一种白刺组培苗的培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种白刺组培苗的培养方法，主要是对白刺种子发芽之后的实生苗，运用适宜的方法进行消毒和在简易的培养基上进行单芽茎段直接生根生长快繁，从而建立起来的一套简易、经济、快速的白刺组培苗培养方法。该方法首先找到适宜幼嫩白刺实生苗消毒的药剂和方法；其次是以单芽茎段直接生根成苗的方式增殖，在短时间内即可稳定获得完整植株，植株叶绿根壮，生长健康；最后培养基用自来水代替蒸馏水配置，白糖代替蔗糖作为碳源加入，同时避免了太多额外植物生长调节剂的使用，这在成本和操作上得到了大大的节约和简化，为白刺的快速繁殖提供了一条新的实用途径，也为后期实现工厂化生产奠定了基础。
【专利说明】一种白刺组培苗的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组培育种领域，具体涉及一种白刺组培苗的培养方法。
【背景技术】
[0002]白刺别名沙樱桃，俗称地枣，根系发达，具有抗盐碱、耐干旱、固沙改土的优良特性，是典型的沙旱生植物，在防风固沙、稳定沙漠、保护沙区绿洲中发挥着重要作用。白刺根寄生的锁阳，为传统名贵的温补药材。近年来，从野生植物资源中寻找新的、潜在的药食同源植物，已成为国内外学者研究的热点，而沙旱生植物白刺则是经过长期的自然筛选而保留下来的优胜者之一，白刺因其顽强的生命力和优良的遗传基因而受到沙区人民的喜爱。白刺果含多种营养成分和丰富的微量元素，有调节血糖、血脂、降血压，显著提高人体免疫力、抗疲劳、抗寒冷、增进睡眠等功效，具有极高的营养和药用价值。以它为优势种和建群种构成的草地还是我国风沙干旱地区家畜重要的天然牧场。然而据调查表明，白刺有雄性不育现象，种间杂交混乱，变异大，种子繁殖品质退化相当严重，同时白刺种子存在高度休眠问题，栽培化程度低，这为人工大面积栽培和良种选育带来了很大的困难。
[0003]采用组织培养快速繁殖技术可能是获得优质、整齐白刺苗木的一条有效途径，这对于合理开发和持续利用白刺资源有积极意义。目前，较多学者何正伦、孙雪新、郭晓红等都进行过白刺的组培研究，所形成的再生体系中消毒剂用的是升汞。升汞对外植体的伤害较大，时间稍有不当就会造成消毒失败，或者对外植体致死现象严重，这给后期工作造成困难。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种适宜白刺组培苗的经济、简便的培养方法。
[0005]为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:一种白刺组培苗的培养方法，包括以下步骤:
1)外植体消毒:将白刺种子发芽得到的实生苗，剪取幼嫩茎段，消毒后用无菌水冲洗4-5次，得到消毒好的白刺茎段；
2)将步骤I)中消毒好的白刺茎段接种于MS培养基上，放于培养室培养，待其生根并拔节长高得到白刺无菌苗；
3)茎段快繁:将步骤2)得到的长高至4-5cm的白刺无菌苗切取带芽茎段，接于生根培养基上，放于培养室培养，进行生根诱导；生根诱导过程为:将带有顶芽的白刺无菌苗茎段直接接于MS培养基上进行生根培养，其余白刺无菌苗茎段接于1/2MS培养基+0.5mg/L吲哚乙酸上进行生根培养；培养室培养条件为温度25±1°C，光照强度2000Lx，光照16h/d。
[0006]进一步的，上述的一种白刺组培苗的培养方法，所述步骤I)中，消毒过程为用75%酒精消毒30s，再用10%次氯酸钠消毒15min-18min。
[0007]进一步的，上述的一种白刺组培苗的培养方法，所述步骤2)和步骤3)中，培养基MS和1/2MS，碳源使用的是白糖，配置培养基所用均为常用自来水。[0008]进一步的，上述的一种白刺组培苗的培养方法，所用白刺为野生白刺。
[0009]进一步的，上述的一种白刺组培苗的培养方法，所述MS培养基和1/2MS培养基的配置组成为:
MS培养基:MS母液成分+30g白糖+0.1g肌醇+4.5g琼脂粉，自来水定容配置；
1/2MS培养基:MS母液成分剂量减半+30g白糖+0.1肌醇+4.5g琼脂粉，自来水定容配置；
