一种疫霉多糖激发子Gep1及其在提高植物抗病性中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种疫霉多糖激发子Gep1及其在提高植物抗病性中的应用，Gep1多糖激发子分离纯化自烟草疫霉，经薄层层析分析，确定该多糖的单糖组成为葡萄糖，Gep1具热稳定性，可耐受酸碱，在100℃高温处理60min后和pH2-12条件下仍具有活性，将其喷洒在植物叶面，可以诱导烟草产生抗性，对烟草花叶病毒病有较好防效。每升疫霉发酵液可分离获得6g多糖激发子，产量远高于蛋白质激发子。多糖激发子施用在田间后，在植物体内、土壤和水体中易分解，无残留，对环境无污染，对人畜等非靶标生物相对安全，不易产生抗药性。因此，该产品将具有十分广阔的应用与市场前景。
【专利说明】一种疫霉多糖激发子Gepl及其在提高植物抗病性中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于农业微生物学技术及生物化学与分子生物学【技术领域】，具体涉及一种疫霉多糖激发子Gepl，还涉及其在提高植物抗病性中应用。
【背景技术】
[0002]糖类激发子是指具有激活植物自身免疫、提高植物抗病抗逆能力的糖类物质，属于生物源激发子(Yin H et al.2010)。糖类一直被认为是一类惰性化合物，只作为生物体内的代谢能量来源或充当结构保护材料(如植物细胞壁)。Ayers等在1976年发现细胞壁的寡糖碎片可以诱导大豆产生植保素(phytoalexin),从此人们对糖类功能开始了新的认识。目前，人们已普遍认为寡糖是能够诱导高等植物防御反应的激发子中的一类。它们实现功能的基本原理是通过激发植物产生病程相关蛋白(pathogenesis-related protein,PR蛋白)和植保素等，增强植物的抗病性。
[0003]目前已鉴定的真菌激发子大多数是低聚糖或糖蛋白，少数为蛋白质或多肽。β -1, 3-β -1, 6-葡寡糖是最具代表性的真菌激发子，它是从大豆致病菌大雄疫霉菌(Phytophthora megasperma)的细胞壁水解产物中得到的。当浓度为lCT3-lCT4mol/L时，即可诱导大豆叶片产生植保素(Sharp et al.1984)。Smith(1991)从爺病镰刀菌(Fusariumsolani)中分离得到一种可诱导紫花苜蓿产生豌豆素的脱乙酰壳多糖。许多研究证明，壳多糖能够有效诱导多种植物产生抗病性，对病害的防治有明显效果，如可诱导番茄对根腐菌和早疫霉抗性，还可诱导大豆幼苗抗大豆镰刀菌根腐病(F.0xysporum) (Smith etal.1991)。
[0004]葡聚(寡)糖与其他糖类激发子的不同之处是其通常包括主链与侧链，具有β-1，3和β _1，6两种连接方式。β-D-葡聚糖(β-D-glucan)广泛存在于真菌、褐藻、地衣及谷物等生物体中，具有诱导植物产生抗病性，抗细菌、抗病毒、抗肿瘤和促愈合等生物活性。其降解产物β-葡寡糖能诱导大豆、甜椒、紫花苜蓿、水稻、拟南芥、烟草、小麦和葡萄等多种植物产生抗性，其作用机制可简单概括如下:首先被植物细胞壁或细胞膜上的受体识别后转入胞内，进而引起胞内钙离子(Ca2+)流、质膜去极化、胞外碱化等一系列早期信号反应，再经过一氧化氮(nitric oxide,NO)、活性氧(reactive oxgen species,R0S)等二级信号分子的进一步转导和放大，包括水杨酸(salicylic acid, SA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、乙烯(ethylene，ET)等植物激素的积累和释放来调控防卫基因的表达，从而积累PR蛋白和次级代谢产物，来诱导植物自身免疫抗性，抵抗病原物质的侵染(武维华2003)。
[0005]研究发现β -葡寡糖激发子的结构不同对植物的诱导作用不同。大豆和蝶形花科植物可以识别具分支结构的β-1，3-β-1，6葡七糖(以β-1，6-为主链，带有β_1，3侧链)，却不能识别线性的β -1, 6-葡寡糖。烟草和番茄能够识别线性β -1, 3-葡寡糖，而欧芹却不能识别。线性的β_1，6-葡寡糖无法诱导水稻产生抗病性，而含一个1，6分支的线性β-1，3-葡五糖却能诱导水稻产生植保素(Yamaguchi et al.2000)。
[0006]糖化学家采用不同结构的葡寡糖，通过测定激发子的活性及其与细胞膜的结合能力来研究葡寡糖的不同结构对诱导植物抗性能力差异的影响。结果表明，移除葡寡糖非还原端的葡萄糖残基或改变支链结构会显著降低植物的抗病活性；而增加葡寡糖还原端的葡萄糖残基、或对其进行烷基及其他基团修饰，其活性基本不变。例如，去掉非还原端的3个葡萄糖残基或支链葡萄糖残基的葡七糖不能或几乎不能诱导大豆产生和积累植保素(Yi et al.2003) ?此外，葡寡糖经硫酸化后可提高诱导植物抗病的效果(Menard etal.2004)。研究人员还发现，若要诱导酸性和碱性PR蛋白的表达，则硫酸化修饰的程度要大于0.4(DS>0.4)，且DS>1.5时，诱导效果更加明显。例如对于烟草，DS = 2.4的海带淀粉(β -1, 3葡寡糖)(Iaminaran)可以诱导PR蛋白的表达，抵抗烟草花叶病毒的侵染。
