名为KI4537的万寿菊近交系的制作方法

本申请要求于2014年12月16日提交的美国专利申请系列号62/092,572的优先权，并通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明一般涉及万寿菊(marigold)(tageteserecta)的纯合近交系，更具体地说，涉及产生大量叶黄质(xanthophylls)(特别是叶黄素(lutein)并且具有雄性可育花的称为ki4537的万寿菊品系。

背景技术：

叶黄质是黄色色素，其形成类胡萝卜素组的两个主要分支之一。它们的分子结构类似于形成另一种主要的类胡萝卜素组分支的胡萝卜素，但是叶黄质含有氧原子，而胡萝卜素是没有氧的纯烃。叶黄质含有它们的氧作为羟基和/或作为桥作用的被氧原子取代的氢原子对(环氧化物)。

像其他类胡萝卜素一样，叶黄质在大多数绿色植物的叶和/或花中被发现含量最高，在那里它们起到调节光能的作用。在动物身体和膳食动物产品中发现的叶黄质最终源自于饮食中的植物来源。例如，鸡蛋黄、脂肪和皮肤的黄色来自摄入的叶黄质(主要是叶黄素，其通常为此目的被添加到鸡饲料中)。

眼睛视网膜中的人黄斑(maculalutea)的黄色来自其包含的叶黄素和玉米黄质，两种叶黄质还是需要人类饮食中的来源以存在于眼睛中。它们吸收蓝光起到防止电离蓝光的功能。

叶黄质组包括(在许多其他化合物中)叶黄素、玉米黄质、新黄质、紫黄质以及α-和β-隐黄质。

有兴趣开发具有高水平叶黄质的产品。例如，已知叶黄质具有抗氧化性质并已被证明可预防年龄相关性黄斑变性(amd)。

万寿菊花是最有商业价值的叶黄质的重要来源。用于生产叶黄质的大多数万寿菊植物由通过雄性品系和雌性品系杂交的杂交种子生长而成。因此，具有高水平的叶黄质的万寿菊的雄性和/或雌性品系可被用于产生杂交种子，所述杂交种子可用于生长具有升高的叶黄质水平的杂交万寿菊植物，从而改善为商业市场生产叶黄质的经济，特别是当杂交植物具有能够可靠收获的大生物量的花时。

发明概述

本发明由一种名为ki4537的万寿菊(tageteserecta)植物组成，其具有升高的叶黄质水平、可育的雄花、优秀的活力和整体的农艺稳健性。ki4537是独特的万寿菊近交系，其携带类胡萝卜素途径中的突变，该突变导致在花瓣组织中以干重为基础计大于40mg/g的叶黄素含量。所述突变是部分显性的，并且因此能使得通过仅一个基因剂量就使杂交种的所述叶黄素含量提高50％。如果所述突变被渐渗(introgressed)进相容的雌性近交亲本中，以干重为基础计，所得的杂交种预期相对于市售的杂交种具有叶黄素含量>40mg/g，市售的杂交种通常平均具有20mg/g的叶黄素。

没有在所有可能的环境条件下观察ki4537品种的植物。表型可能随环境和培养中(例如温度、光强度、日长、水状态和/或肥料比率或类型)的变化而稍微变化，但不存在基因型的任何差异。

本发明的一个目的是具有高水平叶黄素的万寿菊植物，用作人和动物食品、饮料和个体护理产品中的抗氧化剂。

本发明的另一个目的是一种万寿菊近交系，其是新颖的、稳定的和一致的，并且具有良好的农学特性，其赋予其后代叶黄素过度积累的性状。

附图简述

图1是雄性近交系ki4537的开发过程方案。

图2是m3至m6代ki4537中叶黄素含量分离的图表。

发明详述

本文使用的术语“m”代是暴露于诱变剂的种子(和所得的植物)，“m2”是自花授粉的m1植物的子代，“m3”是挑选的单一的自花授粉的m2植物的子代，并依此类推。术语“子代”是指来自上一代的自交植物产生的所有后代的植物和种子。

