转CmWRKY48基因切花菊的培育、鉴定方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于植物基因工程和转基因育种领域，提供包括有CmWRKY48基因的重组载体、转化细胞、转CmWRKY48基因切花菊的培育、鉴定方法及应用。转CmWRKY48基因切花菊的培育方法包括如下步骤：(1)菊花CmWRKY48基因的克隆(2)植物表达载体pMDC43-CmWRKY48的构建(3)农杆菌EHA105介导叶盘法转化菊花。对转化植株进行PCR、定量RT-PCR检测证实CmWRKY48基因已整合到转基因植株基因组DNA中并发生转录。对转基因植株进行抗蚜性检测，转基因植株抗蚜能力有很大提高，为利用基因工程技术选育菊花抗逆品种提供新颖而实用的方法，将有效推动菊花生物技术育种进程。
【专利说明】转CmWRKY48基因切花菊的培育、鉴定方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程和转基因育种领域，涉及一种通过转CmWRKY48基因 提高切花菊抗蚜性的方法，具体涉及包括有CmWRKY48基因的重组载体、转化细胞、转 CmWRKY48基因切花菊的培育、鉴定方法及应用。
【背景技术】
[0002] 菊花（Chrysanthemum morifolium)是我国传统十大名花和世界四大切花之一，其 栽培历史悠久。菊花具有丰富的花色、多样的花姿等特点，深受人们的喜爱，在世界范围内 广为栽培。WRKY是植物所特有的一类转录因子家族，因其N-端具有高度保守的WRKYGQK 的多肽序列而得名。WRKY转录因子通过调控相关基因的表达，参与植物对病虫害的防卫反 应、非生物胁迫（如盐害、干旱、低温、高温等）、生长发育等多种生理生化过程，在植物的抗 逆境反应中发挥着非常重要的作用。其中，WRKY转录因子也参与植食性昆虫对植物的取 食。采用高通量芯片技术研究甘蓝蚜虫接种拟南芥所导致的基因表达情况，发现了 16个 WRKY基因能够被诱导表达（1<U§NIERCZY1<等，2008);对大豆的抗蚜虫品种进行分析，发 现有3个WRKY基因的表达受蚜虫取食诱导（Li等，2008);在苜蓿中也发现有两个WRKY基 因受到青绿姆虫（bluegreen aphid)取食的诱导表达（Gao等，2010)。烟草天蛾（Manduca sexta)的取食能够诱导NaWRKY3和NAWRKY6的表达（Halitschke等，2003)，通过基因沉默 技术研究发现，烟草天蛾的生长速度在沉默植株中明显高于正常植株，并且沉默植株中一 些蛋白酶抑制剂的含量也显著低于正常植株。拟南芥AtWRKYS的表达受蛆虫取食和蚜虫取 食的诱导（Chen等，2010)。从番茄中克隆得到的S1WRKY70参与调控Mi-I抗性基因的表 达，沉默该基因的植株则表现为对马铃薯姆虫（Macrosiphum euphorbiae)和南方根结线虫 (root-knot nematode，RKN)的抗性减弱（Atamian 等，2012)。SlWRKY72a 和 SlWRKY72b 通 过Mi防卫路径参与了番茄抗根结线虫和马铃薯长管蚜的调控过程（Bhattarai等，2010)。
[0003] 近年来，随着分子生物学的迅速发展，通过遗传转化的技术在植物体内过量表达 特定的内源基因以提高植物抗逆性已成为现代育种的重要手段。采用农杆菌介导法可以 获得具有不同生物学特性的转基因菊花，如菊花花色、形状、高度、株型等园艺特征的改变， 以及菊花对非生物胁迫和病虫害的抗性的增强，转基因技术为改良菊花品种提供了新的手 段和途径。而利用农杆菌介导法提高植株抗性的研究报道也有很多，过表达AtWRKY39基 因的拟南芥则表现为提高了耐热性（Li等，2010);过表达TaWRKY2的拟南芥对盐害和干 旱的抗性增强（Niu等，2012) ;0sWRKY22过表达的水稻植株提高了对有毒力的稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzae)的抗性（Abbruscato 等，2012)。将含有 AtDREBlA 基因的植物表达 载体转入地被菊粉色品种'Fall color'中，转基因植株对盐渍胁迫表现出较强的耐性（洪 波etal.，2006);通过转基因技术将从大岛野路菊中克隆出了 SOSl基因转化菊花'神马'， 获得了具有抗盐性的转基因株系（An等，2014)。但是目前关于35S启动子驱动的WRKY基 因提高植株的蚜虫抗性方面还没有相关的报道。
