一种长瓣兜兰的组织培养快速繁殖方法与流程

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体而言，本发明涉及一种长瓣兜兰组织培养快速繁殖的方法、一种适于长瓣兜兰组织培养快速繁殖的培养基体系以及一种确定长瓣兜兰果荚最佳采集期的方法。

背景技术：

兜兰属(Paphiopedilum)是兰科植物中最具特色最原始的类群之一。兜兰属植物由于独特的花型、绚丽的花色、持久的花期而具有极高的观赏价值，是国际花卉市场上十分流行的高档花卉，在世界上拥有大量的爱好者。近年来，在国内外兰展和花展上出现了越来越多的兜兰，随着人们生活水平的提高，越来越多的人开始喜欢和消费这一名贵兰花。兜兰产业已经悄然起步，很多兜兰杂交种和原生种都已经能够经过无菌播种，适宜栽培基质的栽培，作为高档的年宵花满足消费者的高端需求。然而，令人遗憾的是，市场上绝大多数原产于我国的兜兰都是从山上直接采挖的“下山兰”。由于其分布区域狭窄、原产地气候异常、生境丧失、资源遭受掠夺性采挖，兜兰种群数量正在迅速减少而濒临灭绝。

长瓣兜兰(Paphiopedilum dianthum)是附生兰，常附生在石缝或岩壁上，叶片2-5枚，粗厚，花莛高30-80cm，花通常2-4朵，花瓣黄绿色并有深浅不同的条纹，带状扭曲下垂，唇瓣褐黄色或浅褐色，花期一般在7-9月。长瓣兜兰为我国特有种，叶色浓绿厚实，花型优雅，是《国家重点保护野生植物名录》一级保护植物，也是中国仅有的几种多花型兜兰之一。由于长瓣兜兰种子没有胚乳而只有发育不完全的胚，种子在自然条件下极难萌发，且繁殖率低。因此，采用组织培养技术有利于解决其繁殖困难的问题并且可以在短期内提供大量种苗。然而，现有技术中鲜有关于长瓣兜兰组织培养技术的报道，仅王莲辉等(王莲辉等,“长瓣兜兰的组织培养与快速繁殖”,《植物生理学报》,2009,45(9):887-888)对长瓣兜兰进行了无菌播种及组培快繁实验，证明1/2MS+100mL·L-1椰汁或者MS+100mL·L-1椰汁的培养基比较适合种子萌发，能达到60％以上；1/2MS+6-BA 0.2+NAA 1.0+100mL·L-1椰汁是最佳增殖继代培养基，80-90天能继代一次；1/2MS+吲哚丁酸(IBA)0.2+2g·L-1活性炭是比较好的生根培养基。

因此，为了保护长瓣兜兰的野生资源同时满足消费者的需求，有必要提供一种长瓣兜兰的快速繁殖体系，以缩短其培养周期、提高种苗成活率和幼苗质量、降低成本，从而满足市场对这一观赏花卉不断增长的需求。

技术实现要素：

为了解决上述问题和克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种长瓣兜兰组织培养快速繁殖的方法、一种适于长瓣兜兰组织培养快速繁殖的培养基体系以及提供了长瓣兜兰果荚的最佳采集期。

本发明的第一方面提供了一种长瓣兜兰组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：

(1)自交授粉：选择花大色艳的长瓣兜兰进行异花授粉；

(2)果荚采摘：在长瓣兜兰自交后240-330天左右采集果荚；

(3)无菌播种：以采集的果荚为外植体进行消毒，切开果荚将种子接种在萌发培养基中进行暗培养大约40-50天，待30％种子长出原球茎，转为光照周期为12h培养；

(4)增殖继代培养：将步骤(3)中产生的幼苗接种到增殖培养基中，每4周继代一次，增值率达3倍；

(5)生根壮苗培养：将步骤(4)中增殖培养大约8周的、生长健壮的2cm左右的幼苗转接到生根壮苗培养基中进行培养；

(6)生根苗移栽：在步骤(5)中的幼苗培养大约4周后，将根系生长良好的植株转移到自然光下炼苗，然后将其移栽至基质中进行培养。

在一个优选的实施方式中，在本发明的方法中使用的所述萌发培养基为1/5MS+0.1-0.5mg/L NAA+50-150ml/L椰汁+20.0-35.0g/L蔗糖+4.5g/L卡拉胶+0.5-1.5g/L活性炭，更优选地，所述萌发培养基是下面表4中的第⑥号培养基(1/5MS+NAA培养基)。

