本发明属于绵羊冷冻精液
技术领域：
，特别涉及一种通过添加谷胱甘肽(GSH)和过氧化氢酶(CAT)，有效保护绵羊精子在冷冻、解冻过程中受到氧化损伤，提高精子解冻后活力与延长精子存活时间，从而达到受精受胎的目的的一种含谷胱甘肽和过氧化氢酶的绵羊冷冻精液制备方法。
背景技术：
：在过去的50年中冷冻精液技术迅猛发展，不同动物的精液冷冻都获得了较快的进展，牛的冷冻精液已经进入了产业化。绵羊的精子与其他家畜相比具有一定生理特性，冷冻后活力低、受胎率低，且不稳定，成为制约绵羊冷冻精子发展的桎梏。为了提高绵羊冷冻精液解冻后活力以及存活时间，提升绵羊冷冻精液品质，研究开发了添加抗氧化剂GSH和CAT的绵羊冷冻精液的制备方法。技术实现要素：本发明提供了一种含谷胱甘肽和过氧化氢酶的绵羊冷冻精液制备方法，该技术原理是利用抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)和过氧化氢酶(CAT)能够抵抗携带有自由基的活性氧族(ROS)特点，在绵羊精子冷冻的过程中添加GSH和CAT，降低活性氧族对绵羊精子造成的过氧化损伤的作用，从而提高解冻后精子活力和延长精子存活时间，达到受精受胎的目的。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种含谷胱甘肽和过氧化氢酶的绵羊冷冻精液制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：(1)、谷胱甘肽GSH液和过氧化氢酶CAT液的配置：称取30.73mg的谷胱甘肽GSH加入1ml的蒸馏水，室温溶解；称取4.2mg的过氧化氢酶CAT加入1ml的蒸馏水，室温溶解；(2)、谷胱甘肽GSH液和过氧化氢酶CAT液的保存：谷胱甘肽GSH完全溶解后避光保存在-20℃，保存期限为一月；过氧化氢酶CAT完全溶解后避光保存在-20℃，保存期限为一周；(3)、花生凝集素FITC-PNA染液的配置：将1mg花生凝集素FITC-PNA溶于10mlPBS缓冲液中，然后分装避光保存在-20℃；(4)、PVP液的配置：3gPVP溶于100mlPBS缓冲液中；(5)、PBS缓冲液：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.15g，KH2PO40.2g，用超纯水溶解，定容到1L，将溶液的酸碱度调到pH＝7.4；0.22μm滤器过滤分装，4℃保存备用；(6)、Tris-A、Tris-B的配置：超纯水超纯水(7)、精液检查：①外观评定1)射精量：采精后，将绵羊精液倒入有刻度的离心管中观察即可；2)云雾运动：用肉眼观察新采的公绵羊精液，可以看到由精子活动所引起的翻腾滚动极似云雾状；精子的密度越大，活力越强者，其云雾状越明显；3)色泽：绵羊的正常精液呈乳白色或乳黄色；②活力检测用移液器从1)的离心管中取适量绵羊精液滴在载玻片上，压片后置于显微镜下镜检，活力≥0.6进行冷冻；(8)、绵羊精液的抗生素添加与浓度测定①绵羊精液经过上述步骤(7)检查完后，1ml绵羊精液添加0.3mg林可-奇霉素、0.8mg庆大霉素；②将添加好抗生素的绵羊精液用50μm精液过滤器过滤至新的离心管中，过滤后使用密度仪检测原精实际浓度；(9)、添加抗氧化剂冷冻精液的制备：①在TrisA、TrisB中添加抗氧化剂，添加比例为：1mlTrisA分别添加10μlGSH、5μlCAT，1mlTrisB分别添加10μlGSH、5μlCAT，添加完抗氧化剂后，将TrisA、TrisB各自混合均匀，放在4℃平衡90分钟；②取步骤(8)测完浓度的绵羊精液，按照精子终浓度计算所需总体积的一半加入等温的TrisA进行稀释，然后用8-