实施例1-ki4537的开发

从基于化学突变育种和研究计划中鉴定出ki4537。在2009年6月，以优化的剂量和持续时间，用ems(sigmachemicals，st.louis)处理市售的开放授粉品种“scarletade”的种子。命名为m1代的经处理的种子在专有的温室中生长。m1植物在隔离中自交以从每个m1植物产生m2种子。

每个m2种子生长以产生m2开花植物。收集来自每个m2植物的花，冷冻干燥并用基于hplc的工业标准aoac方法定量类胡萝卜素水平。简言之，用30mlheat萃取溶剂(己烷、乙醇、丙酮和体积比为10:6:7:7的甲苯)和2ml40％甲醇氢氧化钾(w/v)在56℃水浴中，以120rpm摇动20分钟，提取并皂化0.5-1g经研磨的花瓣样品。萃取液在hplc中用waterssphersorbcn柱(50×4.6mm，3μm)分析。使用流动相为己烷(74.6％)、二氯甲烷(24.9％)、甲醇(0.4％)、n,n-二异丙基乙胺(0.1％)以1.000ml/min的流速进行等度洗脱。柱温保持在25℃，注入10μl样品，每次测定运行13分钟。二极管阵列检测器(dad)设置在446nm。使用标准方法定量叶黄素和玉米黄质。

ki4537作为具有深橙色花的m2植物被鉴定，与雄性品系scarletade相比，其叶黄素含量显著增加。如图1所示，使用单籽传法(single-seeddescent)程序将ki4537从m2推进至m7期。简单地，作为单一m2植物鉴定的ki4537，在隔离中天然自花授粉以产生m3种子。从m3种子产生八十株m3植物，并使用aoac方法定量花中的叶黄素和玉米黄质含量。基于类胡萝卜素谱(carotenoidprofile)，选择具有最高叶黄素含量的2-3株m3植物，并且在隔离中天然自花授粉以产生m4种子。使用相同的程序，ki4537从m2推进至m6代产生m7种子。

m3到m6代中叶黄素的分离。ki4537的m3到m6代的分离模式如图2所示。在野生型scarletade中观察到的平均叶黄素水平平均为25.5±3.7mg/g。在ki4537中连续5代单籽传法(从m2到m6)繁殖后，随后对每代的每个子代的花进行类胡萝卜素分析，观察到叶黄素含量稳定并显著的增加。从m4代之后，每代ki4537中的几个子代显示出更高的叶黄素含量(图2)。表现出更高叶黄素含量的子代的频率和数量随着每一代的自交而增加。平均叶黄素含量从m2代的28.6±3.3mg/g增加到m6代的39.4±2.8mg/g。与m6代(35-46mg/g)相比，m3(12.7-29mg/g)叶绿素含量的分离要宽得多(表1)。在高自交代中类胡萝卜素谱的分离模式是近交背景下性状稳定程度的指标。在m7阶段，ki4537是具有理论预期≤1％的残留杂合度的自交系。

表1：与scarletade相比，ki4537中的叶黄素含量

根据本发明的一个方面，提供了名为ki4537的近交万寿菊种子及其植物。本发明进一步涉及用于生产近交万寿菊种子的方法，其包括但不限于以下步骤，将近交万寿菊ki4537的种子种植在其本身或来自相同家族或品系的不同种子的附近，生长所得万寿菊植物，对所得万寿菊植物交叉授粉，以及使用农业领域中的标准技术收获从这种近交植物获得的所得种子，例如将有必要积累大量(bulk-up)种子(例如用于生产杂交种)。本发明还涉及通过这种方法生产的近交种子。

在近交万寿菊植物ki4537和另一近交万寿菊植物之间的任何杂交中，ki4537可能被指定为雄性(花粉亲本)或雌性(种子亲本)。本发明还涉及万寿菊植物，其表达近交万寿菊植物ki4537的基本上所有生理和形态特征，并且涉及具有近交万寿菊植物ki4537的所有生理和形态特征的万寿菊植物的基本均质的群体。由近交万寿菊植物ki4537生产的任何万寿菊植物在本发明中考虑，并且因此属于本发明的范围内。万寿菊植物ki4537的生理和形态特征的描述如表2所示。

