蛋白激酶A激活剂在血小板保存中的应用及血小板保存方法与流程

本发明属于血小板保存技术领域，具体涉及蛋白激酶a激活剂在血小板保存中的应用及血小板保存方法。

背景技术：

血小板是循环系统中调节血栓形成与病理性出血的关键因素，同时在机体的免疫反应、感染、动脉粥样硬化形成以及肿瘤转移等病理生理过程中也发挥着重要作用。然而，血小板生命周期较短，在外周血中只能存活8-9天。血小板减少导致的致命性的出血往往感染、免疫性血小板减少症、糖尿病以及一些药物治疗等许多常见的疾病中，而这些疾病所引起的血小板寿命缩短的机制还尚未完全明确。此外，短寿命的血小板，尤其是存储病变，限制了血小板临床应用的有效期。因此，探讨调控血小板寿命和生存的机制具有重要的病理生理意义。

储存血小板造成的损伤严重限制了血小板在血小板减少症的临床应用，这是一个公认的世界性难题，凋亡似乎是导致存储损伤的主要原因，人们试图通过抑制caspase以及相关的酶来减轻血小板的存储病变，然而到目前为止并没有取得实质性的进展。近年来涌现的大量血小板凋亡的相关实验研究揭示了调控血小板生存周期的奥秘，研究显示了凋亡蛋白在调节血小板寿命和血小板生存中具有重要作用，而在生理或病理条件下血小板凋亡的启动和抑制机制目前仍不十分清楚。

血小板是血液主要成分之一，参与机体凝血过程、发挥正常的止血功能，防止损伤后血液丢失，故输注血小板成为临床治疗中的一种常用方法。血小板采集后，如果不能较快用于临床，必须尽快保存。所以血小板必须有适宜的保存技术，才能既节约血液资源，又可储存。但由于血小板寿命短，结构和功能易受多种因素的影响，应用于临床前需合理有效保存。洗涤血小板不仅能解决血浆过敏、iga缺乏、同种免疫等患者的血小板输注无效治疗问题,而且对血小板输注中预防非溶血性发热反应、急性血管内溶血反应有一定的作用，同时浓缩血小板产品中残留的白细胞与血小板竞争血浆中的营养，可加速血小板贮存损伤,而且可直接产生有害影响，引起同种免疫和eb病毒感染。目前血小板室温保存温度为22±2℃，但是保存时间为3天左右。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种蛋白激酶a激活剂在血小板保存中的应用及血小板保存方法，以延长血小板保存寿命。

本发明采用如下技术方案，蛋白激酶a激活剂在抑制血小板凋亡或者保持血小板活性中的应用。

本发明还公开了蛋白激酶a激活剂在血小板保存中的应用。

本发明还公开了蛋白激酶a激活剂在延长血小板存活时间中的应用。

本发明还公开了蛋白激酶a激活剂在制备血小板保存添加试剂中的应用。

上述技术方案中，所述血小板保存在4～15℃下，优选10℃。10℃环境与蛋白激酶a激活剂协同作用可进一步抑制凋亡蛋白caspase-3活化及上调抗凋亡蛋白bcl-xl的表达，延长血小板保存时间。

上述技术方案中，所述蛋白激酶a激活剂包括磷酸二脂酶抑制剂、腺苷酸环化酶激活剂、环磷腺苷、环磷腺苷衍生物；所述磷酸二脂酶抑制剂包括磷酸二脂酶无机物抑制剂、磷酸二脂酶有机物抑制剂；所述腺苷酸环化酶激活剂包括腺苷酸环化酶无机物激活剂、腺苷酸环化酶有机物激活剂；所述环磷腺苷衍生物包括以环磷腺苷为核心成分的修饰物。本发明实施例可以看出蛋白激酶a激活剂可减少ps外翻、上调抗凋亡蛋白bcl-xl表达，说明其对于血小板的凋亡起到抑制作用。