[0007]烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)是最重要的植物病毒之一,可侵染36科350多种植物，其中最主要的是茄科植物，以烟草和番茄尤重(商鸿生和李振岐2005)。感染TMV的植株的典型症状是花叶，发病初期新叶上发生“脉明”现象，并逐渐从叶片的基部向顶端发展，最后扩展至整个叶片。受病毒的干扰，叶片厚薄不均，形成疱斑、皱缩，甚至扭曲。严重时叶片呈柳叶状。早期发病植株生长缓慢，不能开花结果，即使结果其种子也不能发芽或发芽率极低(Reinero and Beaehy 1986)。
[0008]寡聚糖不仅能够调控植物生长，还能够诱导植物产生抗性相关的活性物质，抑制病害的形成。目前，尚未见从疫霉真菌中分离葡聚糖激发子的报道。我们从烟草疫霉(Phytophthora parasitica)的培养滤液中分离纯化出一种葡聚糖类激发子,发现该激发子能诱导烟草对TMV的系统抗性，其对TMV的防治效果优于市售超敏蛋白。研究结果丰富了葡聚(寡)糖与病原菌互作的理论，同时也为日后开发应用新的生防农药提供了一定的理论支撑。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于提供了一种疫霉多糖激发子，该多糖激发子分离纯化自烟草疫霉，经薄层层析分析，确定该多糖的单糖组成为葡萄糖， 申请人:将其命名为Gepl。
[0010]本发明的另一个目的在于提供了一种疫霉多糖激发子Gepl在提高植物抗病性中的应用。将其喷洒在植物叶面，它可以诱导烟草产生抗性，对烟草花叶病毒病有较好防效。
[0011]为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施:
[0012]一种疫霉多糖激发子Gepl，通过以下步骤制备得到:
[0013]1.将烟草疫霉(P.parasitica)的发酵液先用4层纱布过滤，再离心后收集上清液。氯仿、胰蛋白酶和蛋白酶K除去蛋白。再加入4X体积的无水乙醇放置于_20°C沉淀过夜，离心弃上清，沉淀经真空冷冻干燥得到的粉末即为粗多糖。
[0014]2.活性物质的分离纯化及有效成分鉴定:将上述获得的粗多糖溶于少量的蒸馏水中，依次通过DEAE-52纤维素柱层析和Sephadex G-100柱层析进一步分离纯化,硫酸-苯酚法检测糖含量绘制洗脱曲线。利用洗脱曲线各峰值的组分进行活性检测。在活性分析后，对有活性的物质进行真空冷冻干燥进行浓缩，即得疫霉多糖激发子Gepl。
[0015]市售的烟草疫霉或是已公开的烟草疫霉均能完成本发明。
[0016]以上所述的制备步骤，具体如下:
[0017]1.将发酵液先用4层纱布过滤，滤液于3000r/min离心1min后，收集上清液。用冷冻干燥法将得到的上清液浓缩成约原体积的1/10 ;向浓缩液中加入1/5体积的氯仿振荡20min,8000r/min离心1min,除去氯仿和部分蛋白，重复3次；继续向浓缩液中加入终浓度均为20 μ g/mL胰蛋白酶和蛋白酶K于37°C温育30min后，沸水煮沸5min，4°C、8000r/min离心取上清；向除去蛋白的浓缩液中加入4X体积的无水乙醇放置于_20°C沉淀过夜，4°C、8000r/min离心5min,弃上清,沉淀经真空冷冻干燥得到的粉末即为粗多糖；
[0018]2.粗多糖溶于蒸馏水后，加入无水乙醇，终浓度为60%，置于-20°C冰箱过夜，4°C、8000r/min离心20min取上清，向上清液中加入无水乙醇，使乙醇浓度达到80%后，置于-20°C冰箱过夜，4°C、8000r/min离心20min取沉淀，待乙醇完全挥发后加入蒸馏水重溶，得到80%乙醇沉淀多糖；取80%乙醇沉淀多糖于3000r/min离心10min，取上清液，备上样；待DEAE-52纤维素柱子下端流出液pH值为7.0开始上样，共上样4mL，依次用蒸馏水、0.lmol/L NaCl、0.5mol/L NaCl>lmol/L NaCl 溶液洗脱，自动收集，流速 lmL/min,每管6mL ;苯酚-硫酸法跟踪检测，以试管数为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到粗多糖的洗脱曲线，合并含糖单一峰位，蒸馏水透析2d，检测其生物活性后，冷冻干燥；
[0019]取适量S^hadex G-100粉末，加入足够的蒸馏水室温下溶胀过夜，脱气后湿法装柱，0.01mol/L NaCl平衡过夜；将DEAE-52纤维素柱层析分级所得的活性组分溶于最小体积的0.01 mol/L NaCl溶液中，加到已平衡好的Sephadex G-100柱，以0.01mol/L NaCl溶液为洗脱液，流速为lmL/6min,每管3mL,用自动部分收集器收集,苯酹-硫酸法检测多糖分布，以试管数为横坐标，吸光度为纵坐标作图，绘制洗脱曲线，分别收集各主峰，蒸馏水透析2d，检测其生物活性后，冷冻干燥，即得多糖激发子Gepl。
[0020]烟草疫霉的发酵方法如下:
[0021]将活化的烟草疫霉(P.parasitica)菌丝块接种于马铃薯蔗糖培养液中(马铃薯600g，20g葡萄糖，用水定容到100mL,卡那霉素终浓度为50 μ g/mL)，26°C、200r/min黑暗培养24d，得到发酵液。
[0022]一种疫霉多糖激发子Gepl在提高植物抗病性中的应用，其应用过程是:
[0023]将G印I溶液(2.0-5.0mg/mL)喷洒在植物叶面，可以诱导烟草产生抗性，对烟草花叶病毒病有较好防效。