[0004] 参考文献：
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【发明内容】
[0017] 针对目前现实生产中切花菊对蚜虫的抗性较低，而现有技术中缺少关于35S启动 子驱动的WRKY基因以提高植株蚜虫抗性的研究，本发明通过农杆菌介导法将菊花的内源 基因 CmWRKY48导入切花菊提高其抗蚜性，这种新的探索为采用基因工程技术选育菊花抗 逆品种提供新颖而实用的方法。
[0018] 本发明的技术方案路线如下：
[0019] 利用根癌农杆菌介导法，将CmWRKY48基因导入切花菊，并经过潮霉素筛选抗性植 株；经过潮霉素抗性筛选得到阳性转化植株，对转化植株进行PCR、定量RT-PCR检测验证内 源基因已经转入转基因植株的基因组DNA中并发生转录。对转基因植株后代进行抗蚜性分 析，最终获得抗蚜性提高的转基因菊花植株。
[0020] 本发明的目的具体通过以下技术手段获得：
[0021] 1.本发明提供一种重组载体，该重组载体包括序列如SEQ ID NO. 1所示CmWRKY48 基因，通过DNA连接酶将CmWRKY48基因连接到载体。
[0022] 2.本发明还提供包括有上述1提供重组载体的转化细胞。
[0023] 3.本发明还提供一种转CmWRKY48基因切花菊的培育方法，该方法以蚜虫高抗品 种'南农勋章'为材料获得抗蚜性基因 CmWRKY48,通过酶切连接与植物表达载体pMDC43质 粒进行重组连接，通过农杆菌介导法将CmWRKY48基因导入菊花。
[0024] 4.本发明提供的一种转CmWRKY48基因切花菊的培育方法，该方法包括如下步骤：
[0025] (1)菊花CmWRKY48基因的克隆
[0026] 以蚜虫高抗品种'南农勋章'叶片为材料，提取RNA并反转录成cDNA，根据序列信 息设计特异引物：
[0027] 上游引物CmWRKY48-F :序列如SEQ ID NO. 2所示，
[0028] 下游引物CmWRKY48-R :序列如SEQ ID NO. 3所示；获得CmWRKY48基因序列；
[0029] 结合PCR扩增目的基因的全长序列，设计引物：
[0030] 上游引物 CmWRKY48-GATE-F :序列如 SEQ ID NO. 4 所示，
[0031] 下游引物CmWRKY48-GATE-R:序列如SEQ ID NO. 5所示；在CmWRKY48基因的上游 和下游分别引入Sal I和Not I酶切位点，获得PCR产物；
[0032] (2)植物表达载体pMDC43-CmWRKY48的构建
[0033] 将步骤（1)获得的PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5a感受态细胞，提取阳 性质粒pMD19-CmWRKY48,将提取的阳性质粒用Sal I和Not I双酶切得到CmWRKY48片段， 与Sal I和Not I双酶切的pENTR?lA连接，转化，提取阳性质粒pENTR?lA-CmWRKY48,经 Pvu I单酶切线性化后，与植物表达载体pMDC43质粒进行LR重组反应，转化，提取阳性质粒 pMDC43-CmffRKY48 ；
[0034] (3)农杆菌EHA105介导叶盘法转化菊花
[0035] 将步骤⑵制备的阳性质粒pMDC43-CmWRKY48,加入感受态细胞EHA105,获得阳性 克隆农杆菌，通过叶盘法转化菊花，将CmWRKY48基因转入菊花中，获得转CmWRKY48基因切 花菊。
[0036] 5.上述1提供的重组载体在培育抗蚜性菊花上的应用。
[0037] 6上述2提供的转化细胞在培育抗蚜性菊花上的应用。
[0038] 7.上述3或4提供的转CmWRKY48基因切花菊的培育方法在抗蚜性转基因菊花株 系培育上的应用。
