一种提高大豆不育系结实性的方法与流程

本发明涉及一种提高大豆不育系结实性的方法，属于农作物杂交种制种技术领域。

背景技术：

利用杂种优势是大幅度提高作物产量最有效的途径之一，该方法目前已经在禾本科、十字花科等植物中运用。玉米为异花授粉作物，在杂种优势利用方面取得突破性的进展给其它作物提供了重要的启示。自花授粉作物严格的自花授粉机制减少了作物的异交产量(Palmer et al.2001)。然而，袁隆平打开了自花授粉作物杂种优势的利用道路，启发科学家们研究大豆杂种优势。

大豆是严格的自花授粉作物，一般异交结实率小于1％(Woodworth 1922；Jeffery et al.2003)。至20世纪90年代，中国已经选育了大豆质核互作雄性不育系和“三系”，使得大豆杂种优势利用成为可能(Sun et al.1994；Gai et al.1995；Ding et al.2002；Bai and Gai 2005；Zhao and Gai 2006；Bai and Gai 2006)。科学家们利用昆虫传粉媒介(蜜蜂(Apis mellifera)和苜蓿切叶蜂(Megachile rotundata))在网室和开放环境下为不育系进行传粉试验，发现有传粉媒介网室比无传粉媒介网室的不育系结实率高；开放环境下利用传粉媒介，也提高了不育系的结实率；试验结果表明，传粉媒介极有可能解决不育系异花授粉的问题(Koelling 1981；Wang 2008)。但是，网室放蜂成本高，不育系的繁殖与杂交种的配制仍然存在很大的困难。因此如何在开放环境下提高大豆不育系结实性成为杂交大豆产业化亟待解决的问题。

技术实现要素：

1、发明要解决的技术问题

本发明为了解决现有大豆不育系异交结实技术中存在的技术低效、成本较高、不易产业化的问题，提出了一种提高大豆不育系结实性的方法。本发明利用大豆质核互作雄性不育系对异交结实中存在的问题进行逐步解析，找出了影响大豆不育系异花授粉的关键因子，解决了开放环境下大豆不育系结实性的关键技术，加快了杂交大豆种子生产的产业化进程。

2、技术方案

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

一种提高大豆不育系结实性的方法，该方法包括以下步骤：

步骤一：选择种植环境和播种时间

以手触叶片、手指湿润为有露水作为调查标准，选择清晨叶片和花芽上无露水、开花期日平均温度为20.2～26.0℃的种植环境，这种环境更利于大豆散粉、花粉活力较高，能为不育系异交结实提供更多的有效花粉；选择在清晨7:00之前调查叶片和花芽上的露水情况；选择春季播种大豆不育系及其父本，有效避免大豆开花期露水影响父本散粉；春季播种时间为4月上旬-5月下旬；

步骤二：选择种植材料

选择花粉萌发率达75％以上且全天有可持续萌发花粉的保持系或恢复系作为父本材料，花粉萌发率高的父本可为大豆不育系异花授粉提供充足的外源花粉；选择花泌蜜量在0.18μL以上的不育系作为母本材料，更有利于吸引传粉媒介为其传粉，泌蜜量高的不育系，其相应的异交结荚率和异交结实率也高；

步骤三：利用自然昆虫群体进行异花传粉

在花泌蜜量高峰时段利用种植环境中利于大豆异交结实的自然昆虫群体进行异花传粉；在花泌蜜量高峰时段，自然昆虫群体活动也处于高峰时段，均为11:00-13:00；利于大豆异交结实的自然昆虫群体主要有中华蜜蜂、意大利蜜蜂、北方切叶蜂、玉米毛带蜂、拟绒毛淡脉隧蜂、细切叶蜂、黄鳞切叶蜂和熊蜂等；

步骤四：大豆不育系结实性

在大豆开花期清晨叶片和花芽上无露水的环境下种植泌蜜量在0.18μL以上的母本材料、花粉萌发率达75％以上的父本材料；在大豆花泌蜜量高峰时段利用种植环境中利于大豆异交结实的自然昆虫群体进行异花传粉。综合利用环境、昆虫和作物之间的协调关系，提高大豆不育系结实性。