在可选的实施方式中，在本发明方法中使用的萌发培养基可以含有例如大约20、大约25、大约30、大约35g/L蔗糖及任何两个数值范围之间的点，例如，可以含有大约23、大约24、大约26g/L等的蔗糖。

在一个优选的实施方式中，在本发明的方法中使用的所述萌发培养基为1/5MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.5g/L卡拉胶+1.0g/L活性炭，更优选地，所述萌发培养基是下面表4中的第⑥号培养基(1/5MS+NAA培养基)。

在可选的实施方式中，在本发明的方法中使用的所述萌发培养基是下面表4中的第①至⑧号培养基中的任意一种培养基。例如，所述萌发培养基可以是第①号培养基(花宝1号培养基)、第②号培养基(KC培养基)、第③号培养基(MS+NAA培养基)、第④号培养基(VW培养基)、第⑤号培养基(1/2MS+NAA培养基)、第⑥号培养基(1/5MS+NAA培养基)、第⑦号培养基(RM培养基)或第⑧号培养基(RE培养基)。

在一个实施方式中，在本发明的方法中使用的所述增殖培养基为1/2MS+0.05-1.0mg/L NAA+0.1-2.0mg/L 6-BA+20.0-35.0g/L蔗糖+4.5g/L卡拉胶+50-150ml/L椰汁+0.5-1.5g/L活性炭。

在可选的实施方式中，本发明所述的增殖培养基可以含有例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0mg/L 6-BA以及上述任意数值范围之间的点。

在可选的实施方式中，本发明所述的增殖培养基可以含有例如0.0.5、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/L NAA以及上述任意数值范围之间的点。

在一个优选的实施方式中，在本发明的方法中使用的所述增殖培养基为1/2MS+0.1mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.5g/L卡拉胶+1.0g/L活性炭。

在一个优选的实施方式中，在本发明的方法中使用的所述生根壮苗培养基为1/2MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶+1.5g/L活性炭。

在一个优选的实施方式中，在长瓣兜兰自交后第220天左右、第240天左右、第270天左右、第330天左右、第340天左右或上述任意时间点之间的任意时间点采集果荚。例如，可以在长瓣兜兰自交后第220天左右、第230天左右、第240天左右、第250天左右、第260天左右、第270天左右、第280天左右、第290天左右、第300天左右、第310天左右、第320天左右、第330天左右、第340天左右或上述任意时间点之间的任意时间点采集果荚。优选地，在长瓣兜兰自交后第270-330天左右、第300-330天左右或第330-340天左右采摘果荚，更优选地在长瓣兜兰自交后第270-330天左右采摘果荚，甚至更有选地在长瓣兜兰自交后第330天左右采摘果荚。

在一个实施方式中，在本发明的方法中，培养室培养的温度为24±2℃，光照强度为1000-15001x，光照周期为12h；黑暗培养温度为24±2℃。

本发明的第二方面提供了一种用于长瓣兜兰组织培养快速繁殖的萌发培养基，所述萌发培养基为1/5MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.5g/L卡拉胶+1.0g/L活性炭，更优选地，所述萌发培养基是下面表4中的第⑥号培养基(1/5MS+NAA培养基)。

在可选的实施方式中，所述萌发培养基可以是下面表4中的第①至⑧号培养基中的任意一种培养基。例如，所述萌发培养基可以是第①号培养基(花宝1号培养基)、第②号培养基(KC培养基)、第③号培养基(MS+NAA培养基)、第④号培养基(VW培养基)、第⑤号培养基(1/2MS+NAA培养基)、第⑥号培养基(1/5MS+NAA培养基)、第⑦号培养基(RM培养基)或第⑧号培养基(RE培养基)。

本发明的第三方面提供了一种用于长瓣兜兰组织培养快速繁殖的培养基体系，其包含萌发培养基、增殖培养基和生根壮苗培养基，其中所述萌发培养基为1/5MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.5g/L卡拉胶+1.0g/L活性炭。

在一个优选的实施方式中，所述萌发培养基是下面表4中的第⑥号培养基(1/5MS+NAA培养基)。

在可选的实施方式中，所述萌发培养基可以是上述任何一种萌发培养基。

在一个优选的实施方式中，本发明的培养基体系中的所述增殖培养基为1/2MS+0.1mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.5g/L卡拉胶+1.0g/L活性炭。

在一个优选的实施方式中，本发明的培养基体系中的所述生根壮苗培养基为1/2MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶+1.5g/L活性炭。