[0024]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0025]1.本发明制备的疫霉多糖激发子G印I诱导烟草抗病相关基因的表达及防卫物质的产生和积累，从而抑制病株体内TMV的增殖，使显症推迟，症状减轻，叶绿素含量显著高于未诱导病株。研究结果丰富了葡聚(寡)糖与病原菌互作的理论，同时也为日后开发应用新的生防农药提供了一定的理论支撑。
[0026]2.Gepl对TMV有较好的防治效果。室内盆栽实验，每隔七天进行采样，4次的统计调查结果为:4mg/mL G印I处理组的防效依次为100.00%,93.00%,87.78%,67.39%0市售超敏蛋白处理组的防效依次为88.91%,84.46%, 77.63%, 50.86%。表明4mg/mL的G印I对TMV的防治效果优于超敏蛋白，能有效地抑制TMV在烟草体内的增殖，降低发病率，推迟发病时间。
[0027]3.G印I具热稳定性，可耐受酸碱，在100°C高温处理60min后和pH 2_12条件下仍具有活性。这为多糖激发子的田间应用奠定了很好的基础，可保证其效果的稳定性，且便于长期贮存。每升疫霉发酵液可分离获得6g多糖激发子，产量远高于蛋白质激发子。此外，由多糖激发子开发的生防农药的发酵原料来源丰富、生产成本低、无毒安全、无公害。多糖激发子施用在田间后，在植物体内、土壤和水体中易分解，无残留，对环境无污染，对人畜等非靶标生物相对安全，不易产生抗药性。因此，该产品将具有十分广阔的应用与市场前景，无论是生产企业，还是农作物种植者都将因此获得巨大的经济效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为80%乙醇沉淀多糖DEAE-52纤维素柱层析洗脱曲线。
[0029]图2为峰II的S印hadex G-100柱层析洗脱曲线示意图。
[0030]图3为Gepl引起过敏反应产生坏死斑示意图。
[0031]图4为Gepl酸水解产物的薄层层析示意图。
[0032]图5为不同处理后的Gepl诱导的烟草过敏反应示意图。
[0033]图6为Gepl诱导烟草产生HR的最低浓度。
[0034]图7为G印I处理烟草细胞不同时间的NO含量变化示意图。
[0035]*表示显著差异，Ρ〈0.05。
[0036]图8为DAB染色检测烟草体内H2O2的积累(200X)示意图。
[0037]图9为Gepl诱导的烟草细胞外质碱化示意图。
[0038]*表示显著差异，Ρ<0.05 ;**表示极显著差异，Ρ<0.01。
[0039]图10为苯胺蓝染色检测G印I诱导的烟草叶片胼胝质的积累示意图。
[0040]图11为荧光检测Gepl诱导烟草叶片酚类物质的积累(200Χ)示意图。
[0041]图12为Gepl诱导烟草叶片防御相关酶的活性提高示意图。
[0042]图13为G印I对TMV的体外钝化作用示意图。
[0043]图14为荧光定量PCR检测Gepl诱导烟草对TMV的抑制作用示意图。
[0044]*表示显著差异，Ρ〈0.05 ;**表示极显著差异，Ρ〈0.01。
[0045]图15为Gepl对感染TMV烟草叶肉细胞超微结构的影响示意图。
[0046]图16为Gepl诱导烟草过敏性反应基因的转录水平增加示意图。
[0047]图17为Gepl诱导烟草叶片多个抗性相关基因的转录水平增加示意图。
[0048]图18为多糖激发子Gepl对TMV防治的病情指数统计示意图。
[0049]图19为多糖激发子Gepl对TMV的防治效果统计示意图。
[0050]图20为G印I的注射和采样部位示意图。
【具体实施方式】
[0051]本发明实施例所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术，所用试剂如未特别说明，均来源于商业化渠道。
[0052]实施例1:
[0053]一种疫霉多糖激发子Gepl，通过以下步骤制备得到:
[0054]1.烟草疫霉(P.parasitica)发酵液的培养和粗多糖的提取:
[0055]将活化的烟草疫霉(P.parasitica)(中国农业微生物菌种保藏管理中心,菌株保藏号ACCC36285)菌丝块接种于(挑取菌落边缘处的直径为Icm的菌丝块)马铃薯蔗糖培养液250mL中(马铃薯600g，20g葡萄糖，用水定容到lOOOmL，卡那霉素终浓度为50 μ g/mL)，26°C、200r/min黑暗培养24d，，得到发酵液(菌体浓度为lxl07CFU/mL)。
[0056]将发酵液先用4层纱布过滤，滤液于3000r/min离心1min后，收集上清液。用冷冻干燥法将得到的上清液浓缩成约原体积的1/10。向浓缩液中加入1/5体积的氯仿振荡20min,8000r/min离心1min,除去氯仿和部分蛋白，重复3次。继续向浓缩液中加入胰蛋白酶和蛋白酶K (终浓度均为20 μ g/mL)于37°C温育30min后，沸水煮沸5min，4°C、8000r/min离心取上清。向除去蛋白的浓缩液中加入4X体积的无水乙醇放置于_20°C沉淀过夜，4°C、8000r/min离心5min,弃上清,沉淀经真空冷冻干燥得到的粉末即为粗多糖。
[0057]2.多糖激发子G印I的分离纯化:
[0058]DEAE-52纤维素预处理。取50g DEAE-52加入500ml蒸馏水浸泡24h，去除悬浮细颗粒；加入0.5mol/L NaOH溶液浸泡2h，抽滤，蒸馏水洗至中性；再加入0.5mol/L HCl浸泡2h,抽滤,蒸懼水洗至中性；最后用0.5mol/L NaOH浸泡0.5h,抽滤,蒸懼水洗至中性,此时DEAE-纤维素已转化成OH-型,脱气后湿法装柱(2.0 X 50cm),蒸懼水平衡。
