一种柳枝稷突变体的创制方法
【专利摘要】本发明公开了一种柳枝稷突变体的创制方法，用组织培养的方式培养出大量柳枝稷丛生芽后，剥离出单个丛生芽，在自然条件下炼苗后切除上部叶鞘，用甲基磺酸乙酯(EMS)溶液对剩余的基部以上1.5～2cm部分进行浸泡处理3h，完成后直接将切除叶鞘的丛生芽移栽到培养基质中进行培养，生根完成后移栽至温室或者大田，根据柳枝稷表型筛选出突变体。该方法能规模化处理突变的原始受体材料，增加了变异株的基数，同时能获得与原始受体材料仅目标性状差异的近等基因系材料，而且诱变过程简单易行，处理成本相对比较低廉，能有效缩短育种周期，适合为柳枝稷现代生物技术研究创制新材料。
【专利说明】一种柳枝稷突变体的创制方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物育种【技术领域】，涉及一种柳枝稷突变体的创制方法。
【背景技术】
[0002] 柳枝稷（英文名Switchgrass，拉丁名Panicum virgatum Linn)为禾本科多年生 草本C4植物，起源于北美大草原，植株高大，栽培简单，抗逆性强，具有很高的年生物量产 量。柳枝稷最初主要被用来作为饲料作物以及园林植物，同时也被用于水土流失防治等方 面，均表现出了优良的利用前景。20世纪末，美国率先将其选为模式生物能源植物，此后，各 国均加大了对柳枝稷的开发研究。而采用现代生物技术对柳枝稷进行遗传改良和开发利用 已成为目前国内外在生物能源领域的研究热点之一。
[0003] 创制和利用优良突变体是现代生物技术研究的重要方面。作为一种模式生物能源 植物，柳枝稷具有耐旱、耐贫瘠、抗病虫害、生物产量高等很多优良性状。然而柳枝稷又是一 种异花授粉植物，具有较强的自交不亲和性，通过有性繁殖获得的后代通常具有不同的基 因型，且性状分离周期长，因此柳枝稷在现代生物技术特别是突变体的利用研究方面存在 较大障碍。探索在初始基因型一致情况下创制不同突变体将可能对推动柳枝稷现代生物技 术研究具有重大意义。
[0004] 化学诱变剂EMS(甲基磺酸乙酯）在突变体创制中应用十分广泛，当前也被认为是 最有效的化学诱变剂，已经利用EMS成功创制出多种植物的突变体。目前已有研究者利用 EMS对柳枝稷种子进行化学诱变，但因柳枝稷种子间为异质基因型，使其应用前景受到较大 限制。
[0005] 与其他植物类似，柳枝稷通过无性繁殖方法可以获得与原始材料初始基因型一致 的植株或材料（即无性系），而无性系不同植株和材料间具有与初始基因型一致的特点 (即为同质基因型）。但迄今在柳枝稷研究方面尚未有过利用无性系作为诱变材料的报道。
[0006] 中国专利文献CN101081005A(申请号200710018261. 6)公开了一种柳枝稷的体外 繁殖即无性系创制方法。具体为在柳枝稷生长发育至有5?6个节时，切取中间3?4个 茎节，在MBP培养基上人工诱导丛生芽，对从生芽生长点人工重复切除处4?5次至块茎直 径为0. 5cm左右，在新的MBP培养基上可以获得大规模丛生芽。
【发明内容】
[0007] 本发明解决的问题在于提供一种柳枝稷突变体的创制方法，利用柳枝稷进行无性 系培育，在初始基因型一致的基础上获得柳枝稷的不同突变体植株，推进柳枝稷的现代生 物技术育种进程。
[0008] 本发明是通过以下技术方案来实现：
[0009] -种柳枝稷突变体的创制方法，包括以下操作：
[0010] 1)大田情况下，当柳枝稷植株生长发育达到5?6个节、幼穗开始形成时，取长度 1?1. 5cm的穗下茎节组织；对穗下茎节组织消毒处理后冲洗，然后接种至MBP培养基，扩 充丛生芽群体；
[0011] 2)挑选生长健壮的丛生芽，在不损伤基部的生长点的情况下剥离丛生芽，获取待 诱变的丛生芽群体；
[0012] 将丛生芽群体在25°C室温条件下炼苗24?36h，然后切除上部叶鞘，预留基部以 上1. 5?2cm,并喷水保持其湿润；
[0013] 3)以磷酸缓冲液配置的质量浓度为0.5?1.0%的甲基磺酸乙酯溶液作为诱变 液，将诱变液与待诱变的丛生芽群体充分混合后，在真空环境下静置1?3h进行诱变；
[0014] 4)将诱变后的丛生芽群体用水充分冲洗后，插入培养基质中栽植，栽植深度为 0. 5?lcm，栽植完成后温室培养；