[0039] 8.通过上述3或4提供的培育方法获得切花菊在抗蚜性上的应用。
[0040] 9.转CmWRKY48基因切花菊的鉴定方法，该鉴定方法将转CmWRKY48基因初步获得 的抗性植株进行PCR鉴定、荧光定量RT-PCR分子检测，筛选阳性植株，获得转基因菊花株 系；
[0041] 具体包括如下步骤：
[0042] (I)PCR 检测
[0043] 提取待检测植株基因组DNA，将GFP基因作为检测目标，根据GFP基因两端合成扩 增反应引物，扩增出的片段长为263bp为阳性结果，引物序列为：
[0044] 上游引物 pMDC43-GFP-F :序列如 SEQ ID NO. 6 所示，
[0045] 下游引物 pMDC43-GFP-R :序列如 SEQ ID NO. 7 所示；
[0046] 分别以潮霉素抗性植株和未转化植株DNA为模板，以pMDC43-GFP-F和 PMDC43-GFP-R为引物，进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；
[0047] (2)荧光定量RT-PCR检测
[0048] 提取抗潮霉素植株叶片及未转化株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，建立荧光 定量RT-PCR扩增体系，每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的C t值，以未转化 植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况；特异引物扩增出的 片段长为136bp为阳性结果，引物序列为 ：
[0049] 上游引物 CmWRKY48-RT-F :序列如 SEQ ID NO. 8 所示，
[0050] 下游引物 CmWRKY48-RT-R :序列如 SEQ ID NO. 9 所示；
[0051] 以EFla扩增的基因片段为内标，片段长度为151bp，引物序列：
[0052] 上游引物EFl a -F :序列如SEQ ID NO. 10所示，
[0053] 下游引物EFl a -R :序列如SEQ ID NO. 11所示；
[0054] 由PCR、荧光定量RT-PCR检测呈阳性，确定获得转基因菊花株系。
[0055] 有益效果：
[0056] 1.本发明采用转基因技术，将CmWRKY48基因整合到菊花基因组中，获得的抗蚜性 菊花稳定表达抗性，不产生环境污染，填补现有技术的空白。通过转化内源CmWRKY48转录 因子并正常转录表达，及在蚜虫接种后诱导下游一系列基因的表达从而提高切花菊的抗蚜 性，为利用基因工程技术选育菊花抗逆品种提供新颖而实用的方法，将有效推动菊花生物 技术育种进程。
[0057] 2.本发明提供的方法选育了转基因菊花材料，通过蚜虫接种试验分析结果发现， 与未转基因植株相比，转入CmWRKY48基因的植株抗蚜虫的能力得到很大提高，利用本方法 向菊花基因组中转入的CmWRKY48基因可以显著提高菊花的抗蚜性：接种蚜虫后14天，对照 组蚜口数为起始蚜口数的17. 2倍，而转基因株系(》48-3、(》48-18、(《48-2、(《48-27的蚜口 数分别是起始蚜口数的10. 8倍、9. 4倍、9. O倍、10. O倍，蚜口密度抑制率分别为37. 21%、 45. 35 %、47. 67 %、41. 86 %，此时未转基因的菊花的平均蚜口数量为86头，而转基因株系 上的平均蚜口数量仅为49头，转基因菊花平均蚜口密度抑制率43. 02%。转基因植株的蚜 口密度低于非转化植株，转基因株系具有显著的抗蚜性。
[0058] 3.本发明通过pMDC43引入潮霉素抗性基因和GFP基因，利于后期通过潮霉素筛 选生根植株，利于分子水平上进行检测，二者结合结果准确可靠，并且通过荧光定量RT-PCR 检测可以定量检测抗蚜性表达水平。
【专利附图】
【附图说明】
[0059] 图lpMDC43-CmWRKY48植物载体构建路线图
[0060] 图2为植物表达载体pMDC43-CmWRKY48构建过程的琼脂糖凝胶电泳图