[0059]粗多糖溶于蒸馏水后，加入无水乙醇，终浓度为60%，置于_20°C冰箱过夜，4°C、8000r/min离心20min取上清，向上清液中加入无水乙醇，使乙醇浓度达到80 %后，置于_20°C冰箱过夜，4°C,8000r/min离心20min取沉淀，待乙醇完全挥发后加入蒸馏水重溶，得到80%乙醇沉淀多糖(多糖浓度为10mg/mL)。取80%乙醇沉淀多糖于3000r/min离心lOmin，取上清液，备上样。待柱子下端流出液pH值为7.0开始上样，共上样4mL，依次用蒸懼水、0.lmol/L NaCl、0.5mol/L NaCl、lmol/L NaCl 溶液洗脱，自动收集(流速 lmL/min,每管6mL)。苯酚-硫酸法跟踪检测，以试管数为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到粗多糖的洗脱曲线，合并含糖单一峰位，蒸馏水透析2d，检测其生物活性后，冷冻干燥。
[0060]多糖激发子生物活性检测:以具有5-7片真叶的烟草为材料，用ImL不带针头的注射器，取20 μ I (lmg/mL)多糖溶液从叶子背面注入叶片，以注射相同体积的蒸馏水作对照，每个处理重复3次。2d后观察是否有过敏反应的坏死斑形成，若出现了坏死斑，则说明该多糖溶液具备活性(以下同)。
[0061]结果如图1所示，图中:峰1、I1、II1、IV依次为蒸馏水、0.lmol/L NaCl、0.5mol/LNaCl和lmol/L NaCl溶液的洗脱峰。活性检测结果表明，峰II具有生物活性，收集该峰活性物质，进一步采用Sephadex G-100柱层析分离纯化。
[0062]取适量Sephadex G-100粉末,加入足够的蒸懼水室温下溶胀过夜(lg SephadexG-100加1ml蒸馏水)，脱气后湿法装柱(2.0X50cm)，0.01mOl/L NaCl平衡过夜。将DEAE-52纤维素柱层析分级所得的峰II组分溶于最小体积的0.01mol/L NaCl溶液中，加到已平衡好的Sephadex G-100柱(2.0 X 50cm)，以0.01mol/L NaCl溶液为洗脱液，流速为lmL/6min,每管3mL,用自动部分收集器收集,苯酹-硫酸法检测多糖分布，以试管数为横坐标，吸光度为纵坐标作图，绘制洗脱曲线，分别收集各主峰，蒸馏水透析2d，检测其生物活性后，冷冻干燥，得到均一多糖。此时的均一多糖即为本发明所述的疫霉多糖激发子Gepl。该多糖激发子Gepl能够诱导烟草产生HR，形成明显的坏死斑(图3)。
[0063]以上所述的过夜时长为12_24h。
[0064]每升疫霉发酵液可分离获得6g多糖激发子。
[0065]实施例2:
[0066]多糖激发子Gepl的单糖组成分析:
[0067]称取多糖样品1mg放入安醅瓶，加入2mL 2M的三氟乙酸溶液，酒精喷灯封口，120°C水解3.5h。冷却后滤膜过滤除去不溶物，减压旋转蒸发除去三氟乙酸，再加少量甲醇洗涤，继续旋转蒸发，重复3次，除去残留的三氟乙酸，加0.5mL蒸馏水溶解。用20X20cm的硅胶板分离，展开剂为乙酸乙酯-吡啶-无水乙醇-水(体积比=8:1:1:2)，显色剂为苯胺-二苯胺-磷酸(2%二苯胺丙酮溶液、2%苯胺丙酮溶液、85%磷酸按5:5:1的比例混合)。以溶于水的各单糖(葡萄糖、果糖、核糖、甘露糖、半乳糖、木糖、L-阿拉伯糖)标准液(10mg/mL)为参照。
[0068]结果如图4所示，其中I为Gepl的酸水解产物；2、3、4、5、6和7分别为葡萄糖、果糖、核糖、半乳糖、L-阿拉伯糖和木糖。Gepl的酸水解产物，经薄层层析分离后发现只有一个深蓝色的斑点，通过与标准单糖的Rf值比对后，确定其组成成分中只含有葡萄糖，无其他单糖成分。因此，确定Gepl为由葡萄糖组成的多糖。
[0069]实施例3:
[0070]检测多糖激发子G印I的理化性质:
[0071]多糖激发子Gepl的热稳定性检测:取多糖激发子Gepl (lmg/mL) 100 μ L,分别于40，60，70，80，90和100°C水浴中温育5min，然后将它们迅速置于冰上，冷却后4°C、12000r/min离心5min，取上清。待溶液回复至室温后，按实施例2所述生物活性鉴定方法检测其生物活性。以蒸馏水作对照，每个处理重复3次。此外，取多糖激发子(lmg/mL) 100 μ L，分别沸水浴20，30，40，50和60min，以及121°C高压湿热灭菌20min，用同上方法检测其生物活性。
[0072]结果如图5中 A所示，图中al_a6是分别经沸水浴20，30，40，50，60min，以及121°C高压湿热灭菌20min后的G印I，a8-al3是分别经40，60，70，80，90和100°C处理后的G印1，a7是蒸馏水对照。G印I具有热稳定性,沸水浴处理60min后仍具有生物活性。
[0073]分析多糖激发子Gepl的耐酸碱性:取300 μ L多糖激发子(lmg/mL)分别加入pH2,5,8,10,12的PBS中，室温静置lh，再用pH 7.5的Tris-HCl调pH至7.5后，按实施例2所述生物活性鉴定方法检测其活性。PH 7.5的PBS作对照，每个处理重复3次。
[0074]结果如图5中B所示，图中b2_b6是Gepl在pH 2，5，8，10，12的溶液里分别处理60min，bl是蒸馏水对照。不同pH下孵育的G印I经生物活性检测，结果显示即使当pH = 2和pH = 12时,激发子Gepl仍具有活性。表明Gepl能耐受酸碱。
