本发明属于皮肤精原细胞保存的技术领域，特别涉及一种皮肤精原细胞保护液。
背景技术：
目前我国的临床和细胞研究实验中，细胞的采集、长期保存和使用是时空分离的，采集的细胞离体后对外部环境的要求非常苛刻，特别是细胞采集与长期保存之间的细胞转运时，由于细胞还没有经过长期保存处理，外部环境不好会降低细胞活力，因此细胞采集后立即加入保护液来保持细胞的活力成了一个很重要的课题。因为采集的细胞无论是培养增殖或者保存最终都会进入人体血液，所以添加的保护液一方面要求可以保持细胞离体后在体外的活力，另一方面，还要求保护液中不能有不适宜静脉注射的成分，特别是致敏成分。
常规的细胞保护液是生理盐水，方便安全，缺点是保护效果不好，专利文献cn101919380a报道，用生理盐水保护间充质干细胞，2小时后间充质干细胞活力就会降低10％左右，因此生理盐水只适用于间充质干细胞的即时保存。
对于离体皮肤精原细胞的保存可以分为，几天以上几个月甚至几年、几十年的长时间的保存，一般采用液氮超低温保存，细胞需要预处理，加入甘油或者dmso等防结晶的保护剂；另一种是几小时到几天之内的短时间的临时保存，目前研究的比较少，细胞临时保存的保护液，一般是生理盐水或者培养基中引入生长因子等。发明人在采集皮肤精原细胞采集盒转运过程中，还发现一般采集过程都是把25ml的细胞或者更多体积的细胞与保护液混合装在试管中静置保存。一个容易忽视的问题，就是皮肤精原细胞在一个细长的试管中细胞的供氧问题。皮肤精原细胞需要一个低氧的环境，氧气缺乏和供应过量都会对皮肤精原细胞活力产生影响。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提出了一种皮肤精原细胞保护液，除了对保护液中一般培养基组分和抗生素的筛选、优化，该保护液还可以为皮肤细胞或精原细胞提供低氧环境，同时引入抗氧化剂可起到保持细胞活率的效果。因为保护液所保护的皮肤细胞或精原细胞最终是要用于人的，因此除非必要，尽量选择人体血液中已经存在的组分，尽量避免外源物质的引入。
本发明公开的皮肤精原细胞保护液，具体技术方案如下：
一种皮肤精原细胞保护液，所述保护液主要是将氨基糖苷类抗生素用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液溶解所述氨基糖苷类抗生素50-200单位，所述dmem培养基水溶液的浓度为10-25g/l。
优选的，所述氨基糖苷类抗生素选自庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星或妥布霉素中的一种或多种。
优选的，所述氨基糖苷类抗生素为重量份数比为10:2:2的庆大霉素、卡那霉素和妥布霉素的混合物，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
优选的，所述保护液还包括氧合血红蛋白，每毫升所述dmem培养基水溶液溶解所述氧合血红蛋白400-1000μg。进一步优选的，每毫升所述dmem培养基水溶液溶解所述氧合血红蛋白600μg。
优选的，所述保护液还包括抗氧化剂，每毫升所述dmem培养基水溶液溶解所述抗氧化剂0.1-1.0μmol。
优选的，所述抗氧化剂为维生素c、维生素e或谷胱甘肽中的一种或多种。进一步优选的，所述抗氧化剂为重量份数比为1：1的维生素e和谷胱甘肽的混合物。
优选的，所述保护液还包括吐温80、棕榈酰胺、海藻酸钾和月桂酰肌氨酸，每毫升所述dmem培养基水溶液分别溶解所述吐温800.1-1.0μg、棕榈酰胺20-80μg、海藻酸钾10-50μg、月桂酰肌氨酸100-200μg。
优选的，所述保护液还包括柠檬酸、丙酮酸、延胡索酸和乙酰辅酶a，每毫升所述dmem培养基水溶液分别溶解柠檬酸1-10μg、丙酮酸50-80μg、延胡索酸10-20μg和乙酰辅酶a80-150μg。
dmem培养基中含有皮肤细胞或精原细胞生长代谢所需的糖类、氨基酸、无机盐和维生素等物质，对于维持细胞渗透压及活力有较好的作用。本发明优选了抗菌效果好、性质稳定、适于保护需要注入人体的皮肤细胞或精原细胞的氨基糖苷类抗生素，并优选了四种抗生素庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星或妥布霉素。抗生素的选择不但具有抗菌效果，更重要的是不会对保存的细胞活力产生影响。
在保护液内加入氧合血红蛋白可以为保护液提供低氧氧气来源，进而提高皮肤细胞或精原细胞的保存活率。
在保护液内加入抗氧化剂可以为保护液提供抗氧化保护。
在保护液中加入吐温80、棕榈酰胺、海藻酸钾和月桂酰肌氨酸的混合物可以改善保护液内的氧气传递和物质交换，提高皮肤细胞或精原细胞的活率。
在保护液中加入柠檬酸、丙酮酸、延胡索酸和乙酰辅酶a可以为保存的细胞进一步提供能量，可以延长对皮肤细胞或精原细胞的保存时间。
不同于一般培养基中添加的血红蛋白作为营养物质，本发明的氧合血红蛋白主要作用是作为低浓度的氧气供应物质，皮肤细胞或精原细胞起初消耗的是溶液中物理溶解的氧气，随着氧分压下降和二氧化氮浓度的提高，逐步可以从氧合血红蛋白获得氧气。添加的人血液中天然存在的抗氧化剂不同于一般意义上的保护细胞抗氧化，而是作为一个氧气供应过量的平衡保护。
配置保护液时，先配置dmem培养基水溶液，然后加入氨基糖甙类抗生素，还可以加入氧合血红蛋白、人血液中天然存在的抗氧化剂、吐温80、棕榈酰胺、海藻酸钾、月桂酰肌氨酸、柠檬酸、丙酮酸、延胡索酸和乙酰辅酶a，过滤除菌，存储于4℃冰箱。使用时与刚采集的皮肤细胞或精原细胞按1:1体积比例混合。
皮肤精原细胞保护液与皮肤细胞或精原细胞的混合液可以临时存储于4℃冰箱或者转运过程中存储于含有冰盒的、并且保障温度低于4℃的密闭容器内。
本发明的提供的皮肤精原细胞保护液为皮肤细胞或精原细胞提供了适宜和稳定的保存环境，其更接近体内环境，可以显著提高皮肤细胞或精原细胞保存后的细胞活率。
具体实施方式
实施例1
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液溶解庆大霉素100单位，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
实施例2
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将卡那霉素用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液溶解卡那霉素100单位，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
实施例3
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将阿米卡星用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液溶解阿米卡星100单位，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
实施例4
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、卡那霉素和妥布霉素用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、卡那霉素20单位、妥布霉素20单位，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
实施例5
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将妥布霉素用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液溶解妥布霉素100单位，所述dmem培养基水溶液的浓度为10.0g/l。
实施例6
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液溶解庆大霉素100单位，所述dmem培养基水溶液的浓度为25.0g/l。
实施例7