[0061] Ml =Marker 2000 ；1 ：CmffRKY48 ；M2 =Marker 15000 ；
[0062] 2 :pENTR?lA 质粒 Sal I 和 Not I 双酶切；
[0063] 3 :pMD19_CmWRKY48 质粒 Sal I 和 Not I 双酶切；
[0064] 4 :pENTR?lA_CmWRKY48 质粒
[0065] 5 :pENTR?lA-CmWRKY48 质粒 Pvu I 单酶切；
[0066] 6 :pMDC43-CmWRKY48表达载体质粒电泳图。
[0067] 图3转CmWRKY48基因菊花的转化和再生过程
[0068] a :转化叶盘分化出愈伤；b :转化叶盘分化出抗性苗；c :抗性苗生根筛选；
[0069] d :抗性苗生根；e :抗性苗生根长成完整植株。
[0070] 图4转CmWRKY48基因菊花特异引物检测电泳图
[0071] M :DL2000Marker ;1 :阳性质粒；2 :野生型植株；
[0072] 3?12 :转CmWRKY48的菊花株系。
[0073] 图5转基因及未转基因的菊花植株中CmWRKY48基因的相对表达量水平
[0074] WT :野生型植株；0X48-n :转CmWRKY48的株系。
[0075] 图6转基因菊花在蚜虫接种后的数量统计
[0076] 图7转基因菊花的抗姆虫接种试验（14d)
[0077] a :野生型植株；b :0X48-2 ;c :0X48-3 ;d :0X48_18 ;e :0Χ48-27。
【具体实施方式】
[0078] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照本领域的公知手段。
[0079] 实施例1.
[0080] (1)菊花 CmWRKY48 的克隆
[0081] 以蚜虫高抗品种'南农勋章'为材料【何俊平.切花菊蚜虫抗性鉴定与机理探讨 及LLA转基因研究.南京农业大学（2010).】，取叶片0. 15g，参照Trizol RNA提取试剂盒 (TaKaRa)说明书的操作方法提取叶片的总RNA，根据M-MLV反转录试剂盒（TaKaRa)进行反 转录获得cDNA，根据菊花文库中该基因的序列信息，运用primer 5软件设计特异引物扩增 CmffRKY48 ；
[0082] 上游引物CmWRKY48-F :序列如SEQ ID NO. 2所示，
[0083] 下游引物CmWRKY48-R :序列如SEQ ID NO. 3所示；
[0084] 以'南农勋章'叶片的cDNA为模板，进行PCR反应，50yL反应体系：10XPCR Buffer 5. 0 μ L，CmWRKY48-F、CmWRKY48-R 引物各 I. 0 μ L(20 μ mol · I/1)，dNTP mix 4. 0 μ L (2. 5mmol *L 〇，Taq DNA Polymerase 0· 2 μ L，cDNA 模板 I μ L，ddH20 37. 8 μ L ;反应 程序：95°C预变性5min，然后94°C解链45sec，55°C退火45sec，72°C延伸lmin，反应30个 循环，72°C延伸IOmin ;PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果如图2中I所示，片段大小为921bp， PCR产物用凝胶回收试剂盒（AXYGEN，USA)进行回收，即获得CmWRKY48基因序列，序列测定 为 SEQ ID NO. 1 ;
[0085] 根据CmWRKY48全长基因序列设计引物：上游引物CmWRKY48-GATE-F :序列如SEQ ID NO. 4所示，下游引物CmWRKY48-GATE-R :序列如SEQ ID NO. 5所示，以'南农勋章'叶 片 cDNA 作为模板，用高保真酶（PrimeSTAR? HS DNA Polymerase，TaKaRa)进行 PCR 反应： 50μL反应体系：10XHSPCRBuffer5·0μL，CmWRKY48-GATE-F、CmWRKY48-GATE-R引物各 1. 0 μ L (20 μ mol · L 〇 , dNTP mix 4. 