比如本发明的蛋白激酶a激活剂为氨力农、米力农、依诺昔酮、氨茶碱、地诺前列酮、伊洛前列素、西洛他唑、西洛酰胺、双嘧达莫中、银杏叶提取物、槲皮素、环磷腺苷葡胺、环磷腺苷、佛司可林、8-溴腺苷-3′,5′-环单磷酸、8-溴代-环磷腺苷、8-哌啶基腺苷-环磷腺苷、8-氯代-环磷腺苷、腺苷酸3,5-环单磷酸盐、n6-苯甲酰基-环磷腺苷、(s)-腺苷酸、环3',5'-(氢硫代磷酸酯)三乙基、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、8-氯苯-环磷腺苷、腺苷酸3,5-环单磷酸盐、腺苷酸3,5-环单硫代磷酸酯、8-溴代-环磷腺苷、特异性5,6-4,5-二氰基咪唑-环磷铋苷、特异性8-氯苯-环鸟苷酸钠、特异性腺苷酸3',5'-环单硫代磷酸酯三乙基盐、特异性环磷腺苷、联丁酰基-环磷腺苷、n6-单酰腺苷3'，5'-环单磷酸盐、8-溴代腺苷酸3',5'-环单磷酸硫酯、8-溴代腺苷酸3',5'-环单磷酸盐、n6-苯甲酰基-环磷腺苷、赤-9-氨基-β-己基-α-甲基-9h-嘌呤-9-盐酸乙醇-9-腺嘌呤盐酸中的一种或几种；其中佛司可林（forsklin），即毛喉素，是一种分离自印度植物coleusforskohlii的天然二萜产物，为真核细胞腺苷酸环化酶（ac）激活剂。

本发明还公开了一种血小板保存方法，包括以下步骤，将蛋白激酶a激活剂加入洗涤后的血小板中，然后保存。

上述技术方案中，血小板于4～15℃保存，优选10℃。

本发明进一步公开了一种延长血小板保存时间的试剂的制备方法，由蛋白激酶a激活剂制备得到。同时本发明公开了一种用于血小板保存的添加试剂，包括蛋白激酶a激活剂，还可以包括分散介质，比如缓冲介质。

本发明在血小板凋亡的诱导和调节机制仍未可知的情况下首次公开了蛋白激酶a激活剂在抑制血小板凋亡或者保持血小板活性中的应用，可抑制磷脂酰丝氨酸外翻，上调抗凋亡蛋白bcl-xl表达，够保护血小板在储存和病理性应激条件下免受凋亡的影响，从而延长血小板存活时间。

附图说明

图1为流式细胞术检测经forskolin和dmso处理后洗涤血小板的ps外翻结果图；

图2为westernblot法检测不同方法处理后血小板抗凋亡蛋白bcl-xl的表达图；

图3为westernblot法检测两种方法处理后洗涤血小板抗凋亡蛋白bcl-xl表达图；

图4为洗涤血小板△ψm去极化结果图；

图5为洗涤血小板ps外翻结果图；

图6为流式细胞仪分析结果图；

图7为h89、forskin以及dmso处理后的血小板电泳图；

图8为预处理的血小板裂解后的电泳图；

图9为bad与bcl-xl在线粒体结合共存图；

图10为bad在线粒体上的表达图；

图11为瑞斯托霉素诱导的血小板聚集图；

图12为胶原诱导的血小板聚集图；

图13为血栓形成和荧光标记血小板在血栓中的情况图。

具体实施方式

本实施例的试剂与材料：

jc-1、forskolin、钙离子载体a23187、抗caspase-3单克隆抗体为碧云天公司产品，溶剂二甲亚枫（dimethylsulfoxide，dmso）为美国sigma公司产品。annexinv-fitc凋亡检测试剂盒为嘉美生物公司产品。苯甲基磺酰氟（pmsf）为美国amresco公司产品，聚偏二氟乙烯膜（pvdf膜）为美国bio-rad公司产品，兔抗人bcl-xl、β-actin为美国cst公司产品，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体为美国santacruz公司产品，ecl为美国advansta公司产品。低俗离心机1-16型（sigma，usa）；流式细胞仪fc500型（beckmancoulter，usa）;垂直电泳设备（bio-rad，usa）。

