一种维持DC‑CIK细胞高杀伤力的冻存保护剂的制作方法

本发明属于免疫领域，涉及DC-CIK细胞的培养，具体涉及一种维持DC-CIK细胞高杀伤力的冻存保护剂。

背景技术：

申请人于2016年12月22日提交了一件DC-CIK细胞培养的专利申请，该申请公开了miRNA-155及其抑制剂在DC-CIK细胞培养方面的应用，miRNA-155可以作为药物靶标在提高DC细胞共培养增强的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力中的应用。该申请的说明书公开了miRNA-155下调表达的DC-CIK细胞比miRNA-155正常表达的DC-CIK细胞具有更高的杀伤力，而miRNA-155下调表达的DC细胞与miRNA-155正常表达的DC细胞的杀伤力基本一致，无显著性差异。这表明，miRNA-155下调并不能直接提高DC细胞对白血病细胞的杀伤力，但是miRNA-155下调的DC细胞可以通过共培养显著增强CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。申请人还发现，太子参环肽B和太子参环肽C为miRNA-155的有效抑制剂。

出于实验需要，研究人员通常需要将细胞进行冻存，以便日后复苏使用。申请人发现，miRNA-155低表达的DC-CIK细胞在冻存前虽然对白血病细胞的杀伤力非常高，但是，冻存复苏后杀伤力明显下降。这表明，传统的细胞冻存保护剂可能不适用于miRNA-155低表达DC-CIK细胞的冻存，虽然能维持其复苏率，但是不能维持其对白血病细胞的杀伤力。

传统的细胞冻存保护剂多为基于DMSO的标准冻存液，由培养基、胎牛血清和DMSO组成。申请人在CIK细胞常用冻存保护剂基础上[RPMI 1640、胎牛血清和二甲基亚砜按照体积比5:4:1混合，可参见文献：冻存对细胞因子诱导的杀伤细胞免疫表型及细胞内因子表达的影响，郑州大学学报(医学版)2014年1月]进行了优化研究，试图在保证DC-CIK细胞冻存复苏率的基础上最大限度维持DC-CIK细胞的高杀伤力。

技术实现要素：

本发明旨在克服背景技术中存在的不足，提供一种维持DC-CIK细胞高杀伤力的冻存保护剂，在保证DC-CIK细胞冻存复苏率的基础上最大限度维持DC-CIK细胞的高杀伤力。

本发明通过如下技术方案得以实现：

一种维持DC-CIK细胞高杀伤力的冻存保护剂，由RPMI 1640、胎牛血清和二甲基亚砜、太子参环肽B或C组成。

优选地，RPMI 1640、胎牛血清和二甲基亚砜按照体积比6:3:1混合。

优选地，所述太子参环肽B的浓度为7-9μg/ml。

优选地，所述太子参环肽C的浓度为4-6μg/ml。

使用上述冻存保护剂冻存DC-CIK细胞的方法：首先于4℃冰箱中放置1h，然后-20℃冰箱中放置2h，转至-80℃低温冰箱放置。

本发明优点：

本发明冻存保护剂能在保证DC-CIK细胞冻存复苏率的基础上最大限度维持DC-CIK细胞的高杀伤力，延续miRNA-155低表达所带来的强杀伤力。

附图说明

图1为不同组效应细胞复苏后存活率；

图2为不同组效应细胞对白血病K562/A02细胞系的杀伤活性；

图3为不同组效应细胞对白血病THP-1细胞系的杀伤活性；

图4为不同组效应细胞对白血病HL-60细胞系的杀伤活性。

具体实施方式

为了更好地解释本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步介绍。实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，属于本领域技术人员易于获得的范畴。

实施例1：冻存对miRNA-155低表达DC-CIK细胞杀伤力的影响

一、实验材料

1、miRNA-155inhibitor由上海吉玛制药技术有限公司提供(如下序列1)；inhibitor negative control由上海吉玛制药技术有限公司提供(如下序列2)。

序列1：5’-ACCCCUAUCACGAUUAGCAUUAA-3’；

序列2：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。

2、肿瘤细胞为白血病细胞，包括K562/A02、THP-1及HL-60细胞。

二、实验方法

1、效应细胞DC与CIK的分离培养

(1)单个核细胞的分离：采集健康志愿者外周血20mL，预冷的PBS 1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，1640培养基重悬细胞后置于37℃，5％CO₂孵箱中孵育2h。

(2)DC细胞的培养：单个核细胞培养2h后收集贴壁细胞，在完全培养基(1640+10％FBS)中添加GM-CSF(1000U/mL)、IL-4(1000U/mL)诱导DC生成，于37℃，5％CO₂孵育箱中培养，每2天半量换液一次，换液后补充GM-CSF、IL-4，于第6d在培养基中添加TNF-α诱导DC成熟(100ng/mL)，连续培养7d，收集细胞备用。