0 μ L (2. 5mmol · L 〇 , PrimeSTAR? HS DNA Polymerase 0. 4μ L，cDNA模板I μ UddH2O 37. 6μ L ;反应程序：95°C预变性5min，然后94°C解链45sec， 55°C退火30sec，72°C延伸lmin，反应30个循环，72°C延伸10min，在目的基因 CmWRKY48的 上游和下游分别引入酶切位点Sal I和Not I，PCR产物用凝胶回收试剂盒（AXYGEN，USA) 回收，回收后产物用T4DNA连接酶（TaKaRa)连接到pMD19-T载体，转化DH5 α感受态细胞， 提取阳性质粒pMD19-CmWRKY48 ;
[0086] (2)植物表达载体pMDC43-CmWRKY48的构建
[0087] 植物表达载体的构建过程如图1所示，具体实施措施如下：取gateway入门载体 pENTR?lA(Invitrogen，USA)和 pMD19-CmWRKY48,用 Sal I 和 Not I 双酶切，双酶切体系 (50 μ L)：10XH Buffer 5 μ L, BSA 5 μ L, PENTRtmIA ^ pMD19-CmffRKY48 15 μ L, Sal I 2 μ L，Not I 2 μ L，ddH20 21 μ L ;37°C反应Ih ;双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，如 图2中2、3所示，分别获得了 pENTR?lA、CmWRKY48的双酶切后的片段，酶切产物用凝胶回 收试剂盒（AXYGEN)进行回收。用T4DNA连接酶（TaKaRa)连接两个回收的产物，连接反应 体系（10 μ L) :10XT4ligase Buffer 1 μ L，pENTR?lA 大片段 2 μ L，pMD19-CmWRKY48 小片 段6 μ L，T4DNA连接酶1 μ L ;16°C过夜连接反应，取5 μ L连接产物转化DH5 α感受态细胞。 37°C过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pENTR?lA-CmWRKY48,如图2中4所示。
[0088] 取质粒 pENTR?lA-CmWRKY48 用 Pvu I 单酶切，酶切体系（20yL) :10XRE Buffer 2yL，Acetylated BSA 2yL，质粒 pENTR?lA-CmWRKY4810yL，Pvu IlyL，ddH20 5 μ L ;37°C 反应3h，单酶切产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，与图2中4所示的pENTR?lA-CmWRKY48相 t匕，图2中5所示为pENTR?lA-CmWRKY48单酶切的结果，用凝胶回收试剂盒（AXYGEN)回收质 粒pENTR?lA-CmWRKY48大片段。将回收的片段与pMDC43载体质粒进行LR重组反应，反应 体系（5 μ L) :pENTR?lA-CmWRKY48 大片段 3 μ L，pMDC43 质粒 1 μ L，LR Clonase? II enzyme mix IyL ;25°C 反应 lh，加入 IyL Proteinase K，37°C 反应 IOmin ;取 5μ L 重组产物转化 DH5 α感受态细胞，37°C过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pMDC43-CmWRKY48， 电泳检测结果如图2中6所示，测序验证。植物表达载体pMDC43-CmWRKY48的构建成功，通 过PMDC43引入GFP基因和潮霉素抗性基因（如图1、图2)。
[0089] (3)农杆菌EHA105介导叶盘法转化菊花
