一种马精子低温保存稀释液的制作方法
【专利摘要】本发明提供的一种马精子低温保存稀释液，无菌操作，将糖盐溶液与脱脂奶1:1充分混匀，用1mol/L盐酸调整溶液pH值至6.9，最后用25%的葡萄糖溶液或双蒸水调整溶液渗透压至300mOsm/L，即制得;其中将碳酸氢钠0.336-0.374g、羟乙基哌嗪乙磺酸4.766-4.975g、葡萄糖16.213-16.543g、乳糖45.399-45.423g、氯化钠1.258-1.543g、氯化钾0.348-0.375g、磷酸二氢钾0.068-0.086g、硫酸镁0.120-0.145g、氯化钙0.133-0.154g、磷酸氢钠0.113-0.124g、头孢曲松钠2-2.5g、两性霉素B500-600ug依次溶解于800ml双蒸水中，再加双蒸水定容至1000ml，在超净台中用0.22um滤器过滤糖盐溶液，制得无菌糖盐溶液。
【专利说明】一种马精子低温保存稀释液
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物精子低温保存液的制作，与常规方法比，该方法制备的精稀释液有效延长了马精子体外存活的时间。
【背景技术】
[0002]我国是世界上马匹数量最多的国家，存栏量达600多万匹，但马产业发展则相对滞后，然而在产业发展之初，如何将我国马匹的数量优势转变为产业优势是我国马业工作者面对的重要课题。引进外血大规模的改良我国马匹生产性能是行之有效的方法，但改良面临两个主要问题:第一，受马精液在体外保存时间所限，人工授精只能局限于种公马饲养所在地，无法实现大规模、长距离、跨区域的品种改良，致使本已稀缺的种公马资源不能得到有效利用。第二，由于母马生理特殊性，人工授精过程中一个发情周期内需要间隔24小时左右输2-3次精，而一匹公马的采精频率一般为72小时，受精液体外保存技术水平所限，生产中均采用多匹公马精液输入一个母马体内，致使改良后代系谱混乱。在国外马业发达国家，由于已开发出成熟的鲜精保存稀释液，实现了鲜精全国范围的定时配送和随时供应，不仅种公马利用效率高而且系谱准确，但是从国外进口马精液稀释液价格昂贵，成功受孕一匹马在稀释液上需投入成本100元左右，大规模使用成本很高，因此开发自主产权、低成本的马专用精子低温保存稀释液具有很好的应用前景。
[0003]精液稀释液为精子提供一个适合的营养及酸碱度环境，使其能较长时间在体外存活并保持受精能力。精液稀释液中主要包括能量物质、维持渗透压所需的盐类，维持稳定酸碱度所需的电解质及抗生素类物质。目前报道较多的稀释液有INRA82、Kenney、EZ-Mixin 及三种商品 化的稀释液 INRA96 (IMV, Franch)> Gent (AbfullundLabortechnik GmbH&C0., Tiefenbach, Germany)>M1 (Abfullund Labortechnik GmbH&C0.Tiefenbach, Germany)。其中以法国农业科学院发明的INRA82和INRA96(已被法国IMV卡苏公司商品化)保存效果最好，应用最广泛。
[0004]专利文献检索披露:I)青岛德瑞骏发生物科技有限公司申请的《马属动物精液稀释基础液及其配制方法和使用方法(CN102578079A)》。该专利稀释液的构成和各组分含量与法国已公开马精液稀释液IRNA82基本相同。2)塔里木大学申请的《马属动物精液保存稀释液及其生产方法和使用方法(CN101647427)》由双蒸水与葡萄糖、甘氨酸、青霉素、链霉素、卵黄构成。本发明在这之前，申请的《一种马精子冷冻保存液及其冷冻方法(CN103120155A)))是我们实验室多年研究马精子冷冻稀释液的成果之一，该专利稀释液仅仅适用于马精子冷冻。