洗涤血小板，抽取健康无出血性疾病的献血人员的静脉血，按7:1体积比例加入抗凝剂葡萄糖柠檬酸钠（acd2.5％柠檬酸三钠，2.0%葡萄糖，1.5%柠檬酸）。抗凝后的全血在100g（1100r.p.m）下离心11分钟，离心后下层为红细胞，上层为富含血小板的血浆。将上层液体转移至新离心管。富含血小板的血浆在825g（3000r.p.m）下离心2分钟，沉淀为血小板，上层液体为乏血小板血浆。弃上清后，将血小板重悬于与富含血小板血浆等体积的cgs缓冲液（0.123mol/l氯化钠，0.033mol/l葡萄糖，0.013mol/l柠檬酸钠，ph6.5）中，在270g（2000r.p.m）下离心2分钟以洗去血浆蛋白。沉淀的血小板最终重悬于一定体积的改良tyrode缓冲液（2.5mmol/lhepes，150mmol/l氯化钠，2.5mmol/l氯化钾，12mmol/l碳酸氢钠，5.5mmol/l葡萄糖，1mmol/l氯化钙，1mmol/l氯化镁，ph7.4），浓度为3×108/ml。重悬后的洗涤血小板在室温下放置1小时以使其恢复至生理状态后用于后续实验。

流式细胞术检测△ψm去极化，无菌条件下将未处理洗涤血小板分别在0℃、4℃、10℃、22℃及37℃等5个温度中保存5天。分别在1d、2d、3d、4d及5d取各个不同温度保存的洗涤血小板（50μl）以及常温下加入a23187处理的洗涤血小板（50μl），加入jc-1(2μg/ml)、dmso和mtb混合液中室温孵育10min，最后进行流式细胞仪分析。

流式细胞仪测定ps外翻，无菌条件下洗涤血小板分为3组：（ⅰ）未处理组，（ⅱ）加入forskolin，（ⅲ）加入dmso（0.5%），将三种血小板在0℃、4℃、10℃、22℃及37℃等5个温度中保存5天，在1d、2d、3d、4d及5d各取三种血小板（5μl）以及常温下加入a23187处理的洗涤血小板（5μl），分别加入annexinv-fitc5μl和150μl1×loadingbuffer混匀后，室温避光孵育15分钟，上机前补加350μl1×loadingbuffer。最后进行流式细胞仪分析。

westernblot检测bcl-xl蛋白表达，无菌条件下洗涤血小板分为3组：（ⅰ）未处理组，（ⅱ）加入forskolin，（ⅲ）加入dmso（0.5%），将三种血小板在0℃、4℃、10℃、22℃及37℃等5个温度中保存5天，在1d、2d、3d、4d及5d各取三种血小板（50μl）及常温下加入a23187处理的新鲜洗涤血小板（50μl），加入等体积裂解液（含pmsf）冰上裂30min，3500r/min离心2min，取上清再加入4x上样缓冲液和ß-巯基乙醇，煮沸10min。样本进行sds-page，转移至pvdf膜。5%牛奶封闭后tbst洗膜，抗bcl-xl单克隆抗体（1:1000稀释）及抗β-actin单克隆抗体（1:1000稀释）4℃过夜孵育。经tbst洗膜后辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体（1:8000稀释）室温孵育1h。再次tbst洗膜并采用ecl法检测bcl-xl及β-actin条带。

数据统计分析，所有实验结果至少重复3次。应用spss16.0软件对实验数据进行统计分析，实验数据以均数±标准差表示，不同组之间的比较采用one-wayanova进行统计分析，p<0.05表示有统计学差异。

实施例

无菌条件下，洗涤血小板分为三组，未处理组、加入5μmforsklin组、加入0.5%dmso组；将三组血小板均分，在0℃、4℃、10℃、22℃、37℃保存5天，每天各取5μl，以常温下加入a23187处理的洗涤血小板5μl为对照。

图1为流式细胞术检测经forskolin和dmso处理后洗涤血小板保存五天的ps外翻结果。以dmso组为对照，ps外翻百分比以均数±标准差表示，以上实验重复5次，p<0.05；与dmso组血小板对比，相同时间及保存环境中forskolin组洗涤血小板ps外翻百分比降低，且随时间延长降低越加明显，第5天forskolin对保存在各温度环境中的洗涤血小板ps外翻作用差异均具有统计学意义；结果显示forskolin对洗涤血小板凋亡具有抑制作用。