[0090] 从YEB(50yg/mL利福平）平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50yg/ mL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28°C培养至OD值0. 5,而后冰浴菌液30min，离心 收集菌体，悬浮于2mL预冷的IOOmM CaCl2 (20%甘油）溶液中，200 μ L/管分装，待用。取 10 μ L pMDC43-CmWRKY48载体质粒，加入200 μ L感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min， 37°C 5min，加入800 μ L YEB液体培养基，28°C 200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB (50 μ g/mL 利福平+50 μ g/mL卡那霉素）固体培养基上，28°C暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性 克隆摇菌，用于转化菊花。
[0091] 用YEB液体培养基培养阳性克隆农杆菌EHA105,即包含CmWRKY48基因的植物表达 载体的EHA105 ;将转基因植株后代命名为0X48-n，以切花菊'神马'叶片为外植体，采用根 癌农杆菌介导法将'南农勋章'中克隆得到的CmWRKY48基因导入菊花。取组培瓶中菊花苗 顶端叶盘（0. 5cm X 0. 5cm)作为转化受体，在预培养培养基中预培养3d，然后浸入备好的 农杆菌菌液中感染l〇min，用滤纸吸干菌液后再接种到共培养基上黑暗中共培养3d，然后 转入筛选培养基上继代培养4代。如图3a所示，在筛选培养的初期，转化的叶盘分化出抗 性愈伤组织，随着继代培养的进行，愈伤组织会长出抗性苗（图3b)，等分化出的抗性芽长 至2?3厘米时转入生根培养基上，如图3c所示，进行生根筛选，初步获得生根正常、长势 正常的抗性植株（图3d、e)。
[0092] 菊花组织培养基以MS培养基为基础，pH 5. 8,100Kpa、121°C灭菌20分钟；预培养 培养基：MS+6-苄氨基嘌呤（6-BA) lmg/L+萘乙酸（NAA)O. 5mg/L ;共培养培养基：MS+6-苄氨 基嘌呤（6-BA) lmg/L+萘乙酸（NAA)O. 5mg/L ;筛选培养基：MS+潮霉素（Hyg) 10mg/L+羧卞青 霉素（Carb) 500mg/L+6-苄氨基嘌呤（6-BA) lmg/L+萘乙酸（NAA)O. lmg/L ;生根培养基：MS+ 潮霉素（Hyg) 8mg/L。
[0093] (4)转CmWRKY48基因抗性植株进行分子检测
[0094] I) PCR 检测
[0095] 取生根筛选得到的潮霉素抗性植株嫩叶及未转化株嫩叶，提取基因组DNA JfGFP 基因作为检测目标，根据GFP基因两端合成扩增反应引物，扩增出的片段长为263bp，引物 序列为：
[0096] 上游引物 pMDC43-GFP-F :序列如 SEQ ID NO. 6 所示，
[0097] 下游引物 pMDC43-GFP-R :序列如 SEQ ID NO. 7 所示；
[0098] 分别以潮霉素抗性植株和未转化植株DNA为模板，以pMDC43-GFP-F和 PMDC43-GFP-R为引物，进行PCR检测。扩增体系为：1 μ L DNA模板，2. 5 μ LlO X PCR Buffer，2 μ L dNTP，1. 5 μ L 2. 5mmol · T1MgCl2, 5U · μ T1Taq 酶 0· 2 μ L，pMDC43-GFP-F 和 PMDC43-GFP-R各1 μ L，去离子水补足体积至25 μ L。扩增条件为：94°C预变性5min，94°C变 性lmin，58°C退火45s，72°C延伸lmin，30个循环；72°C延伸lOmin。扩增产物进行琼脂糖 凝胶电泳检测分析（如图4)。图4中可以看到，转CmWRKY48的植株均可扩增出片段大小为 263bp的条带，与阳性对照扩增得到的特异条带相同，而野生型植株没有扩增出条带。
[0099] 2)荧光定量RT-PCR检测