[0075]检测多糖激发子Gepl引起烟叶产生过敏反应的最低浓度:分别取0.001mg/mL,0.01mg/mL,0.lmg/mL,0.5mg/mL, lmg/mL, 1.5mg/mL的多糖激发子水溶液，按照实施例2所述生物活性鉴定方法检测能够引起烟草叶片产生过敏反应的最低浓度。以蒸馏水为对照，每个处理重复3次。
[0076]结果如图6 所不，图中 C2-C7 分别是 0.001mg/mL, 0.01mg/mL, 0.lmg/mL, 0.5mg/mL,lmg/mL和1.5mg/mL的Gepl。Cl是蒸懼水对照。激发子Gepl可引起烟草过敏反应(HR)的最低浓度是0.5mg/mL。低于这一浓度则不能引起烟草产生HR ;高于这一浓度则显示出随浓度增加，HR越加强烈的现象。1.5mg/mL Gepl能够引起烟草产生典型的HR。
[0077]实施例4:
[0078]Gepl诱导的烟草系统抗性反应:
[0079](I)G印I诱导NO的产生
[0080]取50mL烟草悬浮细胞，加入终浓度为0.4mg/mL的G印I处理。每隔1min取样I次，每次取500 μ L。将取出的样品迅速放入液氮冻存，待用。样品沸水浴融化后，加入预热到 95。。的 1.5 X CTAB 50μ L，65°C温育 30min，每 5min 上下颠倒 I 次。于 12000r/min 离心lOmin，取上清。用NO检测试剂盒测定NO含量，蒸馏水作对照。用细胞培养液稀释标品NaNO2后，制作标准曲线。
[0081]结果显示:G印I诱导烟草悬浮细胞后，NO的生成量开始逐渐增加，且明显高于对照细胞，在激发子处理SOmin后，NO的生成量达到最大值，随后开始降低。对照细胞NO的量随时间缓慢升高一段时间趋于平稳后开始下降。(图7)
[0082]⑵G印I激活过氧化氢的沉积
[0083]用0.4mg/mL的G印I注射烟草叶片，处理24h后，将叶片置于玻璃平皿中，加入适量DAB染液，室温避光保存6h。取出叶片，放入盛有95%乙醇的烧杯中，至叶片绿色完全脱去，除去烧杯中液体。用50%甘油将叶片浸泡，用镊子小心赶出细胞间气泡，显微镜观察。蒸馏水作对照,每个处理重复3次。
[0084]结果如图8所示，其中图A是对照叶片，B是G印I处理叶片。DAB可以与烟草叶片中产生的H2O2反应，形成红褐色斑点。通过观察红褐色斑点的产生,可对H2O2的产生位点和产生量进行观测。结果发现Gepl激发子处理后的烟草叶片产生的H2O2主要在叶脉组织和处理部位累积。
[0085](3)G印I诱导细胞外质的碱化
[0086]取新转接的烟草悬浮细胞培养3d(25°C，150r/min)后，加入终浓度为0.4mg/mL的Gepl继续在摇床上培养，并每隔1min用pH测定仪测定细胞培养基的pH值。以蒸馏水作对照，每个处理重复3次。
[0087]结果如图9所示，Gepl诱导烟草悬浮细胞后，使细胞外质的pH发生了明显变化。随着处理时间的增加，Gepl诱导胞外pH值不断升高，明显高于对照组；而对照细胞在整个检测过程中PH虽有所上升，但上升幅度较小。
[0088](4)G印I诱导胼胝质的产生
[0089]用20yL 0.4mg/mL的G印I注射烟草叶片，24h后，将叶片放入缓冲液(1%戊二醒，5mmol/L柠檬酸，90mmol/L磷酸氢二钠，pH 7.4)中过夜。小心取出预处理的叶片，放入无水乙醇中沸水浴脱去叶绿素。用50%的乙醇清洗叶片2-3次后，转入漂洗缓冲液(67mmol/L磷酸氢二钾，pH 12)中，用染色缓冲液(0.1 %苯胺蓝，67mmol/L磷酸氢二钾，pH12)染色lh。取出染色的叶片用漂洗缓冲液冲洗1-2次，放入50%甘油中，用荧光显微镜进行固定观察。
[0090]结果图10所示，图10中A和a是对照；B和b为G印I处理叶片。A，B在可见光下观察(10X)，a和b在紫外荧光显微镜下观察(10X)。胼胝质有利于加强细胞壁成分，是植物物理防御的物质之一。Gepl处理烟草叶片24h后，用苯胺蓝染色，在紫外荧光显微镜下可观测到绿色荧光物质(如箭头所示)，而蒸馏水处理的叶片则没有出现这种荧光物质的积累。
[0091](5)G印I诱导酚类的产生和积累
[0092]取300 μ L烟草悬浮细胞，加入G印I，使其终浓度为0.4mg/mL,于25°C，150r/min处理108h后，3000r/min离心10min，弃上清，加入适量PBS重悬细胞。取适量细胞放在载玻片上用盖玻片封住后，在紫外荧光显微镜(激发波长为395nm)下观察酚类物质的积累。
[0093]结果如图11所示，图11中A和a是对照，B和b为G印I处理叶片。A，B在可见光下观察，a和b在紫外荧光显微镜下观察。酚类化合物具有抗氧化活性，是植物的次级代谢产物之一，它的积累有利于提高植物的抗病、抗逆性。G印I处理烟草悬浮细胞108h后，用荧光显微镜可以明显地观察到酚类物质的产生和积累。
[0094](6)过氧化物酶(POD)活性测定
[0095]选取长势相当的8叶期烟草，用4mg/mL的多糖激发子均匀喷雾整个植株的叶片正反面，连续喷雾3d，以蒸馏水处理为对照。处理前采样I次，喷雾后第4d开始每天采样I次，共8次。
[0096]准确称取烟草叶片0.25g放入预冷的研钵中，加入3mL 0.05M预冷的PBS缓冲液(pH7.0)和0.1g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及少量石英砂，冰浴研磨成匀浆。4°C，12000r/min离心20min，取上清液即粗酶液，置-20°C冰箱中备用。