在一个优选的实施方式中，本发明的培养基体系是下面表1所示的培养基体系，表1列出了本发明培养基体系中的各种培养基的成分及其用量。

表1.长瓣兜兰的离体培养基体系

注：表1中的生根壮苗培养基，既可作为一般生根壮苗培养基，也是本发明所指的可用来做长期继代的培养基。

定义

为了便于对本发明的理解，对上述各个方面中所用的培养基、培养基中所用到的植物激素进行定义。

本发明所使用的MS基本培养基是根据Murashige T.等(Murashige T.and F.Skoog.Physiol.Plant,1962,15:473-497)配制的，其成分及各成分含量如下表2所示。1/2MS为MS基本培养基中大量元素减半，其他元素用量不变；1/5MS为MS基本培养基中大量元素减至五分之一，其他元素用量不变。

本文中培养基中的成分“NAA”是指萘乙酸。

本文中所述的“6-BA”是指6-苄氨基嘌呤。

表2.MS培养基各成分及含量

本发明的有益技术效果

本发明产生的积极效果是：

(a)本发明所采用的外植体可在某固定时间段大量集中获得并进行组织培养，打破了外植体不易获得且污染率高的限制；

(b)本发明确定了长瓣兜兰最佳果荚采收时间，发芽率最高，且种苗生长强壮；

(c)本发明确定了长瓣兜兰最佳萌发培养基，大大提高了种子的萌发率以及后期的成活率；以及

(d)本发明还提供了包括萌发培养基、增殖培养基和生根壮苗培养基的培养基体系，培养基配方简单，离体快繁的操作流程简洁易操作，生产低成本，可进行商业化大规模生产。

前述内容仅仅是示意性的并且决不旨在是限制性的。除了上述示意性方面、实施方式和特征，通过参考下述详细说明，进一步的方面、实施方式和特征将更容易被理解。

附图简述

通过参考下述附图，本发明的进一步的方面、特征将更容易被理解。本领域技术人员应该理解，这些附图仅示意性地阐述了根据本发明的一些实施方式，而不应将其视为是对本发明范围的限制。

图1示出了长瓣兜兰授粉过程的示意图。

图2示出了不同时期采集的兜兰种子的萌发情况。

图3示出了在12h光照周期培养后8周左右，长瓣兜兰在9种不同萌发培养基上的萌发情况的照片，其中各培养基如下面表4所示。

图4示出了在12h光照周期培养后8周左右，长瓣兜兰在9种不同萌发培养基上的平均萌发率的柱状图，其中各培养基如下面表4所示。

图5示出了根据本发明一个方面的长瓣兜兰组培快繁技术体系的流程图。

图6示出了根据本发明一个方面的长瓣兜兰的组织培养过程图。

图7示出了长瓣兜兰的出瓶炼苗情况。

具体实施方式

在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。

实施例1.长瓣兜兰自交授粉和果荚最佳采摘期的确定

实验材料：长瓣兜兰获取自中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室；本发明所有实施例中使用的各种试剂或培养基成分均经商购获得。

选择花大色艳的长瓣兜兰进行人工异花授粉，如图1所示，授粉后生长得到果荚。

授粉后，分别在第240天、第270天、第300天、第330天、第360天、第390天以及第420天收集果荚。

将上述果荚分别用自来水洗净后，置于10％次氯酸钠溶液中消毒20分钟，用70％酒精表面消毒30秒，再以0.1％升汞消毒10分钟，最后用无菌水冲洗5次。将洗净的果荚切开，将种子接种于培养基上行进行暗培养40天，待30％种子长出原球茎，转为光照周期为12h培养。培养条件为：培养室培养的温度为24±2℃，光照强度为1000-15001x，光照周期为12h；黑暗培养温度为24±2℃。

结果发现，在第240天采集的种子的萌发率可高达75％以上，而在第330天采集的种子的萌发率达到峰值，在第360天以及以后采集的种子的萌发率大大降低，如下表3所示。采用的培养基为1/5MS+0.3mg/LNAA+100ml/L椰汁+1.0g/L活性炭。

表3.不同采收期(240-420天)种子的萌发情况表

实施例2.长瓣兜兰种子最佳萌发培养基的确定

设计8种不同的萌发培养基，以现有技术中已有的MS培养基补充以蔗糖和卡拉胶(第⑨号萌发培养基)作为对照，如表4所示。

表4. 9种培养基各成分及含量

按照如实施例1所述的方法，将授粉后第330天采集的果荚中的种子分别接种于上述表4中的9种培养基中进行萌发培养，观察种子的萌发情况。

结果发现，长瓣兜兰的种子在本发明设计的8种萌发培养基中均能良好地萌发，萌发率显著高于对照培养基，其中在第⑥号培养基中的萌发率最高，达78.76％(如图3-4所示)。