[0005]本发明从2006年开始进行马精子低温保存稀释液的研究工作，曾先后尝试了应用脱脂马奶、Kenney、EZ-Mixin, INRA82等稀释液配方进行马精子体外保存实验，体外保存时间和保存效果得到了不断提高，但均未能达到理想效果。2009年我们曾用100mL双蒸水，6.5g葡萄糖、0.5g甘氨酸，20%蛋黄、加青霉素和链霉素的稀释液对马精子进行过冷冻和低温保存实验，当时结果表明“葡萄糖+甘氨酸+蛋黄稀释液”是一种马精子冷冻液的替代方案，但并不适合用于马精子的低温保存。受动物精子可以在母畜子宫和输卵管内长时间存活并保持高效的授精能力的启发，结合之前实验结论，反复模拟雌性动物输卵管生理环境配制精子低温保存液，取得了良好的实验结果，为进一步确证本稀释液的保存效果，2013年从法国卡苏公司购进了一批INRA96马鲜精保存稀释液，进行对比试验，结果显示，本稀释液效果好于INRA96稀释液的保存效果，具有重要的应用价值。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于:提供的马精子低温保存液与常规方法比，该配方更加科学合理，其操作方法简单、稳定，技术效果尤其显著。
[0007]本发明的目的是这样实现的:一种马精子低温保存稀释液，分步实施:
[0008]脱脂牛奶的制备:
[0009]将双蒸水与食用菜籽油1:1混合，置于70°C、水浴3min，剧烈摇动5min，常温静止至水、油分离，弃水，如此再重复2次，在4500rpm条件下，离心5min，收集油；将收集的油与新鲜牛奶1:6混合，摇匀后置于70°C、水浴5min,剧烈摇动5min,在4500rpm条件下,离心20min，回收中层奶至玻璃瓶中，密封后放入高压灭菌锅中，90°C灭菌30min，备用；
[0010]糖盐溶液的配制:
[0011]将碳酸氢钠0.336-0.374g、羟乙基哌嗪乙磺酸4.766-4.975g、葡萄糖16.213-16.543g、乳糖 45.399-45.423g、氯化钠 1.258-1.543g、氯化钾 0.348-0.375g、磷酸二氢钾0.068-0.086g、硫酸镁0.120-0.145g、氯化钙0.133-0.154g、磷酸氢钠0.113-0.124g、头孢曲松钠2-2.5g、两性霉素B500_600ug依次溶解于800ml双蒸水中，再用1000ml容量瓶加双蒸水定容至1000ml，在严格灭菌的超净工作台中用0.22um滤器过滤糖盐溶液，制得无菌糖盐溶液。
[0012]稀释液的配置:
[0013]无菌操作，将糖盐溶液与脱脂奶1:1充分混匀，用lmol/L盐酸调整溶液pH值至6.9，最后用25%的葡萄糖溶液或双蒸水调整溶液渗透压至300m0sm/L，制得马精子低温保存稀释液。
[0014]本发明的技术原理与作用:受动物精子可以在母畜子宫和输卵管内长时间存活并保持高效的受精能力的启发，我们反复模拟雌性动物输卵管生理环境配制了该稀释液，该液为精子提供一个适合的营养及酸碱度环境，使其在体外获得一个最佳的生存条件，利用生物样本低温环境下酶系低活性，消耗能量小的特点最大限度的延长了精子的体外存活。
[0015]本方法深层次挖掘各类化合物组合的生化特性，高效模拟雌性动物输卵管生理特性，为马精子体外存活创造了一个最佳的生理环境，这些技术改进和创新对于马精子低温保存效果起着决定性作用，实验验证本方法明显优于现已报道马精子低温方法，并略高于国外进口产品低温保存效果，应用该稀释液马精子在4°C保存168-196h后，活力仍可达到0.3以上，极大的提高了马低温精液人工授精的效率，彰显技术进步。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]下面结合附图对发明作进一步的描述。
[0017]附图1为马精子保存后活力(motile)变化曲线图；[0018]如图所示:在三种不同行稀释液中保存0-168小时后活力(motile)的变化。