[0097]在比色管中，依次加入(λ 05M PBS (pH 7.0) lmL、l%愈创木酚ImL和粗酶液lmL，摇匀后于30°C恒温水浴5min。向管中加入0.3% H2O2ImL,摇匀后迅速将反应液倒入Icm光径比色杯中，于470nm下测定OD值增加速度。用加ImL蒸馏水的标准管校零，并计算POD活性。用蒸馏水校零。
[0098]POD 活性(Δ OD.g_1.min-1) = ( Δ OD470 XVT)/(FffXtXV1)
[0099]式中t:反应时间(min) ；VT:样液总体积(mL) -,Y1:测定时样品用量(mL) ；Fff:样品鲜重(g)。
[0100]结果如图12中A所示，Gepl可诱导烟草叶片一系列防御相关酶的活性提高。Gepl诱导4d后POD活性明显高于对照组(P <0.05)，在诱导7d后POD活性达到最大值，约是对照组的3倍(P <0.01)，与对照组极显著性差异，此后活性急剧下降，9d后趋于平衡，但仍较对照组高。
[0101](7)多酚氧化酶(PPO)活性测定
[0102]PPO粗酶液提取与POD相同，不需稀释。测定时向比色管中加入0.05M PBS (pH
7.0)1.5mL和粗酶液0.1mL0 30°C水浴2min后，加入0.02M邻苯二酚1.5mL，摇匀后迅速于420nm下测定OD值增加速度，并计算PPO活性。用蒸馏水校零。
[0103]PPO 活性(Δ OD.g_1.min-1) = ( Δ OD420 XVT)/(FffXtXV1)
[0104]式中t:反应时间(min) ；VT:样液总体积(mL) -,Y1:测定时样品用量(mL) ；Fff:样品鲜重(g)。
[0105]结果如图12中B所示，多糖激发子G印I处理后烟草叶片PPO活性高于对照组。Gepl处理烟草后，PPO活性开始升高，7d时达到最大值，显著高于对照组(P < 0.05)，随后开始下降，其变化趋势与POD相似。
[0106](8)苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定
[0107]准确称取烟草叶片0.25g放入预冷的研钵中，加入3mL 0.05M硼酸缓冲液(pH
8.4)和少量石英砂，冰浴研磨成匀浆。4°C，12000r/min离心20min，取上清夜即粗酶液，置于-20°C保存备用。
[0108]测定PAL活性时，分别向比色管中加入3.8mL 0.1M硼酸缓冲液、ImL 0.02ML-苯丙氨酸和0.2mL粗酶液。40°C水浴60min后加入ImL盐酸终止反应，测定OD29tl值，并计算PAL活性。对照管用硼酸缓冲液代替粗酶液。
[0109]PAL 活性(0.01 AOD.g_1.mirT1) = (100X Δ OD290 X VT) / (Fff X t X V1)
[0110]式中t:反应时间(min) ；VT:样液总体积(mL) -,Y1:测定时样品用量(mL) ；Fff:样品鲜重(g)。
[0111]结果如图12中C所示，在Gepl处理后的全部检测时间内，PAL活性浮动较小。激发子处理6d后,PAL活性开始增加，9d时达到最大值,是对照组的1.6倍(p < 0.05)，随后随着时间的延长酶活性逐渐下降。
[0112]实施例5:
[0113]Gepl诱导烟草获得系统抗性
[0114]检测激发子Gepl诱导烟草系统获得系统抗性的浓度均采用4mg/mL。
[0115]TMV病毒汁液的制备:称取Ig新鲜的已具有明显病毒症状的烟草叶片，放入研钵中，加入0.05M的PBS (pH 7.0) 40mL和2g石英砂，研磨成匀浆后，2层纱布过滤，得到的病毒滤液(30个病毒粒子/ml)即可用来摩擦接种烟草，用于以下实验或实施例。
[0116]实验对象为长势健康、6-7叶期的心叶烟。选取植株上部的2片叶片，注射G印I共15 μ L。7d后，用脱脂棉蘸取病毒汁液及石英砂(0.5mL病毒滤液/叶片，0.1g石英砂/叶片)，沿着叶脉小心且均匀地涂抹在其余叶片上。以蒸馏水作对照。分别于接种病毒后48h和72h观察枯斑的形态与数量。按照下列公式计算枯斑抑制率:
[0117]枯斑面积抑制率=[(对照组枯斑面积占叶片总面积百分比一实验组枯斑面积占叶片总面积百分比)/对照组枯斑面积占叶片总面积百分比]X100%
[0118]枯斑数量抑制率=[(对照组枯斑数量一实验组枯斑数量)/对照组枯斑数量]X100%
[0119]结果显示:G印I处理后的烟草对TMV的侵染有一定的抗性，表现在枯斑数量的减少和枯班面积的减小。G印I诱导烟草叶片7d后接种TMV，分别在接种TMV 2d和3d后调查枯斑数和枯斑面积，结果显示，Gepl诱导组的枯斑数量和枯斑面积都明显低于对照组。A和a为对照组烟草在接种TMV后2d和3d时的照片；B和b为G印I处理过的烟草在接种TMV后2d和3d时的照片。在接种TMV 2d和3d后，枯斑数量的抑制率分别达到了 60.04%和60.57%;同时枯斑面积的抑制率也分别达到了 76.66%和69.32%。表明G印I处理后的烟草对TMV的侵染有一定的抗性和抑制作用。
[0120](2) GepI诱导烟草对TMV复制的抑制作用
[0121]选取长势相同的6-8叶期云烟87烟草苗，每组3棵。实验组用Gepl对整个植株叶片均匀喷雾，连续施用3d,每天I次,一次共喷淋150ml Gepl。分别用已市场化的超敏蛋白(Messenger，美国伊甸生物技术公司)和蒸馏水作对照。超敏蛋白按其产品说明书使用(50mg/L)。间隔7d后摩擦接种TMV(5ml病毒汁液/棵苗)。21d后采取各烟草的同一部位叶片，用荧光定量PCR检测烟草叶片的TMV含量。每组重复3次。具体操作步骤如下:
