含谷胱甘肽和过氧化氢酶的绵羊冷冻精液制备方法与流程

技术特征：

1.一种含谷胱甘肽和过氧化氢酶的绵羊冷冻精液制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(1)、谷胱甘肽GSH液和过氧化氢酶CAT液的配置：

称取30.73mg的谷胱甘肽GSH加入1ml的蒸馏水，室温溶解；

称取4.2mg的过氧化氢酶CAT加入1ml的蒸馏水，室温溶解；

(2)、谷胱甘肽GSH液和过氧化氢酶CAT液的保存：

谷胱甘肽GSH完全溶解后避光保存在-20℃，保存期限为一月；

过氧化氢酶CAT完全溶解后避光保存在-20℃，保存期限为一周；

(3)、花生凝集素FITC-PNA染液的配置：

将1mg花生凝集素FITC-PNA溶于10ml PBS缓冲液中，然后分装避光保存在-20℃；

(4)、PVP液的配置：

3g PVP溶于100ml PBS缓冲液中；

(5)、PBS缓冲液：

NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.15g，KH₂PO₄ 0.2g，用超纯水溶解，定容到1L，将溶液的酸碱度调到pH＝7.4；0.22μm滤器过滤分装，4℃保存备用；

(6)、Tris-A、Tris-B的配置：

超纯水

超纯水

(7)、精液检查：

①外观评定

1)射精量：采精后，将绵羊精液倒入有刻度的离心管中观察即可；

2)云雾运动：用肉眼观察新采的公绵羊精液，可以看到由精子活动所引起的翻腾滚动极似云雾状；精子的密度越大，活力越强者，其云雾状越明显；

3)色泽：绵羊的正常精液呈乳白色或乳黄色；

②活力检测

用移液器从1)的离心管中取适量绵羊精液滴在载玻片上，压片后置于显微镜下镜检，活力≥0.6进行冷冻；

(8)、绵羊精液的抗生素添加与浓度测定

①绵羊精液经过上述步骤(7)检查完后，1ml绵羊精液添加0.3mg林可-奇霉素、0.8mg庆大霉素；

②将添加好抗生素的绵羊精液用50μm精液过滤器过滤至新的离心管中，过滤后使用密度仪检测原精实际浓度；

(9)、添加抗氧化剂冷冻精液的制备：

①在TrisA、TrisB中添加抗氧化剂，添加比例为：1ml TrisA分别添加10μlGSH、5μlCAT，1ml TrisB分别添加10μlGSH、5μlCAT，添加完抗氧化剂后，将TrisA、TrisB各自混合均匀，放在4℃平衡90分钟；

②取步骤(8)测完浓度的绵羊精液，按照精子终浓度计算所需总体积的一半加入等温的TrisA进行稀释，然后用8-10层纱布包裹放到4℃平衡；

③精子4℃平衡，2h后，加入与Tris-A等量的Tris-B，Tris-B分2次间隔15分钟等量加入离心管中，每次添加后颠倒轻轻摇匀；

④装管和冷冻保存：精子摇匀，按每支250μl，500万精子装管，将冷冻精液摆放到冷冻搓板上，然后放入冷冻仪中，按照冷冻仪操作规程进行冻精操作，最后将冻精投入液氮保存；

(10)、冷冻精液各项质量指标检测：

①冻后活力检测：取一支上述步骤(9)制备的绵羊冻精，在35℃温水浴中解冻后进行检测，预先把载玻片和盖玻片放在37℃加热板上预热10分钟，用移液器离心管取15μl样品滴在载玻片上，压片后置于显微镜下镜检，选择压片均匀的样品区域，一个压片取5个视野，中间1个，四周各取1个，分别计数活精子数和死精子数，并计算活力；

活力＝活精子数/活精子数与死精子数的和

②冻后存活时间：取一支上述步骤(9)制备的绵羊冻精，解冻方法同上，解冻后的样品在37℃环境下避光保存，4小时后将细管中精液转置于1.5ml离心管，用移液器从离心管取15μl样品滴在准备好的载玻片上，在显微镜自然下光观察精子存活情况，计数方法同上；

③冻后精子顶体完整性检测：取一支上述步骤(9)制备的绵羊冻精，解冻方法同上，放到含3％等温PVP液的离心管内，800×g离心6min，弃上清液；沉淀精子用37℃按照步骤(5)配置的PBS缓冲液重悬，调整精子密度为1～2×10⁶/mL，移液枪吸取30μL精子悬液，涂片，空气中自然干燥后，用纯甲醇固定10min，再加入30μL FITC-PNA染液，37℃黑暗潮湿环境下孵育30min，之后再用PBS缓冲液冲洗，空气中自然干燥后加少许增光剂混匀，盖上盖玻片，无色指甲油封片后，用400×荧光显微镜观察。