本领域普通技术人员应当理解，对于表2中所示的定量特征，所给出的值是典型值。这些值可能由于环境而变化，并且因此基本等同的其他值也在本发明的范围内。

对于表2描述的性状，近交万寿菊系ki4537在环境影响范围内显示出一致性和稳定性。近交ki4537已经被自花传粉了足够的代数，并且仔细注意了植物类型的一致性以确保大规模使用、商业化生产所必须的纯合性和表型稳定性。该品系已经在隔离的田野中手工增殖，并持续观察一致性。在ki4537中没有观察到或预期有变异性状。

本发明的植物具有分类学描述为属于万寿菊属(tagetes)，万寿菊种(erecta)，菊科(asteraceae)和通用名万寿菊。表2列出了取自夏季在得克萨斯州赫里福德(hereford,texas)的温室里生长的植物的该植物性状的描述。表2列出了ki4537的特征性状，表3列出了表2性状的定义。

表2-ki4537在营养和开花期的特征

表3-营养和开花特征的描述。

在一个实施方案中，植物ki4537产生叶黄素，其包含大于26mg/g干重叶黄素，并且优选大于40mg/g干重叶黄素。

本发明涉及新颖的、稳定的万寿菊近交系的开发。该品系是独特的，且与所有其他现有的万寿菊品种明显不同。ki4537系具有可育的雄花，并且特别适合用作与雌性植物杂交以产生杂种种子的雄性近交系，所述杂种种子将导致具有叶黄素高的植物组织(特别是花瓣)的植物。ki4537中存在的突变是部分显性的，并且因此能通过仅一个基因剂量就使得杂交种的叶黄素含量提高50％。如果所述突变被渐渗进相容的雌性近交亲本中，以干重为基础计，所得的杂交种预期相对于市售的杂交种具有叶黄素含量>40mg/g，市售的杂交种通常平均具有20mg/g的叶黄素。

可以使用各种育种方案从ki4537生产新的近交万寿菊品系。在一种通常被称为系谱法(pedigreemethod)的方法中，ki4537可以与另一种不同的万寿菊植物杂交(例如第二近交亲本万寿菊植物)，其或者本身表现出一种或多种选定的期望特征或者赋予选定的期望特征到杂交种组合。可能期望的特征的实例包括更大的花产量、更高的叶黄素含量、减少的作物成熟时间、更好的农学品质、对杀虫剂、除草剂、害虫、热和干旱以及疾病的抗性和/或耐受、以及发芽时间、成苗率(standestablishment)、生长速度、成熟期和花朵尺寸的一致性。如果两个原始亲本万寿菊植物没有提供所有期望的特征，那么其他来源可以被包括在育种群体中。良种近交系，即纯种繁育的、纯合的近交系，也可用作育种的起始材料或用于开发自交系的来源群体。

此后，收获所得的种子，并且挑选所得的优秀子代植物并在随后的世代自交或同胞交配(sib-mated)例如约5至约7代或更多世代，直到产生对基本上所有与近交亲本不同的因素不再分离的一代，从而提供了大量独特的、纯种繁育的自交系。

在产生新的近交万寿菊植物的另一个实施方案中，通常称为回交，通过将ki4537植物(称为轮回亲本)与另一种携带编码感兴趣的特定性状的基因的万寿菊植物(称为供体或非轮回亲本)杂交以产生f1子代植物，可将一或多种期望的性状引入近交亲本万寿菊植物ki4537。显性和隐性等位基因均可通过回交转移。供体植物也可能是近交系，但在最广泛的意义上可以是任何与轮回亲本杂交可育的植物品种或群体的成员。接下来，选择具有期望性状的f1子代植物。然后，将所挑选的子代植物与ki4537杂交以产生回交子代植物。此后，选择包含所述期待的性状以及万寿菊近交系ki4537的生理和形态特征的回交子代植物。该循环重复约1至约8个循环，优选连续进行约3次或更多次以产生挑选的更高回交子代植物，其包含期望的性状和表2所列的在相同环境条件下生长时在5％显著性水平下确定的万寿菊近交系ki4537的所有生理和形态特征。示例性的期望的性状包括抗虫性、除草剂抗性、产量稳定性、产量增加和对细菌、真菌和病毒性疾病的抗性。植物育种领域的普通技术人员将理解，育种者使用各种方法来帮助确定哪些植物应该从分离群体中被挑选，并且最终使用哪些近交系来开发用于商业化的杂交种。除了种质知识和种植者使用的其他技能之外，挑选过程的一部分取决于实验设计以及统计分析的使用。实验设计和统计分析用于帮助确定哪些植物、哪个植物家族以及最终哪些近交系和杂交组合在一或多种感兴趣的性状上显著更好或不同。实验设计方法用于评估误差，从而可以更准确地确定两个近交系或两个杂交系之间的差异。统计分析包括平均值的计算、差异来源的统计学显著性的确定以及适当方差分量的计算。通常使用5％或1％的显著性水平来确定给定性状发生的差异是否为真实的还是由于环境或实验的误差。植物育种领域的普通技术人员将知道如何评估两个植物品种的性状，以确定这些品种表达的两个性状之间是否没有显著差异。可以使用平均特征性状值来确定性状差异是否显著，并且优选在相同环境条件下生长的植物上测量所述性状。