[0122]a.植物组织总RNA的提取及检测
[0123]利用Trizol试剂提取植物材料总RNA，具体方法如下:
[0124]液氮研磨烟草叶片，每1.5mL离心管分装0.1g样品；加入ImL Trizol试剂,迅速震荡混匀，室温静置1min ;加200 μ L氯仿，剧烈震荡15s，室温静置5min ；4°C，12000rpm离心15min ;取水相(约400 μ L)，加400 μ L异丙醇颠倒混匀室温下静置lOmin，4°C，12000rpm离心15min，弃上清；加ImL 75%乙醇清洗RNA，离心弃上清；室温静置约15min，使RNA沉淀干燥；加20 μ L DEPC水溶解，取2 μ L进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，并用分光光度计(Α260/Α280)测定RNA浓度。
[0125]b.除去 RNA 中的 DNA
[0126]用DNA I处理以除去RNA中的DNA。
[0127]反应体系为:10Xreact1n buffer with Mg2+IuL
[0128]RNase-free DNase IIuL
[0129]RNase-free waterUp to 1uL
[0130]反应条件为:37°C下孵育60min。
[0131]加入I μ L 的 50mM 的 EDTA，65°C孵育 lOmin，以除去 DNA I。
[0132]c.反转录
[0133]参照Reverse Transcriptase M-ML (RNase H-) (TaKaRa)说明书进行。
[0134]首先是cDNA第一条链的合成。
[0135]合成体系为 :
[0136]
Total RNA ( DNase I treated)I μg
Reverse Primer (OligodT)I μ!>
SxRetict1n butter4 μΕ
Ribolockl Μ RNcise inhibitorI μL.1raM dNTP mix2 μL
RevertAcidl χ? M-MuLV Reverse TninseriptaseI pL
[0137]轻轻混匀，短暂离心后于42°C孵育60min。70°C反应1min终止反应。
[0138]d.荧光定量PCR检测烟草叶片中TMV含量
[0139]根据SYBR Premix Ex Taq? II (Perfect Real Time)的说明书，进行Real-time PCR,反应体系为:SYBR Premix EX Taq?II (2 X) 12.5 μ L, ROX ReferenceDyeII(50X)0.5μ L, qTMVF/qActinF (10 μ M) 0.5 μ L, qTMVR/qActinR(10 μ Μ) 0.5 μ L, cDNAIyL, ddH2010 μ L, Total 25 μ L。
[0140]引物为:qTMVF:5'-TGCCGAAACGTTAGATGCTACTC-3'，
[0141]qTMVR:5/ -AAGGAGCGCGATAAATAATTTAATAGTAGA-3,；
[0142]qActinF:5/ -GGTAGCTCCACCTGAGAGGAAGT-3'，
[0143]qActinR:5/ -GCCTTTGCAATCCACATCTGT-3;。
[0144]其中引物qTMVF和qTMVR扩增TMV的外壳蛋白(CP)的部分序列，qActinF和qActinR扩增烟草持家基因Actin。
[0145]反应条件:预变性阶段:95°C 1s ;PCR反应阶段:95°C 6s，62°C 35s，重复35个循环；熔解阶段:95°C 15s，62°C 60s,95°C 15s，62°C 15s。
[0146]求出Δ ACT值，进行定量分析。
[0147]结果如图14所示:经Gepl处理的烟草,体内TMV CP基因的表达量是对照组的9%,而超敏蛋白(Messenger)处理组是对照组的60%。说明Gepl诱导的烟草可显著抑制TMV在烟草体内的增殖。
[0148](3)观察G印I对感染TMV烟草叶肉细胞超微结构的影响
[0149]对烟草的预处理方法同步骤(1)。分别于接种TMV 7d、14d和21d采取烟草同一叶位的病毒感染部位，进行固定、脱水、包埋和切片，然后置于透射电镜下进行超微结构观察。以蒸馏水作为对照。
[0150]结果如图15所示:图15中Al，al:对照组感染TMV 7d后；BI，bl:G印I处理组感染TMV 7d后；A2，a2:对照组感染TMV 14d后；B2，b2:Gepl处理组感染TMV 14d后；A3，a3:对照组感染TMV 21d后；B3，b3:G印I处理组感染TMV 21d后。Ch.叶绿体；CW.细胞壁；M.线粒体；N.细胞核；0s.嗜锇颗粒；P.TMV病毒粒子；S.淀粉粒；PC.病毒包含体。健康的烟草植株细胞中含有大量的叶绿体，且在细胞边缘紧密排列。发育完全的叶绿体呈扁椭球状，具有清晰的双层膜结构，内含大的淀粉粒和嗜锇颗粒，基粒片层致密(BI)。受TMV侵染的烟草细胞中，叶绿体内的淀粉粒和嗜锇颗粒数量减少，叶绿体严重肿胀，基粒分散，基质不均一，部分叶绿体解体(a3);细胞质中出现晶体状内含体，先是分布在叶绿体周围(a2和a3)，之后充满整个细胞质(A3)。G印I处理过的烟草叶肉细胞中存在极少量病毒粒子，且病毒粒子断裂，长短不一(b2);细胞器的完整度较好；叶绿体具完整的膜结构，基粒片层排列整齐，内含少量小的淀粉粒(B3);细胞质中出现菱形包含体，存在于叶绿体周围，放大观察可以看到纵横排列的条纹，外被膜状物(b3)。说明Gepl不仅可以抑制TMV对细胞的侵染，还可以抑制TMV在烟草细胞内的增殖。