(3)CIK细胞的培养：收集单核细胞中的悬浮细胞，调整细胞密度至1×10⁶/ml，在完全培养基(1640+10％FBS)中加入INF-γ(1000U/mL)，并于24h后添加IL-2(300U/mL)、IL-1α(l00U/mL)和抗人CD3单抗(50μg/mL)。每2-3d进行换液，并补充等量的细胞因子，连续培养7天，收集细胞备用。

2、效应细胞DC的转染

转染试剂为美国Invitrogen公司生产的lipofectamine2000，严格按照使用说明操作。

(1)传细胞培养板：以6孔板为例，转染前一天，按1×10⁶/ml密度接种DC细胞于6孔板，每孔加2ml培养基，使转染时贴壁细胞密度达60％。

(2)用DEPC水稀释miRNA-155inhibitor或inhibitor negative control(NC)，配制终浓度为20μM的存储液，分装使用。

(3)配制混合液：

miRNA-155inhibitor或NC混合液：取10μl上述存储液，用opti-MEM稀释，轻轻混匀，配制250μl稀释液A；lipofectamine2000稀释液：取5μl lipofectamine2000，用opti-MEM稀释，轻轻混匀，配制250μl稀释液B。

(4)稀释液A和稀释液B室温孵育5分钟后，将二者轻轻混匀，室温孵育20分钟，配制总体积为500μl的稀释液C。

(5)将6孔板内原培养基吸去，PBS冲洗1次后吸去，每孔加入1.5ml opti-MEM。将稀释液C加入每孔，使得每孔液体总体积为2ml，miRNA-155inhibitor或NC浓度为100nM。

(6)将6孔板放入细胞培养箱培养6小时，吸去含有miRNA-155inhibitor或NC的培养基，PBS冲洗1次后，加入完全培养基2ml，放入细胞培养箱中继续培养48小时。

3、效应细胞DC转染后miRNA-155的表达量(qRT-PCR)

3.1细胞总RNA的提取

(1)吸去6孔板中的培养基，用PBS冲洗细胞2次，吸去PBS，每孔注入RNAiso Plus 1ml，缓慢吹打细胞，使细胞充分裂解；

(2)将裂解液吸出转入1.5ml EP管中，冰上静置5min；

(3)在EP管中加入氯仿200μl，剧烈震荡混匀约15秒，冰上静置3min；然后于4℃条件下12000g/min离心15分钟；

(4)离心后吸取EP管中上层水相液体500μl转入新的1.5ml EP管中，加入异丙醇500μl，颠倒混匀，冰上静置10min；然后于4℃条件下12000g/min离心10分钟；

(5)将EP管中沉淀留下，加入75％乙醇1ml震荡混匀，重悬白色沉淀；然后于4℃条件下7500g/min离心10分钟；

(6)吸去EP管中液体，可见管中沉淀，室温中干燥5分钟后用DEPC水30μl左右溶解沉淀获得总RNA，置于4℃冰箱过夜；

(7)取2μl上述总RNA，加198μl DEPC水，配制200μl稀释的总RNA，测定浓度和纯度；置于-80℃冰箱保存备用。

3.2miRNA-155逆转录

(1)将总RNA逆转录成cDNA

用Hairpin-it^TM miRNAs qPCR Quantitation Kit(上海吉玛制药技术有限公司)按照说明书在DEPC处理的200μl EP管中配制如下反应体系：5×RT Buffer，4μl；dNTP(10mM)，0.75μl；miR-RT primers(1μM)，1.2μl；MMLV Reverse Transcriptase(200U/μl)，0.2μl；RNA sample，1μg；加RNase Free H₂O至20μl。将该体系轻轻混匀后，瞬时离心，设置反应条件如下：16℃，30min；42℃，30min；85℃，10min。反应产物cDNA置于-20℃冰箱保存备用。

(2)实时荧光定量PCR

将cDNA稀释3倍，然后混匀并吸取2μl作模板，用逆转录试剂盒按说明书配制如下反应体系：2×RT PCR Buffer，10μl；miR specific Primer set(5μM)，0.4μl；miRNA RT Product，2μl；Taq DNA polymerase(5U/ml)，0.2μl；加ddH₂O至20μl。将该体系轻轻混匀后，瞬时离心，设置反应条件如下：95℃，3min；95℃，12sec；62℃，40sec；40cycles。

miRNA-155以U6为内参，miRNA-155和U6的引物由上海吉玛制药技术有限公司提供。

4、效应细胞DC与CIK共培养

将上述成熟的DC和CIK按1:8混合，置于含300U/mL IL-2的RPMI1640培养基中，于37℃、5％CO₂孵箱中继续培养，隔天半量换液，共培养4天，收集细胞。