当然，另一种万寿菊植物可能是轮回亲本，因此与ki4537中高叶黄素值相关的突变在上述过程之后转移入所述轮回亲本。预期在与ki4537的杂交中使用这样的近交系将导致以干物质为基础计的具有大于40mg/g叶黄素的杂交万寿菊植物。

这种方法导致近交万寿菊植物的产生，其具有所述轮回亲本基本上所有期望的形态和生理特性和特定的被转移的感兴趣的性状。因为这种近交万寿菊植物对于控制所述转移的感兴趣的性状的基因座是杂合的，因此最后的回交代将随后被自交以为纯种繁育的子代提供所述转移的性状。

本领域普通技术人员应当理解，当近交系ki4537与另一种万寿菊植物杂交，回交可与系谱育种相结合，所得子代被杂交回近交系ki4537，此后，单一回交的所得子代随后自交以开发新的近交系。回交和系谱育种的这种组合例如当期望恢复少于常规回交会获得的所有ki4537特征时是有用的。

一旦近交系被创建，下一步是确定所述近交系是否有任何价值。这是通过测量新近交植物的组合能力以及品系本身的性能的技术来实现的。组合能力是指当与其他品系杂交以形成杂交种时一个品系作为亲本的贡献。特异性组合能力(sca)是指一个品系与另一个特定近交杂交形成杂交种的能力。一般组合能力(gca)是指一个品系与广泛的品系杂交形成杂交种的能力。形成杂交种以评估自交系作为亲本的贡献用于挑选优秀品系的方法可以互换地称为实验性杂交、顶交或测试杂交。

根据本发明的方法，将具有近交系ki4537作为亲本的杂交植物与其本身或任何不同的万寿菊植物(如近交万寿菊植物或杂交万寿菊植物)杂交以开发新的近交系。例如，具有近交万寿菊植物ki4537作为亲本的杂交万寿菊植物可被近交，即与自身杂交或同胞授粉(sib-pollinated)，并且所得子代各自自交约5至约7代或更多代，由此提供一组独特的纯种繁育近交系，其中每个品系从具有作为亲本的万寿菊植物ki4537的杂交万寿菊植物中接收所有等位基因。在其他实施方案中，具有近交万寿菊植物ki4537作为亲本的杂交万寿菊植物与不同的万寿菊植物杂交，从而提供一组独特的纯种繁育近交系，所述不同的万寿菊植物可以包括不是近交万寿菊植物ki4537的任何近交万寿菊植物，任何不具有ki4537作为亲本的杂交万寿菊植物、另一种质来源、诱导突变的原种(stock)或性状供体植物。然后可将所得的近交系与其他近交系或非近交系杂交，并分析所得近交子代的有益特征。以这种方式，可以鉴定出赋予期望特征的新的近交系。