[0015] 5)温室培养三个月后，将长成的单株移栽至花盆或者大田中；
[0016] 6)在大田环境中，以初始基因型性状作为对照，根据诱变后植株表型性状和生理 性状变化，鉴定出柳枝稷突变体。
[0017] 所述的茎节组织包含茎节上下各0. 5?0. 7cm的长度。
[0018] 所述对茎节组织消毒处理为：
[0019] 采用70%的酒精对对茎节组织进行表面消毒1?3min，再用质量浓度20%的次氯 酸钠溶液灭菌5?8min，无菌水冲洗3-4次。
[0020] 所述的MBP培养基，其成分为：MS基本培养基4. 43g/L，蔗糖30g/L，6-BA(6-苄基 腺嘌呤）3mg/L，琼脂 7. 5g/L，pH = 5. 8。
[0021] 所述在挑选丛生芽时，挑选出长度3. 5cm以上的丛生芽作为待诱变的材料，每次 诱变的丛生芽群体总数为500?1000个。
[0022] 所述的诱变液是使用pH = 6. 98的磷酸缓冲液进行配制的。
[0023] 所述将诱变液与待诱变的丛生芽群体充分混合后放置于容器中，然后放入真空泵 中，抽10?20min真空后静置浸泡3h。
[0024] 所述的栽培基质为腐殖土与河沙按照1?1. 2:1的质量比混合，栽植前一天在基 质中加水，直到吸水饱和。
[0025] 所述的栽培基质中栽植密度为800?1000个/m2。
[0026] 所述的温室培养，其培养温度为20?25°C，每天光照14h，光强1500?20001ux， 每天浇水1?2次，保持基质表面湿润。
[0027] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0028] 1、诱变过程简单易行
[0029] 传统的无性系诱变主要是基于愈伤组织，而对愈伤组织的处理过程必须在无菌条 件下进行，对EMS溶液的灭菌要求严格，而且后续组织培养过程涉及到在不同的培养基上 进行诱导生根等过程，往往会导致材料污染、白化等常见问题。而本发明在真空环境下、利 用EMS诱变结束后采用直接种植的方式，免去了愈伤组织培养再生等繁琐步骤，在经过温 室培养后可以直接移栽到大田进行检测，缩短了实验周期。
[0030] 本发明巧妙的实现了利用EMS诱变与初始基因型一致的柳枝稷无性系植株，创制 出在同质基因型基础上的不同柳枝稷突变体植株，推进柳枝稷的现代生物技术育种进程。
[0031] 2、成活率高，栽植容易
[0032] 柳枝稷单个丛生芽切除上部叶鞘后在栽植条件控制良好的情况下成活率相对比 较高，而且在诱变结束后不需要在培养基中诱导生根，可直接插入培养基质中栽培，容易成 活。
[0033] 3、诱变群体基数大，利于实验结果分析
[0034] 本发明通过组织培养可以在短时间内得到大量的基因型一致的丛生芽，有效的解 决了材料不足的问题，而且利用单个丛生芽做诱变群体基数大，有利于对诱变结果进行统 计学分析。
[0035] 4、成本低廉
[0036] 柳枝稷丛生芽切除叶鞘后基部仅仅剩余1. 5?2cm，选择合适的容器使用少量的 EMS溶液就可以对大量的材料进行处理，有效地节约了药品，降低了诱变成本。
[0037] 5、可获得在同质基因型基础上的不同突变体类型，利于现代生物技术研究应用
[0038] 本发明在同质基因型基础上获得的不同突变体类型，与初始基因型比较，类似不 同突变性状的近等基因系材料，为柳枝稷现代生物技术特别是分子生物学研究提供基础材 料，对其他异花授粉植物研究也具有借鉴价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0039] 图1为未经EMS处理的对照柳枝稷单株；
[0040] 图2为经过EMS处理的寡分蘖柳枝稷突变体单株。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而 不是限定。
[0042] 本发明以柳枝稷的丛生芽为诱变材料，在初始基因型一致的情况下创制其突变体 植株。具体按照如下步骤进行：
[0043] 步骤一：取材并繁殖扩充丛生芽群体
[0044] a.大田情况下，当柳枝稷植株生长发育达到5- 6个节时幼穗开始形成。取 1-1. 5cm左右穗下莖节组织，每个莖节组织包含莖节上下各0. 5?0. 7cm的长度。