3、有益效果

⑴本发明是利用稳定的不育系，在有外源花粉的情况下，通过昆虫传粉来实现花粉从父本高效率地传输到母本。

⑵本发明综合利用环境、昆虫和作物之间的协调关系，提高了大豆不育系结实性，自然异交结实率达88.93％，繁种产量达1461kg/公顷，制种产量达1830kg/公顷，加快了大豆不育系杂交种子生产的产业化进程。

⑶本发明发现了有利于大豆不育系异交结实的自然昆虫群体，通过利用自然昆虫群体，大大地降低了网室放蜂的制种成本。

附图说明

图1为南京和太原两地大豆花粉萌发率(SPGR％)的调查图；注：字母为多重比较测验结果，不同字母表示差异显著(P<0.05)。

图2为花粉萌发期南京和太原两地大豆叶片、花芽露水情况调查图。

图3为保持系SXCMS1B，SXJLCMS1B和恢复系Z-17，Z-119花粉萌发率(SPGR％)的调查图；注：字母为多重比较测验结果，不同字母表示差异显著(P<0.05)。

图4为大豆花泌蜜量和昆虫访花次数的分布图；注：图4-A为每小时的大豆花泌蜜量的统计图；图4-B为每小时昆虫访花次数的统计图；字母为多重比较测验结果，不同字母表示差异显著(P<0.05)；横坐标数字8～16代表8:00～16:00。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定于本发明，下述实例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。

实施例1：适宜种植环境的选择

2013年在南京和太原种植保持系NJCMS1B、NJCMS2B和NJCMS3B，在开花期调查大豆花粉萌发率。结果如图1所示，南京环境下的花粉萌发率平均为77.05％，太原环境下的花粉萌发率平均为86.36％，经测验发现太原环境下的花粉萌发率比南京环境下的高。

2013年在大豆开花期于清晨7:00之前，以手触叶片、手指湿润为有露水的调查标准，观察南京和太原种植环境下不少于20株大豆的叶片和花芽上的露水情况，发现南京环境下的大豆叶片(图2-C)和花芽(图2-D)上有许多露水，太原环境下的大豆叶片(图2-A)和花芽(图2-B)上无露水。大豆花芽上有露水易使花粉粘结且难以释放。

南京开花期日平均温度为24～34.6℃、日平均降雨量320.1mm，环境湿热，清晨的大豆叶片上露水较多，花粉粘结，不利于散粉，影响大豆花粉活力；太原开花期日平均温度为20.2～26℃、日平均降雨量216.1mm，环境较为干燥，清晨的大豆叶片上没有露水，这种环境更利于大豆花散粉，花粉活力较高，能为不育系异交结实提供更多的有效花粉(温度和降雨量数据来自中国气象数据网)；因此，选择适宜大豆散粉的环境对提高不育系异交结实性至关重要。

实施例2：种植材料的选择

(1)父本：2012年在太原的祁县和榆次种植保持系SXCMS1B、SXJLCMS1B和恢复系Z-17、Z-119，开花期调查大豆花粉萌发率。结果如图3所示，无论是保持系还是恢复系，花粉萌发率均达75％以上，可以为不育系异交结实提供充足的外源花粉。

(2)母本：2011-2013年在南京种植大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A、NJCMS2A及其相应的保持系NJCMS1B、NJCMS2B，并设计了放蜂网室和不放蜂网室。开花期调查花泌蜜量，成熟期调查不育系的异交结荚数和异交结实数。异交结荚率和异交结实率分别为不育系单株的平均结荚数和平均结实数与保持系单株的平均结荚数和平均结实数的比值。结果如表1所示，花泌蜜量高的不育系，其相应的异交结荚率和异交结实率也高。

表1 2011-2013年不同大豆材料的花泌蜜量与异交结荚率和异交结实率

注：数字后字母为多重比较测验结果，不同字母表示差异显著(P<0.05)