图2为westernblot法检测不同方法处理后血小板保存五天抗凋亡蛋白bcl-xl的表达，其中各图中（-）代表新鲜未处理洗涤血小板，a代表经a23187处理的新鲜洗涤血小板，0、4、10、22、37分别代表对应保存温度（重复3次）；表明不同温度洗涤血小板存在不同程度凋亡，且forskolin对血小板ps外翻具有抑制作用。westernblot结果显示，与对照组相比，同一时间同一温度forskolin组洗涤血小板bcl-xl表达量上升，表明forskolin具有上调洗涤血小板bcl-xl表达的作用。

图3为westernblot法检测两种方法处理后洗涤血小板抗凋亡蛋白bcl-xl表达，（a）为连续5天抗凋亡蛋白bcl-xl表达变化，（b）为第1天和第5天洗涤血小板抗凋亡蛋白bcl-xl表达变化（重复3次）；可以看出dmso组洗涤血小板22℃保存连续5天抗凋亡蛋白bcl-xl表达随时间的延长表达明显下降，而forskolin组洗涤血小板第1天与第5天相比未见明显下降（图3b），表明forskolin对洗涤血小板抗凋亡起到促进作用。

血小板凋亡是储存血小板发生功能紊乱并被快速清除的主要原因，线粒体膜电位去极化调控的内在程序性凋亡是一个不可逆转的过程。图4为洗涤血小板△ψm去极化结果图；图5为洗涤血小板ps外翻结果图；图6为流式细胞仪分析结果图；其中图4、图5中3×10⁸/ml洗涤血小板分别用25um的h89、5um的forskin以及dmso内参22℃预处理不同的时间点，图4加入的jc-1使其终浓度为2µg/ml，避光孵育10min；图5与5µg/ml的lactadherin避光孵育30分钟，不同处理的血小板经流式细胞仪检测线粒体跨膜电位去极化(图4)和ps阳性血小板(图5)的百分比，结果用均数±标准差表示，图6中3×10⁸/ml洗涤血小板分别用25um的h89、5um的forskin以及dmso内参22℃孵育72小时，血小板被标记后经尾静脉回输入小鼠体内，眼眶静脉采血收集全血，流式细胞仪分析检测标记的血小板，实验重复三次以上；结果显示在血小板储存时加入蛋白激酶a（pka）激活剂，根据本发明，pka激活剂明显抑制血小板凋亡的发生；这些数据不仅进一步验证pka调节血小板凋亡的作用，而且也表明pka位于线粒体去极化调节细胞凋亡的上游。

图7为h89、forskin以及dmso处理后的血小板电泳图；洗涤血小板分别用37.5um的h89、10um的forskin以及dmso内参常温下预处理160分钟，分别提取血小板的胞浆蛋白和线粒体蛋白，westernblot检测目的蛋白，imagej软件分析目的蛋白的量，统计四次实验以均数±标准差显示结果；图8为预处理的血小板裂解后的电泳图，17000g4℃离心10分钟，将得到的上清与相应抗体孵育沉淀过夜，与proteina/g+琼脂糖珠4℃孵育2小时后，将珠子洗脱后用于蛋白杂交，统计分析四次实验以均数±标准差显示结果，*p<0.05,**p<0.01；图9为bad与bcl-xl在线粒体结合共存图；图10为bad在线粒体上的表达图。研究发现，pka激动剂forskolin能够增强bad155位点的丝氨酸磷酸化水平，并调控14-3-3蛋白与抗凋亡蛋白bcl-xl的绑定，进而调控细胞凋亡。免疫共沉淀结果显示h89或forsklin刺激下，bcl-xl与bad之间的作用明显减少或增强，14-3-3与bad之间的结合却与之相反；此外，bad与bcl-xl在线粒体结合共存，h89能够增强而forskolin可以减少bad在线粒体上的表达，这些数据表明pka通过调控丝氨酸磷酸化减缓血小板的凋亡。

人的洗涤血小板（3×10⁸/ml）分别用5um的forskin以及dmso内参22℃预处理96小时，使用血小板聚集仪检测瑞斯托霉素(图11)和胶原（图12）诱导的血小板聚集。结果表明，forskin能够保持血小板聚集功能。小鼠洗涤血小板（3×10⁸/ml）分别用25um的h89、5um的forskin以及dmso内参22℃孵育96小时，血小板被标记后经尾静脉回输入小鼠体内，小鼠肠系膜血管，fecl3损伤后，记录血栓形成和荧光标记血小板在血栓中的情况（图13），结果表明，forskin能够保持血小板粘附和形成血栓功能。