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素和氧合血红蛋白用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、氧合血红蛋白400μg，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
实施例8
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素和氧合血红蛋白用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、氧合血红蛋白600μg，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
实施例9
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素和氧合血红蛋白用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、氧合血红蛋白1000μg，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
实施例10
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素和维生素e用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、维生素e0.1μmol，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
实施例11
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、维生素e和谷胱甘肽用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、维生素e0.3μmol、谷胱甘肽0.3μmol，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
实施例12
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、氧合血红蛋白、维生素e和谷胱甘肽用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、氧合血红蛋白600μg、维生素e0.25μmol、谷胱甘肽0.25μmol，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
实施例13
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、氧合血红蛋白、维生素c和维生素e用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、氧合血红蛋白600μg、维生素c0.5μmol、维生素e0.5μmol，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
实施例14
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、吐温80、棕榈酰胺、海藻酸钾和月桂酰肌氨酸用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、吐温800.5μg、棕榈酰胺80μg、海藻酸钾50μg、月桂酰肌氨酸100μg，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
实施例15
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、氧合血红蛋白、吐温80、棕榈酰胺、海藻酸钾和月桂酰肌氨酸用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、氧合血红蛋白600μg、吐温801.0μg、棕榈酰胺20μg、海藻酸钾10μg、月桂酰肌氨酸200μg，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
实施例16
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、氧合血红蛋白、维生素e、谷胱甘肽、吐温80、棕榈酰胺、海藻酸钾和月桂酰肌氨酸用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、氧合血红蛋白600mg、维生素e0.25μmol、谷胱甘肽0.25μmol、吐温800.5μg、棕榈酰胺60μg、海藻酸钾30μg、月桂酰肌氨酸150μg，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
实施例17
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、柠檬酸、丙酮酸、延胡索酸和乙酰辅酶a用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液溶解分别庆大霉素100单位、柠檬酸10μg、丙酮酸80μg、延胡索酸10μg和乙酰辅酶a80μg，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
实施例18
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、氧合血红蛋白、维生素e、谷胱甘肽、柠檬酸、丙酮酸、延胡索酸和乙酰辅酶a用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、氧合血红蛋白600μg、维生素e0.25μmol、谷胱甘肽0.25μmol、柠檬酸1μg、丙酮酸50μg、延胡索酸20μg和乙酰辅酶a150μg，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
实施例19
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、氧合血红蛋白、维生素e、谷胱甘肽、吐温80、棕榈酰胺、海藻酸钾、月桂酰肌氨酸、柠檬酸、丙酮酸、延胡索酸和乙酰辅酶a用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、氧合血红蛋白600μg、维生素e0.25μmol、谷胱甘肽0.25μmol、吐温800.5μg、棕榈酰胺60μg、海藻酸钾30μg、月桂酰肌氨酸150μg、柠檬酸4μg、丙酮酸60μg、延胡索酸15μg和乙酰辅酶a120μg，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
对照例1
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将青霉素用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液溶解青霉素100单位，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
对照例2
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素和转铁蛋白用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、转铁蛋白400μg，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
对照例3
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、维生素e和谷胱甘肽用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、维生素e0.1μmol、谷胱甘肽0.9μmol，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