[0100] 提取抗潮霉素植株叶片及未转化株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，用荧光 定量RT-PCR对CmWRKY48基因的表达量进行检测。按照荧光定量试剂盒（SYBRr3 Green Real time PCR Master Mix-Plus-(QPK-212))说明书建立扩增体系，扩增条件：95°C Imin ; 95°〇158,601：158,721：458,40个循环。每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品 的(^值，以未转化植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况。特 异引物扩增出的片段长为136bp，引物序列为：
[0101] 上游引物 CmWRKY48-RT-F :序列如 SEQ ID NO. 8 所示，
[0102] 下游引物 CmWRKY48-RT-R :序列如 SEQ ID NO. 9 所示；
[0103] 以EFla扩增的基因片段为内标，片段长度为151bp，引物序列：
[0104] 上游引物EFl a -F :序列如SEQ ID NO. 10所示，
[0105] 下游引物EFl a -R :序列如SEQ ID NO. 11所示；
[0106] 根据荧光定量RT-PCR检测结果（图5)，与野生型相比，转CmWRKY48的植株株系基 因表达量有所提高，0X48-3、0X48-18、0X48-2、0X48-27株系表达量明显较高。证实内源基 因已经转入切花菊基因组DNA中并表达。
[0107] 由PCR、荧光定量RT-PCR检测呈阳性，获得转基因菊花株系。
[0108] (5)转基因植株后代的抗蚜性分析
[0109] 选取6-8叶龄的野生型菊花（WT)和转基因菊花（0X48)的扦插苗作为蚜虫处理的 材料。供试姆虫品种为菊姬长管姆（Macrosiphoniella sanborni)，选取两龄若虫作为接种 虫源。每株接种5头，每处理10株，重复3次。第7天开始统计，之后，每隔2d统计供试植 株上的蚜虫数量，连续统计2周。抗蚜性评价指标：蚜口密度抑制率（％) =(对照植株虫 数-转基因植株虫数）/对照植株虫数X100 ;平均蚜口密度抑制率（％)=转基因植株蚜 口密度抑制率之和/转基因株系数X 1〇〇。
[0110] 人工接种蚜虫试验表明转基因菊花幼苗对蚜虫密度有明显的抑制作用。如图6所 示，接种6天内，对照和转基因菊花的蚜口密度基本上没有变化。接种后8天起，对照和转 基因株系上的蚜口数开始增加，但是对照增加蚜口数量显著高于转基因株系。蚜虫接种后 14d，如图7所示，未转基因的菊花上蚜虫数量显著多于转基因菊花上的蚜虫数量。接种后 14天对不同株系的蚜虫数量进行统计，发现对照组蚜口数为起始蚜口数的17. 2倍，而转基 因株系0X48-3、0X48-18、0X48-2、0X48-27的蚜口数分别是起始蚜口数的10. 8倍、9. 4倍、 9.0倍、10.0倍，蚜口密度抑制率分别为37.21%、45.30%、47.67%、41.86%(表1)，此时 未转基因的菊花的平均蚜口数量为86头，而转基因株系上的平均蚜口数量仅为49头，转基 因菊花平均蚜口密度抑制率43. 02%。由此可见，转基因植株的蚜口密度显著低于非转化植 株，转基因株系具有显著的抗蚜性。
[0111] 表1蚜虫接种Hd后转基因菊花和野生型植株的虫口密度比较
[0112]
【权利要求】
1. 一种重组载体，其特征在于：该重组载体包括序列如SEQ ID NO. 1所示CmWRKY48基 因，通过DNA连接酶将CmWRKY48基因连接到载体。
2. 包括有权利要求1所述重组载体的转化细胞。
3. -种转CmWRKY48基因切花菊的培育方法，其特征在于：该方法以蚜虫高抗品种'南 农勋章'为材料获得抗蚜性基因CmWRKY48,通过酶切连接与植物表达载体pMDC43质粒进行 重组连接，通过农杆菌介导法将CmWRKY48基因导入菊花。