5、DC-CIK的冻存和复苏

将收集的DC-CIK细胞1500r/min离心10min弃上清后，加入冻存保护剂，吸吹均匀，调整至密度为2×10⁶个/mL，分装于冻存管中，标记冻存日期，首先于4℃冰箱中放置1h，然后-20℃冰箱中放置2h，转至-80℃低温冰箱放置3个月。

分为本发明冻存保护剂组和常规冻存保护剂组，保护剂成分如下：

本发明冻存保护剂组1：RPMI 1640、胎牛血清和二甲基亚砜按照体积比6:3:1混合，并添加8μg/ml太子参环肽B；太子参环肽B在7-9μg/ml均可，过高会造成细胞损伤；

本发明冻存保护剂组2：RPMI 1640、胎牛血清和二甲基亚砜按照体积比6:3:1混合，并添加5μg/ml太子参环肽C；太子参环肽C在4-6μg/ml均可，过高会造成细胞损伤；

常规冻存保护剂组：RPMI 1640、胎牛血清和二甲基亚砜按照体积比5:4:1混合。

6、DC-CIK细胞的复苏

将冻存的DC-CIK细胞从-80℃低温冰箱中取出后放入37℃水浴锅内迅速融化，用完全培养基洗1遍，重悬于RPMI1640培养基中。

7、复苏后细胞存活率测定

将复苏细胞用台盼蓝染色后，利用血细胞计数板计数细胞，测定台盼蓝拒染率，并与冷冻前相比较，计算细胞存活率：细胞存活率＝(1-台盼蓝染色细胞数/总细胞数)×100％。

根据效应细胞不同分为如下组别：

B组：冻存保护剂组1冻存复苏的miRNA-155低表达DC-CIK细胞；

C组：冻存保护剂组2冻存复苏的miRNA-155低表达DC-CIK细胞；

D组：常规冻存保护剂组冻存复苏的miRNA-155低表达DC-CIK细胞。

8、冻存前后对白血病细胞杀伤力的测定

分别使用K562/A02，THP-1及HL-60细胞作为靶细胞，使用完全培养基调整细胞浓度为10⁵个/mL，按照效靶5:1将效应细胞及靶细胞加入96孔板中，37℃、5％CO₂孵育箱中培养48h。通过MTT检测试剂盒检测细胞活率。

杀伤活性(％)＝[1-(试验孔均值-效应对照孔均值)/靶细胞对照孔均值]×100％。

根据效应细胞不同分为如下组别：

A组：冻存前miRNA-155低表达DC-CIK细胞；

B组：冻存保护剂组1冻存复苏的miRNA-155低表达DC-CIK细胞；

C组：冻存保护剂组2冻存复苏的miRNA-155低表达DC-CIK细胞；

D组：常规冻存保护剂组冻存复苏的miRNA-155低表达DC-CIK细胞。

三、实验结果

1、DC、CIK细胞增殖情况和表型分析

从外周血分离获得单个核细胞，通过诱导刺激分别得到DC和CIK细胞。经过传代培养，使用MTT检测试剂盒分析两种细胞的增殖活性，从570nm的吸光值结果可以看出，初种细胞后的1-2d，DC、CIK细胞生长缓慢，d3细胞进入快速生长期，6d以后细胞生长速度减缓。提取培养7d后的DC及CIK，通过流式细胞仪检测其表面标志物，其中DC细胞表面CD80、CD83、CD86的阳性率分别为72.17％、55.56％、60.09％，说明DC细胞已经成熟，纯度较高。CIK细胞表面CD3⁺CD8⁺、CD3⁺CD56⁺双阳性比率分别为57.65％、51.43％。

2、DC细胞转染后miRNA-155表达情况

转染miRNA-155inhibitor的DC细胞中的miRNA-155表达量显著下调，约为不转染inhibitor或negative control的对照组DC细胞、转染negative control的阴性对照组DC细胞的0.3倍。各组DC细胞的活力及增殖行为基本一致，证明miRNA-155低表达后并不影响DC细胞的活力和增殖行为。

3、复苏后细胞存活率

各组存活率差异不大，均在80％左右，如图1所示。

4、复苏后对白血病细胞的杀伤力

各组效应细胞对白血病细胞杀伤力的结果如图2-4所示。

结果可以看出，冻存保护剂组1和冻存保护剂组2DC-CIK细胞对白血病细胞的杀伤力与冻存前基本一致，显著优于常规冻存保护剂组的DC-CIK细胞。

综合上述实验可以看出，本发明提供的冻存保护剂虽然不能进一步提高复苏率，但是能最大限度维持DC-CIK细胞的高杀伤力，延续miRNA-155低表达所带来的强杀伤力。

上述实施例仅用于进一步解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，任何简单替换或修改均不脱离本发明，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。