[0045] b.采用70 %的酒精对对茎节组织进行表面消毒lmin，再用20 %的次氯酸钠溶液 灭菌5?8min，无菌水冲洗3-4次，接种至MBP培养基，其中MBP培养基成分为：MS基本培 养基（Murashige and Skoog Basal Medium，美国 Sigma 公司生产）4.43g/L，鹿糖 30g/L， 6-BA (6-苄基腺嘌呤）3mg/L，琼脂 7. 5g/L，pH = 5· 8
[0046] c.丛生芽群体的扩充按照中国专利文献CN101081005A(申请号200710018261. 6) 所述的技术方案进行。
[0047] 步骤二：诱变前期处理
[0048] a.挑选生长健壮的丛生芽作为诱变材料，沿着丛生芽块基部用镊子小心剥离出每 个丛生芽（注意不能损伤丛生芽基部的生长点），挑选出3. 5cm以上的丛生芽作为诱变材 料。每次诱变的丛生芽群体总数为500?1000个。
[0049] b.将丛生芽群体在自然条件下炼苗或者在25°C室温条件下炼苗24?36h后切除 上部叶鞘，预留基部以上1. 5?2cm，喷适量的水保持材料湿润。
[0050] c.预先配制好栽培基质（腐殖土 ：河沙=1:1)，提前一天在基质中加水，直到吸水 饱和。
[0051] 步骤三：诱变处理，
[0052] a.用 pH = 6. 98 的磷酸缓冲液（Na2HP04:KH2P04 = 3:2)配制浓度为 0· 5% 的 EMS 溶液。
[0053] b.选择合适的容器（口径小高度大）进行诱变处理，将EMS溶液与切除叶鞘后 的丛生芽材料充分混合后放入真空泵中，抽20min真空后静置浸泡3h(真空泵压力值为 0· 08 ?0· IMPa)。
[0054] 步骤四：诱变后栽植
[0055] a.将诱变处理后的材料用纱布包裹后固定，放入流水中冲洗，并调节水流大小避 免材料被冲走，冲洗40?60min后取出材料。
[0056] b.种植材料前预先在培养盆中规划好种植密度，将材料直接插入培养基质中栽 植，栽植深度为0. 5?lcm，种植完成后将材料转移到温度20°C，光照14h，光强1500? 20001ux的温室培养，每天浇水1?2次，保持基质表面湿润。
[0057] 步骤五：移栽
[0058] 三个月后，将长成的单株移栽至直径25cm的花盆或者大田中。
[0059] 步骤六：突变体鉴定
[0060] 与初始基因型进行比较，根据诱变后植株表型性状和生理性状变化，鉴定出目标 突变体。
[0061] 下面是给出的具体实施实例，以柳枝稷品种Alamo为例。
[0062] 步骤一：取材并繁殖扩充丛生芽群体
[0063] a.大田情况下，当柳枝稷植株生长发育达到5- 6个节时幼穗开始形成。取 1-1. 5cm左右穗下莖节组织，每个莖节组织包含莖节上下各0. 5?0. 7cm的长度。
[0064] b.采用70 %的酒精对对茎节组织进行表面消毒lmin，再用20 %的次氯酸钠溶液 灭菌5?8min，无菌水冲洗3-4次，接种至MBP培养基，其中MBP培养基成分为：MS基本培 养基（Murashige and Skoog Basal Medium，美国 Sigma 公司生产）4.43g/L，鹿糖 30g/L， 6-BA (6-苄基腺嘌呤）3mg/L，琼脂 7. 5g/L，pH = 5· 8
[0065] c.丛生芽群体的扩充按照中国专利文献CN101081005A(申请号200710018261. 6) 所述的技术方案进行。
[0066] 步骤二：诱变前期处理
[0067] a.挑选生长健壮的丛生芽作为诱变材料，沿着丛生芽块基部用镊子小心剥离出每 个丛生芽（注意不能损伤丛生芽基部的生长点），挑选出3. 5cm以上的丛生芽作为诱变材 料。每次诱变的丛生芽群体总数为500?1000个。
[0068] b.在自然条件下炼苗24_36h后切除上部叶鞘，预留基部以上1. 5?2cm，喷适量 的水保持材料湿润。
[0069] c.预先配制好栽培基质（腐殖土 ：河沙=1:1)，提前一天在基质中加水，直到吸水 饱和。
[0070] 步骤三：诱变处理，
[0071] a.用 pH = 6. 98 的磷酸缓冲液（Na2HP04:KH2P04 = 3:2)配制浓度为 0· 5% 的 EMS 溶液。