[0019]附图2为马精子保存后直线前进精子百分率(progressive motile)变化曲线图；
[0020]如图所示:在三种不同行稀释液中保存0-168小时后直线前进精子百分率(progressive motile)的变化。
[0021]附图3为马精子保存后精子运动速度(Path Velocity)变化曲线图；
[0022]如图所示:在三种不同行稀释液中保存0-168小时后快速运动精子比例(RapidMotile)变化。
[0023]附图4为马精子保存后快速运动精子比例(Rapid Motile)变化曲线图；
[0024]如图所示:在三种不同行稀释液中保存0-168小时后快速运动精子比例(RapidMotile)变化。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例对发明作进一步的描述。
[0026]实施例
[0027]一、稀释液的配制
[0028]本稀释液主要由 脱脂牛奶和糖盐溶液构成。
[0029]1、脱脂牛奶的制备
[0030]用双蒸水与食用菜籽油1:1混合，70°C水浴3min，剧烈摇动5min，常温静止至水、油分离,去除水,如此再重复2次；4500转/分钟，离心5min，收集油；将收集油与新鲜牛奶
I:6混合，摇匀后置于70°C、水浴5min，剧烈摇动5min，4500转/分钟，离心20min，回收中层奶至玻璃瓶中，密封后放入高压灭菌锅中90°C、灭菌30min，备用；
[0031]2、糖盐溶液的配制
[0032]配制1:取碳酸氢钠0.336g、轻乙基哌嗪乙磺酸4.766g、葡萄糖16.213g、乳糖45.399g、氯化钠1.258g、氯化钾0.348g、磷酸二氢钾0.068g、硫酸镁0.120g、氯化钙0.133g、磷酸氢钠0.113g、头孢曲松钠2g、两性霉素B500ug依次溶解于800ml双蒸水中，再用1000ml容量瓶加双蒸水定容至1000ml，在严格灭菌的超净工作台中用0.22um滤器过滤糖盐溶液，制得无菌糖盐溶液；
[0033]或配制2:取碳酸氢钠0.374g、轻乙基哌嗪乙磺酸4.975g、葡萄糖16.543g、乳糖45.423g、氯化钠1.543g、氯化钾0.375g、磷酸二氢钾0.086g、硫酸镁0.145g、氯化钙
0.154g、磷酸氢钠0.124g、头孢曲松钠2.5g、两性霉素B600ug依次溶解于800ml双蒸水中，再用1000ml容量瓶加双蒸水定容至1000ml，在严格灭菌的超净工作台中用0.22um滤器过滤糖盐溶液，制得无菌糖盐溶液；
[0034]或配制3:取碳酸氢钠0.350g、轻乙基哌嗪乙磺酸4.800g、葡萄糖16.300g、乳糖45.410g、氯化钠1.300g、氯化钾0.360g、磷酸二氢钾0.070g、硫酸镁0.130g、氯化钙
0.140g、磷酸氢钠0.118g、头孢曲松钠2.3g、两性霉素B550ug依次溶解于800ml双蒸水中，再用1000ml容量瓶加双蒸水定容至1000ml，在严格灭菌的超净工作台中用0.22um滤器过滤糖盐溶液，制得无菌糖盐溶液。
[0035]3、稀释液的配置:
[0036]无菌操作，将糖盐溶液与脱脂奶1:1充分混匀，用lmol/L盐酸调整溶液pH值至6.9，最后用25%的葡萄糖溶液或双蒸水调整溶液渗透压至300m0sm/L，制得马精子低温保存稀释液。
[0037]二、稀释液的使用方法
[0038]采精前20min，调整水浴锅水温至37°C，放入稀释液及待装精液的离心管预热。
[0039]收集到精液后与预热稀释液1:1混合，待温度降至22°C后，置于离心机中离心(750g离心力)20min,收集下层浓密精子，而后根据需要用稀释液进行稀释(精子最终浓度不得高于8亿/ml)，置于4°C恒温冰箱保存。
[0040]三、药品及设备来源