[0151 ] (4)多糖激发子诱导烟草过敏性反应基因和抗性相关基因的表达
[0152]A.总RNA的提取及cDNA第一链的合成
[0153]选取长势相同的8叶期三生烟，每组3棵苗。检测激发子诱导HR基因(hypersensitive response)表达时,用4mg/mL多糖激发子注射烟草第6、7和8位叶片的A部位(图20)(共注射60 μ L)，采取B部位叶片，采样时间为G印I处理后0h，3h，6h，12h，ld，3d，5d，7d，9d。对诱导抗性基因表达检测的烟草用4mg/mL多糖激发子喷雾烟草的第6、7和8位叶片(共喷雾20mL)，采取第4和5位叶，采样时间同HR基因表达检测。对植物组织总RNA进行提取和检测，除去RNA中的DNA，反转录均同上。
[0154]b.特异引物的设计
[0155]抗性基因表达分析采用半定量RT-PCR的方法，以在烟草中高度保守的基因qActin作内参。在进行反转录前需保证每个样品的RNA量相同。引物序列如表1所示。
[0156]c.HR和抗性基因的RT-PCR扩增
[0157]取上述反转录的第一链cDNA为模板，扩增抗性基因。反应体系为:
[0158]
【权利要求】
1.一种疫霉多糖激发子Gepl，通过以下步骤制备得到: 1)将烟草疫霉0°.parasitical的发酵液先用纱布过滤，再离心后收集上清液；氯仿、胰蛋白酶和蛋白酶K除去蛋白，再加入4 X体积的无水乙醇放置于-20 °〇沉淀过夜，离心弃上清，沉淀经真空冷冻干燥得到的粉末即为粗多糖； 2)将上述获得的粗多糖溶于少量的蒸馏水中，依次通过DEAE-52纤维素柱层析和Sephadex G-100柱层析进一步分离纯化，硫酸-苯酚法检测糖含量绘制洗脱曲线；利用洗脱曲线各峰值的组分进行活性检测； 在活性分析后，对有活性的物质进行真空冷冻干燥进行浓缩，即得疫霉多糖激发子Gepl ο
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于: 1)将发酵液先用4层纱布过滤,滤液于3000r/min离心10 min后，收集上清液； 用冷冻干燥法将得到的上清液浓缩成约原体积的I / 10;向浓缩液中加入I / 5体积的氯仿振荡20 min,8000 r/min离心10 min,除去氯仿和部分蛋白，重复3次；继续向浓缩液中加入终浓度均为20 μ g/mL胰蛋白酶和蛋白酶K于37 °C温育30 min后，沸水煮沸5min, 4 0C >8000 r/min离心取上清；向除去蛋白的浓缩液中加入4 X体积的无水乙醇放置于-20。(!'沉淀过夜,4 0C >8000 r/min离心5 min,弃上清,沉淀经真空冷冻干燥得到的粉末即为粗多糖； 2).粗多糖溶于蒸馏水后，加入无水乙醇，终浓度为60%，置于-20°C冰箱过夜，4°C、8000 r/min离心20 min取上清，向上清液中加入无水乙醇，使乙醇浓度达到80%后，置于-20°C冰箱过夜，4°C、8000 r/min离心20 min取沉淀，待乙醇完全挥发后加入蒸馏水重溶，得到80%乙醇沉淀多糖；取80%乙醇沉淀多糖于3000 r/min离心10 min，取上清液，备上样；待DEAE-52纤维素柱子下端流出液pH值为7.0开始上样，共上样4 mL，依次用蒸馏水、0.1 mol/L NaCl、0.5 mol/L NaCl>I mol/L NaCl 溶液洗脱，自动收集,流速 I mL/min,每管6 mL ;苯酚-硫酸法跟踪检测，以试管数为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到粗多糖的洗脱曲线，合并含糖单一峰位，蒸馏水透析2 d，检测其生物活性后，冷冻干燥； 取适量Sephadex G-100粉末，加入足够的蒸馏水室温下溶胀过夜，脱气后湿法装柱，0.01 mol/L NaCl平衡过夜；将DEAE-52纤维素柱层析分级所得的活性组分溶于最小体积的0.01 mol/L NaCl溶液中，加到已平衡好的Sephadex G-100柱，以0.01 mol/L NaCl溶液为洗脱液，流速为I mL / 6 min,每管3 mL,用自动部分收集器收集,苯酹-硫酸法检测多糖分布，以试管数为横坐标，吸光度为纵坐标作图，绘制洗脱曲线，分别收集各主峰，蒸馏水透析2 d，检测其生物活性后，冷冻干燥，即得多糖激发子Gepl。
3.权利要求1所述的疫霉多糖激发子Gepl在提高植物抗病性中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:疫霉多糖激发子Gepl在提高烟草对烟草花叶病毒抗性中的应用。
5.权利要求1所述的疫霉多糖激发子Gepl在制备烟草抗烟草花叶病毒制剂中的应用。
【文档编号】A01N43/16GK104131049SQ201410382515
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年8月6日 优先权日:2014年8月6日
【发明者】赵秀云, 祁高富, 霍瑞, 李锡宏, 许汝冰, 王瑞, 谭军, 郭利 申请人:华中农业大学