[0072] b.选择合适的容器（口径小高度大）进行诱变处理，将EMS溶液与切除叶鞘后的 丛生芽材料充分混合后放入真空泵中，抽20min真空后静置浸泡3h。
[0073] 步骤四：诱变后栽植
[0074] a.将诱变处理后的材料用纱布包裹后固定，放入流水中冲洗，并调节水流大小避 免材料被冲走，冲洗40?60min后取出材料。
[0075] b.种植材料前预先在培养盆中规划好种植密度，将材料直接插入培养基质中栽 植，栽植深度为0. 5?lcm，种植完成后将材料转移到温度20°C，光照14h，光强1500? 20001ux的温室中培养，每天浇水1?2次，保持基质表面湿润。
[0076] 步骤五：移栽
[0077] 三个月后，将长成的单株移栽至直径25cm的花盆或者大田中。
[0078] 步骤六：突变体鉴定
[0079] 与初始基因型进行比较，根据诱变后植株表型性状和生理性状变化，鉴定出目标 突变体。
[0080] 经过EMS处理的幼苗与空白对照相比，诱变处理过的部分植株在形态等方面会出 现明显差异，具体表现为：如植株分蘖相对较少，植株较矮，开花期延迟等。经过田间选育后 有望育成新的品种（系）或种质材料。
【权利要求】
1. 一种柳枝稷突变体的创制方法，其特征在于，包括以下操作： 1) 大田情况下，当柳枝稷植株生长发育达到5?6个节、幼穗开始形成时，取长度1? 1. 5cm的穗下茎节组织；对穗下茎节组织消毒处理后冲洗，然后接种至MBP培养基，扩充丛 生芽群体； 2) 挑选生长健壮的丛生芽，在不损伤基部的生长点的情况下剥离丛生芽，获取待诱变 的丛生芽群体； 将丛生芽群体在25°C室温条件下炼苗24?36h，然后切除上部叶鞘，预留基部以上 1. 5?2cm,并喷水保持其湿润； 3) 以磷酸缓冲液配置的质量浓度为0. 5?1. 0 %的甲基磺酸乙酯溶液作为诱变液，将 诱变液与待诱变的丛生芽群体充分混合后，在真空环境下静置1?3h进行诱变； 4) 将诱变后的丛生芽群体用水充分冲洗后，插入培养基质中栽植，栽植深度为0. 5? lcm，栽植完成后温室培养； 5) 温室培养三个月后，将长成的单株移栽至花盆或者大田中； 6) 在大田环境中，以初始基因型性状作为对照，根据诱变后植株表型性状和生理性状 变化，鉴定出柳枝稷突变体。
2. 如权利要求1所述的柳枝稷突变体的创制方法，其特征在于，所述的茎节组织包含 茎节上下各〇. 5?0. 7cm的长度。
3. 如权利要求1所述的柳枝稷突变体的创制方法，其特征在于，所述对茎节组织消毒 处理为： 采用70 %的酒精对对茎节组织进行表面消毒1?3min，再用质量浓度20 %的次氯酸钠 溶液灭菌5?8min，无菌水冲洗3-4次。
4. 如权利要求1所述的柳枝稷突变体的创制方法，其特征在于，所述的MBP培养基，其 成分为：MS基本培养基4. 43g/L，蔗糖30g/L，6-BA (6-苄基腺嘌呤）3mg/L，琼脂7. 5g/L，pH =5· 8〇
5. 如权利要求1所述的柳枝稷突变体的创制方法，其特征在于，在挑选丛生芽时，挑选 出长度3. 5cm以上的丛生芽作为待诱变的材料，每次诱变的丛生芽群体总数为500?1000 个。
6. 如权利要求1所述的柳枝稷突变体的创制方法，其特征在于，所述的诱变液是使用 pH = 6. 98的磷酸缓冲液进行配制的。
7. 如权利要求1所述的柳枝稷突变体的创制方法，其特征在于，将诱变液与待诱变的 丛生芽群体充分混合后放置于容器中，然后放入真空泵中，抽10?20min真空后静置浸泡 3h〇
8. 如权利要求1所述的柳枝稷突变体的创制方法，其特征在于，所述的栽培基质为腐 殖土与河沙按照1?1. 2:1的质量比混合，栽植前一天在基质中加水，直到吸水饱和。
9. 如权利要求1所述的柳枝稷突变体的创制方法，其特征在于，所述的栽培基质中栽 植密度为800?1000个/ m2。
10. 如权利要求1所述的柳枝稷突变体的创制方法，其特征在于，所述的温室培养，其 培养温度为20?25°C，每天光照14h，光强1500?20001ux，每天浇水1?2次，保持基质 表面湿润。
【文档编号】A01H4/00GK104137773SQ201410249822
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】奚亚军, 李毛, 王勇锋 申请人:西北农林科技大学