实施例3.长瓣兜兰种子最佳增殖培养基的确定

设计5种不同的增殖培养基，如表5所示。

表5.不同增殖培养基上长瓣兜兰原球茎增殖与分化情况

将实施例2中培养的幼苗接种到上述增殖培养基中，每4周继代一次，观察幼苗的增殖情况。

增殖培养大约8周左右，发现幼苗在第2种增殖培养基中的增殖效果好，愈伤上长原球茎，且幼苗健壮。

实施例4.长瓣兜兰种子的组织培养快速繁殖

如附图5-7所示，本发明的长瓣兜兰种子的组织培养快速繁殖方法包括如下步骤：

1、自交授粉：选择花大色艳的长瓣兜兰进行异花授粉；

2、果荚采摘：在长瓣兜兰自交后270天左右采集果荚；

3、无菌播种：按照实施例1中所述的方法以采集的果荚为外植体进行消毒，切开果荚将种子接种在萌发培养基中进行暗培养40天，待30％种子长出原球茎，转为光照周期为12h培养，种子萌发率可达80.32％，其中萌发培养基为表4中的第⑥号培养基；

4、增殖继代培养：将步骤3中产生的幼苗接种到增殖培养基中，每4周继代一次，增值率达3倍，其中增殖培养基为1/2MS+0.1mg/L NAA+100ml/L椰汁+0.5mg/L 6-BA；

5、生根壮苗培养：将步骤4中增殖培养8周的、生长健壮的2cm左右的幼苗转接到生根壮苗培养基中进行培养，其中生根壮苗培养基为1/2MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶+1.5g/L活性炭；

6、生根苗移栽：在步骤5中的幼苗培养4周后，将根系生长良好的植株转移到自然光下炼苗，然后将其移栽至基质中进行培养，成活率可达95％。

实施例5.长瓣兜兰种子的组织培养快速繁殖

如附图5-7所示，本发明的长瓣兜兰种子的组织培养快速繁殖方法包括如下步骤：

1、自交授粉：选择花大色艳的长瓣兜兰进行异花授粉；

2、果荚采摘：在长瓣兜兰自交后300天左右采集果荚；

3、无菌播种：按照实施例1中所述的方法以采集的果荚为外植体进行消毒，切开果荚将种子接种在萌发培养基中进行暗培养40天，待30％种子长出原球茎，转为光照周期为12h培养，种子萌发率可达75.96％，其中萌发培养基为表4中的第⑥号培养基；

4、增殖继代培养：将步骤3中产生的幼苗接种到增殖培养基中，每4周继代一次，增值率达3倍，其中增殖培养基为1/2MS+0.1mg/L NAA+100ml/L椰汁+0.5mg/L 6-BA；

5、生根壮苗培养：将步骤4中增殖培养8周的、生长健壮的2cm左右的幼苗转接到生根壮苗培养基中进行培养，其中生根壮苗培养基为1/2MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶+1.5g/L活性炭；

6、生根苗移栽：在步骤5中的幼苗培养4周后，将根系生长良好的植株转移到自然光下炼苗，然后将其移栽至基质中进行培养，成活率可达95％。

实施例6.长瓣兜兰种子的组织培养快速繁殖

如附图5-7所示，本发明的长瓣兜兰种子的组织培养快速繁殖方法包括如下步骤：

1、自交授粉：选择花大色艳的长瓣兜兰进行异花授粉；

2、果荚采摘：在长瓣兜兰自交后330天左右采集果荚；

3、无菌播种：按照实施例1中所述的方法以采集的果荚为外植体进行消毒，切开果荚将种子接种在萌发培养基中进行暗培养40天，待30％种子长出原球茎，转为光照周期为12h培养，种子萌发率可达82.56％，其中萌发培养基为表4中的第⑥号培养基；

4、增殖继代培养：将步骤3中产生的幼苗接种到增殖培养基中，每4周继代一次，增值率达3倍，其中增殖培养基为1/2MS+0.1mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.5g/L卡拉胶+1.0g/L活性炭；

5、生根壮苗培养：将步骤4中增殖培养8周的、生长健壮的2cm左右的幼苗转接到生根壮苗培养基中进行培养，其中生根壮苗培养基为1/2MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶+1.5g/L活性炭；

6、生根苗移栽：在步骤5中的幼苗培养4周后，将根系生长良好的植株转移到自然光下炼苗，然后将其移栽至基质中进行培养，成活率可达95％。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到其各种变化或替换，这些都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。