌水冲4遍后,置工作台备用。4)芽诱导培养:接种的材料放在灭过菌的培养皿上，用手术刀切掉与升汞接触的切口部分0.2-0.4cm，然后将材料切成l-2cm长的茎段分别接种至分别接种于经高温、高压灭菌的诱导培养基中；在直径为10的培养瓶中，加入80-90ML的培养基，接种茎段5-10个；接入培养基10天后部分材料在根茎连接处的潜伏芽萌动膨大，培养15d可观察乳白色主芽形成；这一阶段所用的培养条件:培养室温度为23±2°C，光照时间12h/d，光照强度500-10001X；培育30d后取出进行增殖培养；
6)增殖培养:将经上述诱导培养，所得到的生长良好的丛生芽切开并剪成长1.5-2 cm分别接种在增殖培养基中；接种时要将茎段平放在培养基上经过50d增殖培养，可诱导出大量丛生芽，每丛生芽约有5-10个芽，切割为芽数相等或相近的芽丛进行70d的扩大增殖培养，整个过程的培养室温度为23±2°C，光照时间12h/d，光照强度1500-20001x ；
7)诱导生根:将增殖培养出来的幼苗单株切下，每株带有2-3片叶子，株高l-2cm，转移到生根培养基中；培养30d后，靠近培养基的每个节段上长出1- 2条，呈肉质状的气生根扎入培养基，其上有细密、乳白色的根毛，根较短且不分支，有l_2cm的根长出，生根率可达99 %，当气生根较明显时完成金线莲的植株再生及快速繁殖试管苗的培养生；这一阶段所用的培养条件:培养室温度为23±2°C，光照时间12h/d，光照强度1500-20001x;
8)瓶苗移栽:当瓶苗长至3cm，2-3条根，4-5片叶子，叶长约2_3cm，从靠近培养基的每个节段上长出1- 2条，呈肉 质状的气生根扎入培养基，其上有细密、乳白色的根毛，根较短且不分支，培养30d左右，植株长至IOcm时可进行室外移栽，将试管苗放在自然光下炼苗3天，打开瓶盖炼苗2天，然后从培养瓶中取出，洗去附着在根系的培养基，移入蛭石和腐殖土(1:2)混合的基质中，保湿遮阴，温度控制在15-30°C，湿度应保持在70% -85%之间，避免阳光直射透光率50%-60%。成活率可达99%以上。
权利要求
1.一种有机添加物对金线莲产业化快速繁殖关键技术: 所述方法具体步骤包括: 1)取材:外植体材料为野生金线莲；在春秋季节采摘，采摘后将其用湿布包好带回实验室备用； 2)培养基的配制:芽诱导培养基:MS +BA 0.5-2.0mg.L_1+KT 0.5_2mg.L、NAA 0.5_2mg.Γ1 + 蔗糖30g.Γ1+ 活性炭 l-2g.Γ1+ 琼脂 6.5g.Γ1 ；丛芽诱导培养基:MS+BA 0.5-3mg.Γ1 +KT 0.5_2mg.Γ1 +NAA 0.5_2mg.Γ1 + 蔗糖30g.Γ1 + 香蕉汁 50-150 g.Γ1 + 蛋白胨 0.5-2.5g.Γ1 + 活性炭 l_2g.L-1 + 琼脂6.5g.L 1 ；芽增殖培养基:1/2MS+BA 0.5-3mg.Γ1 +KT 0.5_2mg.L-1+NAA 0.5_2mg.Γ1 + 香蕉汁50- 150 g.L—1 + 蛋白胨 0.5-2.5g.L-1 + 花宝 I 号 0.5-1.5g.L-1 + 蔗糖 30g.L-1 + 活性炭 0.5-1.5g.Γ1 + 琼脂 6.5g.Γ1 ； 生根培养基:1/3MS+ IBA 0.5-lmg.!/1 +NAA 0.5-lmg.!/1 + 马铃薯浆 50- 150 g *L_1+ 蔗糖 30g.Γ1 + 活性炭 0.5-2g.Γ1+ 琼脂 6.5g.Γ1 ； 所述香蕉汁的制备方法为:将香蕉去皮后粉碎成泥状； 所述马铃薯浆的制备方法为:将马铃薯去皮后粉碎成浆状； 3)材料消毒处理:将采集的野生金线莲用自来水冲洗干净，在距离芽点1-2厘米处剪取茎段，去除多余的叶片，置饱和漂白粉上清液中漂洗15min并用软毛刷轻轻刷洗，冲洗干净后，置于流水中冲滴0.5-1小时，再用双蒸水冲洗2-3次，在超净工作台内用75%的酒精消毒30s,加入0.lwt%HgCl2处理5-10min ;再用无菌水冲4_6遍后置工作台备用； 4)芽诱导培养:将消毒后的材料放在灭过菌的培养皿上，用手术刀切掉与升汞接触的切口部分0.2-0.4cm，然后将材料切成l-2cm长的茎段分别接种于经高温、高压灭菌的诱导培养基中；培养条件:培养室温度为23±2°C，光照时间12h/d，光照强度500-10001x，芽诱导培养30天；得到丛生芽； 5)增殖培养:将经步骤4)诱导培养所得到的丛生芽切开并剪成长度为1.5-2cm，分别接种在增殖培养基中；接种时将茎段平放在培养基上，经过50-70d增殖培养，将增殖后的丛生芽切割为芽数为5-10个的茎段进行为期50-70d的扩大增殖培养；整个过程的培养室温度为23±2°C，光照时间12h/d，光照强度1500-20001x ； 6)诱导生根:将经步骤5)增殖培养出来的幼苗单株切下，带有2-3片叶子，株高l-2cm,转移到生根培养基中；生根培养时间为30天，培养室温度为23±2°C，光照时间12h/d，光照强度 1500-20001x ； 7)瓶苗移栽:经步骤6)诱导生根后，当植株长至IOcm时，将试管苗放在自然光下炼苗3-5天后，再打开瓶盖炼苗2-3天，然后从培养瓶中取出，洗去附着在根系的培养基，移入质量比蛭石和腐殖土质量比为1:2的混合基质中，温度控制在15-28°C，湿度保持在70% -85%之间，避免阳光直射，透光率50%-60%。
2.一种有机添加物对金线莲产业化快速繁殖关键技术，其特征在于，所述金线莲为采集自福建省漳州南靖县树海森林的野生金线莲。
全文摘要
本发明提供一种金线莲有机添加物对金线莲产业化快速繁殖关键技术，属于金线莲的大量繁殖和培养技术。本发明选取金线莲顶芽、茎段为材料，在产业化生产过程适时调整添加有机添加物，经过诱导培养，增殖培养，诱导生根后，即可生长成完整植株，生根率可达99%；再经炼苗后，移栽到腐殖土中，成活率可达99%以上。该方法培养增殖时间短、扩繁系数高、一次性成苗、苗健康、金线莲茎干全植株粗大茎粗、根系发达、叶片颜色深厚有明显的绒布状，叶脉金线明晰，成活率高，每株重量达4.5-5.5克，具显著的经济效益。
文档编号A01H4/00GK103190343SQ201310083379
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月16日 优先权日2013年3月16日
发明者何碧珠, 林蔚, 何官榕, 肖春梅 申请人:福建农林大学