在本发明的另一方面，提供了用于产生万寿菊种子或植物的方法，该方法通常包括将第一亲本万寿菊植物与第二亲本万寿菊植物杂交，其中所述第一亲本万寿菊植物或第二亲本万寿菊植物中的至少之一是近交亲本万寿菊植物ki4537。在本发明的一些实施方案中，所述第一近交万寿菊植物是ki4537并且是雌性的，在其它实施方案中，所述第一近交万寿菊植物是ki4537并且是雄性的。这些方法可作为制备杂交万寿菊种子或植物的方法进一步被列举，其中第一近交万寿菊植物与不同的、独特品种的第二万寿菊植物杂交，以提供具有近交万寿菊植物品系ki4537作为其亲本之一的杂交种。在这种情况下，选择与所述第一近交系杂交组合时赋予期望特征的第二近交系。在这些过程中，杂交将导致种子的产生。无论种子是否被收集，种子的产生都会发生。

任何时候当近交万寿菊植物ki4537与另一不同的近交植物杂交，产生第一代(f1)万寿菊杂交植物。因此，可以通过将ki4537与任何第二近交万寿菊植物杂交来产生f1杂交万寿菊植物。因此，用ki4537作为亲本产生的任何f1杂交万寿菊植物或万寿菊种子是本发明的一部分。

当近交万寿菊植物ki4537与另一近交植物杂交以产生杂交种时，原近交种可以作为母本或父本植物，其基本上具有在杂交种中的相同的特征。偶尔，母本遗传的特征可能会根据哪个亲本作为雌性使用的决定而有所不同。然而，通常亲本植物之一由于增加的叶黄素产量和优选的生产特性而优选作为母本植物。通常优选使用ki4537作为雄性亲本。

为了做出推进杂交的决定，杂交种不需要比所有其他杂交种更好。相反，必须在至少一些为某些应用或市场创造价值的性状中显示出显著的改进。尽管与现有的商业杂交种具有相似竞争力，但由于将新型杂交种投放市场的成本要求新产品显著改善已有的产品，所以淘汰了一些测交杂交种。

使用近交万寿菊植物ki4537作为亲本产生的所有植物都在本发明的范围内，包括衍生自近交万寿菊植物ki4537的植物。这包括实质上衍生自近交ki4537，具有在植物品种保护法美国法典第7章第2104(a)(3)条(7u.s.c.§2104(a)(3))中赋予其含义的术语“实质性派生品种”的植物，该定义通过引用并入本文。这还包括子代植物及其部分，其至少一个祖先是近交万寿菊植物ki4537，更具体地说，其中该子代的系谱包括对近交万寿菊植物ki4537或具有ki4537作为祖先的植物的1、2、3、4和/或5次或交叉授粉。本领域具有普通技术的所有育种者都保持其育种计划的系谱记录。这些系谱记录包含育种过程的详细说明，包括在育种过程中使用的所有亲本品系的列表以及如何使用该品系的信息。因此，育种者将知道ki4537是否被用于子代品系的开发，并且还将知道在任何子代品系的开发中，对除了ki4537之外的品系进行多少次育种杂交。如此开发的子代品系然后可以用于与其他不同的万寿菊近交系杂交，以产生具有优秀特征的第一代f1万寿菊杂交种子和植物。

因此，本发明的另一方面是用于产生近交万寿菊品系ki4537-衍生的万寿菊植物的方法。该用于产生ki4537-衍生的万寿菊植物的方法包括：(a)将近交万寿菊植物ki4537与第二万寿菊植物杂交以产生子代万寿菊种子；和(b)生长所述子代万寿菊种子(在植物生长条件下)，以产生所述ki4537-衍生的万寿菊植物。这样的方法可以进一步包括以下步骤：(c)将ki4537-衍生的万寿菊植物与其本身或另一万寿菊植物杂交，以产生额外的ki4537-衍生的子代万寿菊种子；(b)生长步骤(d)的所述子代万寿菊种子(在植物生长条件下)，以产生额外的ki4537-衍生的万寿菊植物；以及(e)重复(c)和(d)的杂交和生长步骤0至7次，以产生进一步的ki4537-衍生的万寿菊植物。此外，这可以包括利用单倍体育种方法和植物组织培养方法来衍生ki4537-衍生的万寿菊植物的子代。