[0041]本稀释液所用药品中除脱脂牛奶为自制，两性霉素购自上海生工生物有限责任公司，头孢曲松钠购自哈尔滨制药六厂，其余药品均购自sigma公司。
[0042]配置稀释液所用到的仪器设备:SZ_93型号自动双蒸水仪购自上海宇辉生化仪器有限公司，HERAEUS MULTIFUGEXR型离心机购自Thermo scientific公司、pH试纸购自杭州富阳特种纸业有限公司，LGJ-10台式低温干燥机购自郑州宏朗仪器设备有限公司。BS-100冰点渗透压测定仪购自上海复旦依达医疗器械有限公司
[0043]本方法精子采集的过程遵循自然规律，用人工假阴道诱导雄性动物射精，不会对动物造成任何伤害，这也是世界范围普遍采取的方式。
[0044]本发明的技术效果验证: [0045]本稀释液与进口液IRNA96 (图中简称96液)相比，4°C保存0_168小时后精子活力(Motile)、直线前进精子比例(Progressive Motile)、精子运动速率(path velocity)、快速运动精子比例(Rapid Motile)四个精子质量参数两中稀释液间无差异。
[0046]从生产成本来看，本稀释液每100mL成本约为10元人民币，而相同体积INRA96市场售价为105元，相比之下具有明显的价格优势，具有良好的应用前景。
[0047]本稀释液与INRA82稀释液(CN102578079A专利类似液)相比，4°C保存0-168小时后精子活力(Motile)、直线前进精子比例(Progressive Motile)、精子运动速率(pathvelocity)、快速运动精子比例(Rapid Motile)四个精子质量参数,本稀释液保存48小时后均显著高于INRA82稀释液，这一数据充分展现了本稀释液的技术优势。
【权利要求】
1.一种马精子低温保存稀释液，其特征在于:分步实施: 脱脂牛奶的制备: 将双蒸水与食用菜籽油1:1混合，置于70°C、水浴3min，剧烈摇动5min，常温静止至水、油分离，弃水，如此再重复2次，在4500rpm条件下，离心5min，收集油；将收集的油与新鲜牛奶1:6混合,摇匀后置于70°C、水浴5min,剧烈摇动5min,在4500rpm条件下,离心20min，回收中层奶至玻璃瓶中，密封后放入高压灭菌锅中，90°C灭菌30min，备用； 糖盐溶液的配制: 将碳酸氢钠0.336-0.374g、羟乙基哌嗪乙磺酸4.766-4.975g、葡萄糖16.213-16.543g、乳糖 45.399-45.423g、氯化钠 1.258-1.543g、氯化钾 0.348-0.375g、磷酸二氢钾0.068-0.086g、硫酸镁0.120-0.145g、氯化钙0.133-0.154g、磷酸氢钠0.113-0.124g、头孢曲松钠2-2.5g、两性霉素B 500-600 Ug依次溶解于800ml双蒸水中，再用1000ml容量瓶加双蒸水定容至1000ml，在严格灭菌的超净工作台中用0.22um滤器过滤糖盐溶液，制得无菌糖盐溶液； 稀释液的配置: 无菌操作，将糖盐溶液与脱脂奶1:1充分混匀，用lmol/L盐酸调整溶液pH值至6.9，最后用25%的葡萄糖溶液或双蒸水调整溶液渗透压至300 mOsm/L，制得马精子低温保存稀释液。
2.依据权利要求1所·述的稀释液，其特征在于:稀释液选用的原料均为市售产品。
【文档编号】A01N1/02GK103843758SQ201410057055
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年2月19日 优先权日:2014年2月19日
【发明者】毋状元, 郑新宝, 霍飞, 陈静波, 董红, 张国庭, 罗永明, 李海, 徐文慧, 于伟浩 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院畜牧研究所