4. 一种转CmWRKY48基因切花菊的培育方法，其特征在于：该方法包括如下步骤： (1) 菊花CmWRKY48基因的克隆 以蚜虫高抗品种'南农勋章'叶片为材料，提取RNA并反转录成cDNA，根据序列信息设 计特异引物： 上游引物CmWRKY48-F :序列如SEQ ID NO. 2所示， 下游引物CmWRKY48-R :序列如SEQ ID NO. 3所示；获得CmWRKY48基因序列； 结合PCR扩增目的基因的全长序列，设计引物： 上游引物CmWRKY48-GATE-F :序列如SEQ ID NO. 4所示， 下游引物CmWRKY48-GATE-R :序列如SEQ ID NO. 5所示；在CmWRKY48基因的上游和下 游分别引入Sal I和Not I酶切位点，获得PCR产物； (2) 植物表达载体pMDC43-CmWRKY48的构建 将步骤（1)获得的PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5a感受态细胞，提取阳性 质粒pMD19-CmWRKY48,将提取的阳性质粒用Sal I和Not I双酶切得到CmWRKY48片段， 与Sal I和Not I双酶切的pENTR?lA连接，转化，提取阳性质粒pENTR?lA-CmWRKY48,经 Pvu I单酶切线性化后，与植物表达载体pMDC43质粒进行LR重组反应，转化，提取阳性质粒 pMDC43-CmffRKY48 ； (3) 农杆菌EHA105介导叶盘法转化菊花 将步骤⑵制备的阳性质粒pMDC43-CmWRKY48,加入感受态细胞EHA105,获得阳性克隆 农杆菌，通过叶盘法转化菊花，将CmWRKY48基因转入菊花中，获得转CmWRKY48基因切花菊。
5. 权利要求1所述的重组载体在培育抗蚜性菊花上的应用。
6. 权利要求2所述的转化细胞在培育抗蚜性菊花上的应用。
7. 权利要求3或4所述的转CmWRKY48基因切花菊的培育方法在抗蚜性转基因菊花株 系培育上的应用。
8. 通过权利要求3或4所述的培育方法获得切花菊在抗蚜性上的应用。
9. 转CmWRKY48基因切花菊的鉴定方法，其特征在于：该鉴定方法将转CmWRKY48基因 初步获得的抗性植株进行PCR鉴定、荧光定量RT-PCR分子检测，筛选阳性植株，获得转基因 菊花株系； 具体包括如下步骤： (l)PCR检测 提取取生根筛选得到的潮霉素抗性待检测植株基因组DNA，将GFP基因作为检测目标， 根据GFP基因两端合成扩增反应引物，扩增出的片段长为263bp，引物序列为： 上游引物PMDC43-GFP-F :序列如SEQ ID NO. 6所示， 下游引物PMDC43-GFP-R :序列如SEQ ID NO. 7所示； 分别以潮霉素抗性植株和未转化植株DNA为模板，以pMDC43-GFP-F和pMDC43-GFP-R 为引物，进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析； (2)荧光定量RT-PCR检测 提取抗潮霉素植株叶片及未转化株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，建立荧光定量 RT-PCR扩增体系，每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的CT值，以未转化植株的 表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况；特异引物扩增出的片段长 为136bp为阳性结果，引物序列为： 上游引物CmWRKY48-RT-F :序列如SEQ ID NO. 8所示， 下游引物CmWRKY48-RT-R :序列如SEQ ID NO. 9所示； 以EFla扩增的基因片段为内标，片段长度为151bp为阳性结果，引物序列： 上游引物EF1 a -F :序列如SEQ ID NO. 10所示， 下游引物EF1 a -R :序列如SEQ ID NO. 11所示； 由PCR、荧光定量RT-PCR检测呈阳性，确定获得转基因菊花株系。
【文档编号】A01H5/00GK104372019SQ201410569007
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月22日 优先权日:2014年10月22日
【发明者】陈发棣, 李佩玲, 宋爱萍, 王海滨, 陈素梅, 张飞, 赵爽, 蒋甲福 申请人:南京农业大学