10层纱布包裹放到4℃平衡；③精子4℃平衡，2h后，加入与Tris-A等量的Tris-B，Tris-B分2次间隔15分钟等量加入离心管中，每次添加后颠倒轻轻摇匀；④装管和冷冻保存：精子摇匀，按每支250μl，500万精子装管，将冷冻精液摆放到冷冻搓板上，然后放入冷冻仪中，按照冷冻仪操作规程进行冻精操作，最后将冻精投入液氮保存；(10)、冷冻精液各项质量指标检测：①冻后活力检测：取一支上述步骤(9)制备的绵羊冻精，在35℃温水浴中解冻后进行检测，预先把载玻片和盖玻片放在37℃加热板上预热10分钟，用移液器离心管取15μl样品滴在载玻片上，压片后置于显微镜下镜检，选择压片均匀的样品区域，一个压片取5个视野，中间1个，四周各取1个，分别计数活精子数和死精子数，并计算活力；活力＝活精子数/活精子数与死精子数的和②冻后存活时间：取一支性控冻精上述步骤(9)制备的绵羊冻精，解冻方法同上，解冻后的样品在37℃环境下避光保存，4小时后将细管中精液转置于1.5ml离心管，用移液器从离心管取15μl样品滴在准备好的载玻片上，在显微镜自然下光观察精子存活情况，计数方法同上；③冻后精子顶体完整性检测：取一支上述步骤(9)制备的绵羊冻精，解冻方法同上，放到含3％等温PVP液的离心管内，800×g离心6min，弃上清液；沉淀精子用37℃按照步骤(5)配置的PBS缓冲液重悬，调整精子密度为1～2×106/mL，移液枪吸取30μL精子悬液，涂片，空气中自然干燥后，用纯甲醇固定10min，再加入30μLFITC-PNA染液，37℃黑暗潮湿环境下孵育30min，之后再用PBS缓冲液冲洗，空气中自然干燥后加少许增光剂混匀，盖上盖玻片，无色指甲油封片后，用400×荧光显微镜观察。本发明的优点和有益效果是：利用GSH和CAT能够抵抗携带有自由基的活性氧族(ROS)特点，在绵羊精子冷冻、解冻的过程中添加GSH和CAT，降低活性氧族对绵羊精子造成的过氧化损伤的作用，有效保护绵羊精子冷冻、解冻过程中精子生理机能，从而提高解冻后绵羊精子活力和延长精子存活时间，达到提高受胎率的目的。具体实施方式实施例：一种含谷胱甘肽和过氧化氢酶的绵羊冷冻精液制备方法，以绵羊冷冻精液为例，它包括以下步骤：1、谷胱甘肽GSH液和过氧化氢酶CAT液的配置：称取30.73mg的谷胱甘肽GSH加入1ml的蒸馏水，室温溶解；称取4.2mg的过氧化氢酶CAT加入1ml的蒸馏水，室温溶解；2、谷胱甘肽GSH液和过氧化氢酶CAT液的保存：谷胱甘肽GSH完全溶解后避光保存在-20℃，保存期限为一月；过氧化氢酶CAT完全溶解后避光保存在-20℃，保存期限为一周；3、花生凝集素FITC-PNA染液的配置将1mg花生凝集素FITC-PNA溶于10mlPBS缓冲液中，然后分装避光保存在-20℃；4、PVP液的配置3gPVP溶于100mlPBS缓冲液中；5、PBS缓冲液：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.15g，KH2PO40.2g，用超纯水溶解，定容到1L，将溶液的酸碱度调到pH＝7.4；0.22μm滤器过滤分装，4℃保存备用；6、Tris-A、Tris-B的配置超纯水超纯水7、精液检查(1)外观评定1)射精量：采精后，将绵羊精液倒入有刻度的离心管中观察即可；2)云雾运动：用肉眼观察新采的公绵羊精液，可以看到由精子活动所引起的翻腾滚动极似云雾状；精子的密度越大，活力越强者，其云雾状越明显；3)色泽：绵羊的正常精液呈乳白色或乳黄色；(2)活力检测用移液器从上述步骤(1)的离心管中取绵羊精液滴在载玻片上，压片后置于显微镜下镜检，活力≥0.6进行冷冻；8、绵羊精液的抗生素添加与浓度测定①绵羊精液经过上述步骤(7)检查完后