随着允许分离和表征编码特定蛋白质产物的基因的分子生物学技术的出现，植物生物学领域的科学家们对工程化植物基因组以包含和表达外来基因，或添加或修饰天然版本或内源基因(可能由不同的启动子驱动)以特定方式改变植物的性状产生了浓厚的兴趣。这些外来的、添加的和/或修饰的基因在本文中统称为“转基因”。本发明在具体实施方案中也涉及所要求保护的近交万寿菊品系ki4537的转化形式，其含有一或多个转基因，特别是编码除草剂抗性的基因。

已经开发出许多用于植物转化的方法(包括生物的和物理的植物转化方案)(参见例如，miki等人在methodsinplantmolecularbiologyandbiotechnology上的proceduresforintroducingforeigndnaintoplants”，glick，b.r.和thompson，j.e.出版(crcpress，inc.，bocaraton，1993)第67-88页)。此外，还提供用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达载体和体外培养方法(参见，例如，gruber等人在methodsinplantmolecularbiologyandbiotechnology上发表的“vectorsforplanttransformation”，glick，b.r.和thompson，j.e.出版(crcpress，inc.，bocaraton，1993)第89-119页)。

上述转化方法通常被用于生产转基因近交系。然后可以用另一(非转化或转化)近交系与转基因近交系杂交，以产生转基因杂交万寿菊植物。或者，使用前述转化技术被工程化至特定万寿菊品系的遗传性状可以使用植物育种领域中熟知的传统回交技术转移到另一品系中。例如，可以使用回交方法将工程化的性状从公开的非良种品系转移进良种品系中，或者从其基因组中含有外来基因的杂交万寿菊植物转移进不包含该基因的一或多个品系中。

除了表型观察之外，植物也可以通过其基因型来描述。植物的基因型可以通过遗传标记谱(geneticmarkerprofile)描述，其可以鉴定相同品种、相关品种的植物，或用于确定或验证系谱。遗传标记谱可以通过诸如限制性片段长度多态性(rflp)、随机扩增多态性dna(rapd)、任意引物聚合酶链反应(ap-pcr)、dna扩增指纹(daf)、序列特征扩增区域(scars)、扩增片段长度多态性(aflp)、也称为微卫星的简单序列重复(ssr)和单核苷酸多态性(snp)、同工酶电泳和等电聚焦。

用于这些目的的特定标记物不限于本文所公开的标记组，而是被设想为包括提供区分品种的手段的任何类型的遗传稳定的标记和标记谱。除了用于鉴定近交亲本，通过使用ki4537或其亲本产生的杂交种，以及通过使用ki4537产生的子代植物的系谱的鉴定或验证，遗传标记谱也可用于育种和开发回交转换(backcrossconversion)。

保藏信息

申请人已向位于美国，弗吉尼亚20110，马纳萨斯，10801universityofboulevard的美国典型培养物保藏中心(atcc)存入至少2500粒近交万寿菊品系ki4537的种子，atcc保藏号pta-121863。所述种子在本申请提交之日以前从凯敏工业公司保管的保藏中取出，由atcc于2014年12月16日收到。在申请未决的过程中，一经要求，该保藏向专利和商标专员(commissionerofpatentsandtrademarks)以及由专员确定的有权使用的人员开放。在本申请的任何权利要求得到授权后，申请人将根据37c.f.r.§1.808向公众开放该保藏。万寿菊近交系ki4537的该保藏将被保存在作为公共保藏处的atcc保藏处保藏，为期三十年、或最近的要求之后的5年、或专利有效期内(以较长者为准)，如果在此期间失活则将被替换。此外，申请人已经或将会满足37c.f.r.§§1.801-1.809的所有要求，包括提供样品在保藏时的存活证明。申请人无权宣布放弃法律推行的任何对生物材料转让或其商业运输的限制。

前面的描述和附图包括本发明的说明性实施方案。前述实施方案和本文描述的方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而变化。仅以一定顺序列举方法的步骤不构成对该方法的步骤的顺序的任何限制。前面的描述和附图仅仅解释和说明本发明，并且本发明不限于此，除非是权利要求如此限制。本领域技术人员了解了前面的公开内容后将能够在不脱离本发明的范围的情况下进行修改和变化。