改变forsklin组添加量，比如2um、8um；22℃孵育72小时，血小板被标记后经尾静脉回输入小鼠体内，眼眶静脉采血收集全血，流式细胞仪分析检测标记的血小板，实验重复三次以上；结果显示血小板存活率在70%以上；10℃孵育72小时，存活率达到82%以上，120小时达到71%以上；4℃、15℃孵育72小时，存活率达到77%、78%以上。22℃预处理96小时，使用血小板聚集仪检测瑞斯托霉素和胶原诱导的血小板聚集，结果表明，forskin能够保持血小板聚集功能，聚集率都达到70%，4℃、15℃孵育达到75%；10℃预处理96小时、140小时，使用血小板聚集仪检测瑞斯托霉素和胶原诱导的血小板聚集，结果表明，forskin能够保持血小板聚集功能，聚集率都达到81%、68%。

采用氨力农、环磷腺苷葡胺替换forskin用于血小板的保存，添加5um，22℃孵育72小时，血小板被标记后经尾静脉回输入小鼠体内，眼眶静脉采血收集全血，流式细胞仪分析检测标记的血小板，实验重复三次以上，结果显示血小板存活率在70%以上，10℃孵育72小时，存活率达到82%以上，15℃孵育72小时，存活率达到75%以上。

本发明将洗涤血小板分为3组：（ⅰ）未处理组，（ⅱ）加入蛋白激酶a活化剂比如forskolin，（ⅲ）加入dmso，将三种血小板在0℃、4℃、10℃、22℃及37℃等5个温度中保存5天。连续五天对各标本进行相关指标的检测。应用流式细胞技术检测线粒体膜电位（△ψm）去极化和磷脂酰丝氨酸（ps）外翻的改变。应用westernblot检测洗涤血小板凋亡指标caspase-3和bcl-xl的表达情况。结果显示：在相同时间及温度下，未处理组洗涤血小板连续5天保存在五个温度中均发生线粒体膜电位去极化和磷脂酰丝氨酸外翻，forskolin可抑制磷脂酰丝氨酸外翻；当仅有保存温度不同时，保存于10℃的洗涤血小板抗凋亡蛋白bcl-x表达未见明显下降，但是forskolin上调抗凋亡蛋白bcl-xl表达；表明forskolin对血小板起到抑制凋亡的作用，延长保存血小板的时间，与10℃环境协同作用可进一步抑制凋亡蛋白caspase-3活化及上调抗凋亡蛋白bcl-xl的表达。

血小板凋亡限制了它的寿命，许多疾病引起的血小板凋亡能够导致血小板减少症，但是血小板凋亡的启动和调节机制目前还未完全阐明。根据本发明的技术方案，提高储存血小板pka活性，减缓启动血小板内源性的程序性死亡，避免在体内引起血小板减少症。更重要的是，本发明不但能够保护储存的血小板而且能够改善体内多种病理性刺激造成的血小板损伤，延长血小板的寿命；结果证实本发明对病理生理状态下血小板的稳定起很大作用。采用本发明的技术方案，pka通过磷酸化bad促凋亡蛋白的155位点的丝氨酸残基增强与14-3-3的结合，从而促进抗凋亡蛋白bcl-xl释放来抑制血小板凋亡，抑制血小板中bcl-xl的降解，防止储存血小板凋亡，避免体外血小板凋亡以及体内的急性血小板减少症，能够保护血小板免受多种刺激诱导的凋亡，可动物提高外周血中血小板的数量。储存血小板造成的损伤严重限制了血小板在血小板减少症的临床应用，这是一个公认的世界性难题。凋亡是导致存储损伤的主要原因，人们试图通过抑制凋亡蛋白以及相关的酶来减轻血小板的存储病变，然而到目前为止并没有取得实质性的进展。本发明公开的技术方案是一种改善储存血小板生存期的新策略，结果表明本发明通过调控凋亡决定血小板的寿命和生存，对改善血小板储存、提高血小板的临床应用具有深远意义。