(3)高泌蜜量的大豆材料吸引昆虫活动：2011年在太原祁县和榆次种植大豆质核互作雄性不育系SXJLCMS1A及其保持系SXJLCMS1B，以及恢复系Z-17和Z-119，于开花期通过数码监控摄像系统对传粉媒介进行观察，时间为一天中9:30-15:30，每地点观察2天；2012年在太原祁县和榆次种植大豆质核互作雄性不育系SXJLCMS1A、SXJLCMS1B及其相应的保持系SXCMS1A、SXCMS1B，以及恢复系Z-17和Z-119，每地点观察3天。同时，每个材料每小时用10μL毛细管采集至少10朵花的泌蜜量。结果如图4所示，昆虫访问的高峰时段与花泌蜜量的高峰时段一致，均为11:00-13:00。

实施例3：利于大豆异交结实的自然昆虫群体的筛选

对太原大豆田间自然昆虫群体的统计结果如表2所示，田间自然昆虫群体主要为膜翅目，包括蜜蜂科的中华蜜蜂、意大利蜜蜂和熊蜂，切叶蜂科的北方切叶蜂、细切叶蜂和黄鳞切叶蜂，以及遂蜂科的玉米毛带蜂和拟绒毛淡脉隧蜂。其中访花昆虫出现频率最高的是中华蜜蜂，在观察的时间里访花次数为391次，占总昆虫访花次数的55.0％；访问了836朵花，占总昆虫访花数目的57.9％；访花时间共计4075秒，占总昆虫访花时间的45.8％，其次是意大利蜜蜂和北方切叶蜂。

表2 太原大豆田间自然昆虫群体的调查结果

实施例4：不育系异交结实性的调查

(1)2014年在山西种植大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A、NJCMS2A、NJCMS3A、SXJLCMS1A和SXCMS1A及其相应的保持系NJCMS1B、NJCMS2B、NJCMS3B、SXJLCMS1B和SXCMS1B。试验设计了放蜂网室、不放蜂网室和开放环境。网室内父母本1:1种植，网室大小为长6m*宽4m*高2.5m。放蜂网室内的传粉媒介为蜜蜂。成熟期调查不育系单株的异交结荚数和异交结实数。如表3所示，方差分析表明不同环境下的不育系在异交结荚率和异交结实率上有显著差异(P<0.01)。

表3 大豆不育系的异交结荚率和异交结实率的方差分析结果

注：*：P<0.05；**：P<0.01

如表4所示，放蜂网室的大豆质核互作雄性不育系的异交结荚率和异交结实率比不放蜂网室分别提高了55.7％和43.7％，说明网室人工放蜂提高了异交结荚率和异交结实率。开放环境下比不放蜂网室分别提高了45.2％～55.7％和39.8％～41.5％，可能是由于太原开放环境下有利于大豆异交结实的自然昆虫群体。因此，有目的地培育有利于大豆异交结实的自然昆虫群体，如中华蜜蜂和意大利蜜蜂等，将有利于提高大豆不育系异交结实性。

表4 不同环境下的大豆异交结荚率和异交结实率

注：数字后字母为多重比较测验结果，不同字母表示差异显著(P<0.05)

(2)2014年在太原种植大豆质核互作雄性不育系SXJLCMS1A及其保持系SXJLCMS1B，设计了开放环境和放蜂网室。开放环境下父母本1:2种植，行距50cm，传粉媒介为自然昆虫群体。放蜂网室下父母本1:1种植，行距50cm，网室面积40m²，传粉媒介为蜜蜂。成熟期调查不育系单株的异交结荚数和异交结实数。如表5所示，在开放环境下，SXJLCMS1A的异交结实率达88.93％，异交产量达1461.0千克/公顷；在放蜂网室下，SXJLCMS1A的异交结实率达95.4％，异交产量达1524.0千克/公顷。结果表明自然昆虫群体作用下的大豆不育系异交结实率和繁种产量能够达到放蜂网室的效果，利用自然昆虫群体可大大降低了网室放蜂的制种成本。

表5 大豆质核互作雄性不育系的繁种结果