，1ml绵羊精液添加0.3mg林可-奇霉素、0.8mg庆大霉素；②将添加好抗生素的绵羊精液用50μm精液过滤器过滤至新的离心管中，过滤后使用密度仪检测原精实际浓度，羊1浓度为7.2亿/ml，羊2浓度为10.95亿/ml；9、添加抗氧化剂冷冻精液的制备(1)在TrisA、TrisB中添加抗氧化剂，添加比例为：1mlTrisA分别添加10μlGSH、5μlCAT,1mlTrisB分别添加10μlGSH、5μlCAT，添加完抗氧化剂后，将TrisA，TrisB各自混合均匀，放在4℃平衡90分钟；(2)取步骤8测完浓度的羊1、羊2鲜精各1ml，按照精子终浓度2千万/ml计算所需总体积，羊1体积为7.2÷0.2＝36ml，羊2体积为10.95÷0.2＝54.75ml，羊1加入(36ml-1ml)÷2＝17.5ml，羊2(54.75ml-1ml)÷0.2＝26.875ml等温的TrisA进行稀释，然后用8-10层纱布包裹放到4℃平衡；(3)精子4℃平衡2h后，加入与Tris-A等量的Tris-B，Tris-B分2次加入，羊1每次加入17.5÷2＝8.75ml，羊2每次加入26.875÷0.2＝13.437ml，两次间隔15分钟等量加入离心管中，每次添加后颠倒轻轻摇匀；(4)装管和冷冻保存：精子摇匀，按每支250μl，500万精子装管，将冷冻精液摆放到冷冻搓板上，然后放入冷冻仪中，按照冷冻仪操作规程进行冻精操作，最后将冻精投入液氮保存；10、冷冻精液各项质量指标检测：取1支按照上述方法添加抗氧化剂GSH和CAT生产的绵羊冷冻精液，解冻后进行各项质量指标检测，与此同时，取同一羊号按照常规方法不添加抗氧化剂GSH和CAT生产的绵羊冷冻精液作为质量指标对照，绵羊冻精的产品规格均为0.25ml；镜检：各质检指标计算方法如下：(1)冻后活力检测：取一支按以上方法制备的绵羊冻精，在35℃温水浴中解冻后进行检测，预先把载玻片和盖玻片放在37℃加热板上预热10分钟，用移液器离心管取10μl样品滴在载玻片上，压片后置于显微镜下镜检，选择压片均匀的样品区域，一个压片取5个视野，中间1个，四周各取1个，分别计数活精子数和死精子数，并计算活力；活力＝活精子数/活精子数与死精子数的和(2)冻后存活时间：取一支按以上方法制备的绵羊冻精，解冻方法同上，解冻后的样品在37℃环境下避光保存，4小时后将细管中精液转置于1.5ml离心管，用移液器从离心管取10μl样品滴在准备好的载玻片上，在显微镜自然下光观察精子存活情况，计数方法同上；绵羊1精子活力与存活时间分组0h6h12h对照组40.7％(665/1633)17.2％(163/950)0(0/1022))添加组41％(734/1786)28.8％(262/978)9.5％(144/1515)绵羊2精子活力与存活时间分组0h6h12h对照组54％(713/1318)32％(290/899)4.7％(36/760)添加组55％(756/1373)46％(354/765)17.7％(214/1205)(3)冻后精子顶体完整性检测：取一支按以上方法制备的绵羊冻精，解冻后精液放到含3％等温PVP液的离心管内，800×g离心6min，弃上清液；沉淀精子用37℃的PBS缓冲液重悬，调整精子密度为1～2×106/mL；移液枪吸取30μL精子悬液，涂片，空气中自然干燥后，用纯甲醇固定10min，再加入30μLFITC-PNA染液，37℃黑暗潮湿环境下孵育30min；之后再用PBS缓冲液冲洗，空气中自然干燥后加少许增光剂混匀，盖上盖玻片，无色指甲油封片后，用400×荧光显微镜观察。羊1、羊2精子解冻后0h的精子顶体完整率分组羊1顶体完整率羊1顶体完整率对照组64％77％添加组66％73％当前第1页1 2 3