对照例4
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、司盘80、棕榈酰胺、海藻酸钾和月桂酰肌氨酸用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、司盘800.5μg、棕榈酰胺80μg、枸橼酸钾50μg、月桂酰肌氨酸100μg，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
对照例5
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、吐温80、棕榈酰胺和海藻酸钾用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、吐温800.5μg、棕榈酰胺80μg、海藻酸钾50μg，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
对照例6
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、柠檬酸钾、丙酮酸钠、延胡索酸和乙酰辅酶a用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、柠檬酸钾10μg、丙酮酸钠80μg、延胡索酸10μg和乙酰辅酶a80μg，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
对照例7
一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、柠檬酸、丙酮酸和延胡索酸用dmem培养基水溶液溶解而成，每毫升所述dmem培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、柠檬酸10μg、丙酮酸80μg和延胡索酸10μg，所述dmem培养基水溶液的浓度为16.9g/l。
试验例1
取存储于4℃冰箱的灭菌保护液，与刚采集的皮肤细胞或精原细胞按1:1体积比例混合均匀，置于4℃环境，不同的时间点各采样一次，以mtt法测定细胞活力，以第一次取样的活力为100％。
本组试验主要考察氨基糖苷类抗生素和dmem浓度的影响，以对照例1保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞为对照1组，以实施例2-6保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞为实验1-5组，各实验组和对照组的皮肤细胞和精原细胞分别在24h后进入试验程序，调整皮肤细胞和精原细胞的密度均为1×106cells/ml。按细胞悬液：0.4％台盼蓝＝3:1(v:v)充分混匀，取20μl细胞悬液加入细胞计数板中，用countstar细胞计数器检测各实验组和对照组保护液内表皮干细胞和精原干细胞的活率，结果如表1所示。
表1试验例1各实施例与对照例的细胞活率结果
由表1可知，实施例1-6的保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率要比使用对照例1组使用的保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率高；实施例4使用的保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率要比使用实施例1-3、5-6使用的保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率高。
由此得出，本发明提供的保护液中的氨基糖苷类抗生素换成了青霉素等抗生素后，皮肤细胞或精原细胞的活率显著降低，并且氨基糖苷类抗生素采用庆大霉素、卡那霉素和妥布霉素的混合物后，保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率更高。
试验例2
本组试验主要考察氧合血红蛋白的影响，以对照例2保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞为对照2组，以实施例1、7和8保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞为实验7-9组，检测过程如试验例1，保存24h后的检测结果如表2。
表2试验例2各实施例与对照例的细胞活率结果
由表2可知，实施例7、8的保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率要比使用对照例2组使用的保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率高；实施例8使用的保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率要比使用实施例7使用的保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率高。
由此得出，本发明提供的保护液中的氧合血红蛋白换成了转铁蛋白后，皮肤细胞或精原细胞的活率显著降低，而氧合血红蛋白的浓度为600μg/ml时，保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率高更高。
试验例3
本组试验主要考察抗氧化剂的影响，以对照例3分别保存的皮肤细胞和精原细胞为对照组，实施例7、10-12为实验组，检测过程如试验例1，保存48h后的检测结果如表3。
表3试验例3各实施例与对照例的细胞活率结果
由表3可知，实施例10-12的保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率要比使用实施例7、对照例3组使用的保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率高；实施例12使用的保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率要比使用实施例10、11使用的保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率高。
由此得出，本发明提供的保护液中的抗氧化剂可以显著提高皮肤细胞或精原细胞的活率。
试验例4
以对照例4-7分别保存的皮肤细胞和精原细胞为对照组，实施例4、实施例7、实施例10、实施例14、16、实施例17和实施例19为实验组，各实验组和对照组的皮肤细胞和精原细胞分别在24h、48h、96h、240h、480h后进入试验程序，调整皮肤细胞和精原细胞的密度均为1×106cells/ml。按细胞悬液：0.4％台盼蓝＝3:1(v:v)充分混匀，取20μl细胞悬液加入细胞计数板中，用countstar细胞计数器检测各实验组和对照组保护液内表皮干细胞和精原干细胞的活率，结果如表4所示。
表4试验例4各实施例与对照例的细胞活率结果
由表4可知，实施例14、16-17和实施例19的保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率要比使用实施例1、实施例7和实施例10对照例4-7、使用的保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率高；实施例17和实施例19使用的保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞的时间要比使用实施例14和16的保存时间长。
由此得出，本发明提供的保护液中的吐温80、棕榈酰胺、海藻酸钾和月桂酰肌氨酸组合物可以显著提高皮肤细胞或精原细胞的活率，柠檬酸、丙酮酸、延胡索酸和乙酰辅酶a组合物可以显著提高保护液对皮肤细胞或精原细胞的保存时间。