所述MS母液的组成成分以质量浓度计为:
大量元素:NH4N031650mg/L, KNO3 1900 mg/L，MgSO4.7H20 370 mg/L, KH2PO4 170 mg/
L ；
微量元素:KI 0.83 mg/L, H3BO3 6.2 mg/L, MnSO4.4Η20 22.3 mg/L, ZnSO4.7Η20 8.6mg/L, Na2MnO4.2H20 0.25 mg/L, CuSO4.5H20 0.025 mg/L, CoCl2.6H20 0.025 mg/L ；维生素:烟酸10 mg/L,盐酸批P多醇I mg/L,盐酸硫胺素I mg/L ；
钙盐=CaCl2.2H20 440 mg/L ；
铁盐:FeS04.7H20 27.8 mg/L, Na2-EDTA.2H20 37.3 mg/L。
[0010]外植体培养是再生的第一步，无菌苗的生长状态直接关系到后期工作的开展。因此，本方法反复进行了不同消毒剂、不同消毒时间对外植体消毒的影响试验，以期解决0.1%升汞消毒时，消毒时间短导致外植体消毒不彻底，或者消毒时间稍长，外植体就褐化死亡，抑或消毒率太低等问题。本方法最后确定采用的消毒剂10%次氯酸钠，性质比较温和，对外植体伤害力不大，同时消毒时间确定在15-18min，不但外植体依然能保持健康绿色和活力，消毒率也达到90%-100%，这大大节省了外植体取材工作，也为后期试验提供充足无菌苗做了可靠保障。
[0011]本发明提供的白刺单芽茎段直接在培养基上生根成苗，逐节剪取作为增生的组培途径，整个过程不经历愈伤组织的诱导和分化阶段，这一增殖途径对保持白刺组培苗遗传性状稳定十分有利。同时提供的培养基用自来水配置和白糖代替蔗糖作为碳源加入这一方法，不但没有影响到组培苗的正常生根生长，而且在成本上也有所降低。
[0012]本发明的有益效果为:本发明提供的一种白刺组培苗的培养方法，经济、简便，为白刺的快速繁殖提供了一条切实可行的新途径。该方法首先研究出适宜于幼嫩白刺外植体消毒的方案，提出适宜的消毒剂以及消毒时间；其次试验出在短时间内即可稳定获得完整植株的一系列措施，整个过程以单芽茎段直接生根成苗的方式增殖；同时也提出了所用培养基是用自来水代替蒸馏水配置，白糖代替蔗糖作为碳源加入，克服了现有技术中太多植物生长调节剂的使用，获得了一个适于白刺组培苗简便培养的成熟方法，在成本和操作上得到了大大的节约和简化，对白刺生物育种和工厂化生产具有实践应用价值。
【具体实施方式】
[0013]实施例1:
(1)供试材料:野生白刺；
(2)外植体消毒:将种子发芽得到的实生苗，剪取幼嫩茎段，用75%酒精消毒30s，随后分别用两种消毒剂对茎段进行不同时间的处理比较，0.1%氯化汞处理4、6、8、IOmin ;10%的次氯酸钠处理7、10、12、15、18min，无菌水冲洗4_5次，接于MS培养基(自来水配置)上，每处理10瓶，每瓶3株外植体，放于温度25± 1°C，光照强度2000LX，光照16h/d的条件下培养，几天后统计消毒情况；
(3)茎段诱导:待消毒好的白刺茎段在MS培养基(自来水配置)上生根并且拔节长高至4-5cm，即可切取单芽茎段，分两种方式进行培养:一种是接于分化培养基上进行增殖诱导，分化培养基设置两种:MS+0.5mg/LBA+l.0mg/LNAA+2.0mg/LGA 和 MS+2.0mg/LBA+0.5mg/LIBA ;一种是直接进行生根诱导，每处理10瓶，每瓶3株外植体，放于温度25± 1°C，光照强度2000Lx，光照16h/d的条件下培养，统计各自结果；
(4)生根诱导:切取的单芽茎段，接于生根培养基上，放于培养室培养，进行生根诱导。生根诱导培养基设置两种:MS培养基(自来水配置)和1/2MS+0.5mg/LIBA培养基。每处理10瓶，每瓶3株外植体，放于温度25± 1°C，光照强度2000LX，光照16h/d的条件下培养，统计生根情况；
结果表明，0.1%升汞作为消毒剂，其杀伤力极大，在处理8min和IOmin时，外植体全部褐化死亡；在处理4min时，外植体受伤害虽轻，但是渐渐菌丝就会长出，消毒不彻底；在处理6min时，外植体的状态表现不同，有褐化死亡的，有消毒不彻底的，也有消毒干净的，消毒率仅13.33%，且发现茎段后期生长缓慢或停滞。10%次氯酸钠作为消毒剂，其性质比较温和，在各处理当中外植体均未发现褐化死亡现象。在处理7min时，杂菌会有很多，消毒不彻底；在处理IOmin和12min时，消毒率可达60%以上，在处理15min和18min时，消毒率可达90%到100%，且外植体均健康，且在适宜培养基上即能生根生长。
[0014]从茎段分化和生根诱导的处理结果表明，采用的单芽茎段增殖诱导途径，在选用的已经公开的野生白刺分化增殖培养基上，未见芽点分化增殖，仅略微的膨大，随后叶片黄化死亡。这可能是白刺基因型依赖的问题，这一途径可以再进行激素调整继续研究。采用的单芽茎段直接生根诱导途径，在MS培养基(自来水配置)中仅有带顶芽的茎段可以生根，在1/2MS+0.5mg/LIBA培养基中幼嫩带芽茎段生根良好，老化的带芽茎段生根较困难。后面将1/2MS+0.5mg/LIBA培养基也改用自来水配置，对生根诱导与之前比较没有差别。
[0015]最后应说明的是:以上所述仅为本发`明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种白刺组培苗的培养方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)外植体消毒:将白刺种子发芽得到的实生苗，剪取幼嫩茎段，消毒后用无菌水冲洗4-5次，得到消毒好的白刺茎段； 2)将步骤I)中消毒好的白刺茎段接种于MS培养基上，放于培养室培养，待其生根并拔节长高得到白刺无菌无菌苗； 3)茎段快繁:将步骤2)得到的长高至4-5cm的白刺无菌苗切取带芽茎段，接于生根培养基上，放于培养室培养，进行生根诱导；生根诱导过程为:将带有顶芽的白刺无菌苗茎段直接接于MS培养基上进行生根培养，其余白刺无菌苗茎段接于1/2MS培养基+0.5mg/L吲哚乙酸上进行生根培养；培养室培养条件为温度25±1°C，光照强度2000Lx，光照16h/d。
2.根据权利要求1所述的一种白刺组培苗的培养方法，其特征在于:所述步骤I)中，消毒过程为用75%酒精消毒30s，再用10%次氯酸钠消毒15min-18min。
3.根据权利要求1所述的一种白刺组培苗的培养方法，其特征在于:所述步骤2)和步骤3)中，培养基MS和1/2MS，碳源使用的是白糖，配置培养基所用均为常用自来水。
4.根据权利要求1-3任一所述的一种白刺组培苗的培养方法，其特征在于:所用白刺为野生白刺。
5.根据权利要求4所述的一种白刺组培苗的培养方法，其特征在于:所述MS培养基和1/2MS培养基的配置组成为: MS培养基:MS母液 成分+30g白糖+0.1g肌醇+4.5g琼脂粉，自来水定容配置； 1/2MS培养基:MS母液成分剂量减半+30g白糖+0.1肌醇+4.5g琼脂粉，自来水定容配置； 所述MS母液的组成成分以质量浓度计为:
大量元素:NH4N031650mg/L, KNO3 1900 mg/L，MgSO4.7H20 370 mg/L, KH2PO4 170 mg/L ；
微量元素:KI 0.83 mg/L, H3BO3 6.2 mg/L, MnSO4.4Η20 22.3 mg/L, ZnSO4.7Η20 8.6mg/L, Na2MnO4.2H20 0.25 mg/L, CuSO4.5H20 0.025 mg/L, CoCl2.6H20 0.025 mg/L ； 维生素:烟酸10 mg/L,盐酸批P多醇I mg/L,盐酸硫胺素I mg/L ；
钙盐=CaCl2.2H20 440 mg/L ；
铁盐:FeS04.7H20 27.8 mg/L, Na2-EDTA.2H20 37.3 mg/L。
【文档编号】A01H4/00GK103651143SQ201310697008
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】张艳萍, 赵玮, 罗俊杰, 陈玉梁, 罗万银, 董治宝 申请人:甘肃省农业科学院生物技术研究所