一种病毒媒介昆虫烟粉虱的人工饲养方法与流程

本发明涉及昆虫饲养
技术领域：
，尤其涉及一种病毒媒介昆虫烟粉虱的人工饲养方法。
背景技术：
：烟粉虱bemisiatabaci，给蔬菜和粮食作物等带来了非常严重的损失，我国主要有b和q两种烟粉虱。烟粉虱可传播多种植物病毒，其传播病毒造成的危害远远高于自身取食造成的危害。要想控制烟粉虱传播病毒，首先要研究烟粉虱传播病毒的机制，因此便需要建立能够持续供应的携带病毒且种群稳定的烟粉虱，并有相同条件下饲养的不带毒的烟粉虱作为对照。同时，为了消除田间植物病毒复合侵染的影响，必须用病毒的侵染性克隆对植物进行接种，保证毒源的单一性。此外，需要对烟粉虱和病毒的寄主植物进行筛选，使其能在病毒侵染和烟粉虱取食的双重压力下仍保持活力。由于涉及寄主植物、病毒和烟粉虱三个重要因素，导致目前该技术发展缓慢，只要有一个环节出错，便会延长试验时间，阻碍试验进程。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能够同时获得不同种群的携带病毒的烟粉虱以及不带毒的烟粉虱的人工饲养方法，具有昆虫的发育时间短，产卵量高，存活率高，保证供试材料的持续、稳定供应等优势。为了实现上述技术效果，本发明提供了一种病毒媒介昆虫烟粉虱的人工饲养方法，包括以下步骤：s1、以长出真叶的蔬菜为寄主植物；将侵染性克隆菌液接种到寄主植物中；s2、继续培养，并筛选出已感病的植株和无毒植株；s3、分别将b烟粉虱和q烟粉虱接种到所述已感病的植株和所述无毒植物上得到接种有b烟粉虱的已感病植株、接种有q烟粉虱的已感病植株、接种有b烟粉虱的无毒植株、接种有q烟粉虱的无毒植株；s4、分别将所述接种有b烟粉虱的已感病植株、接种有q烟粉虱的已感病植株、接种有b烟粉虱的无毒植株、接种有q烟粉虱的无毒植株单独饲养，使烟粉虱进行繁育；s5、饲养6代以上，进行烟粉虱取虫。上述的人工饲养方法，优选的，所述s1步骤中所述寄主植物为长出3～4片真叶的蔬菜。上述的人工饲养方法，优选的，所述寄主植物的培养包括以下步骤：将蔬菜种子播种在以泥炭、蛭石、有机肥料和珍珠岩为基质的无虫笼里，直至蔬菜长出3～4片真叶。上述的人工饲养方法，优选的，所述无虫笼为铝合金制成的框架笼，底层和正面上端是用玻璃制成，顶层、两侧及后面是用100目尼龙网制成，正面下端是100目尼龙网制成的门。上述的人工饲养方法，优选的，所述泥炭∶蛭石∶有机肥料∶珍珠岩的比例为10∶10∶10∶1。上述的人工饲养方法，优选的，所述s1步骤中，将侵染性克隆菌液接种到寄主植物，具体步骤为：s1-1、将侵染性克隆在yep固体培养基上活化，挑取固体培养基上的单菌落，并置于yep液体培养基中培养获得侵染性的克隆菌液；s1-2、将所述侵染性的克隆菌液离心后取沉淀，将悬浮液对所述沉淀重悬浮得到病毒的农杆菌侵染性克隆菌液；所述悬浮液包括10mmmes、10mmmgcl2、200mm乙酰丁香酮(acetosyringone)；s1-3、将所述病毒的农杆菌侵染性克隆菌液注射到寄主植物中，继续培养直至寄主植物长有6～7片真叶。mes又名2-(n-吗啉)-乙基磺酸。上述的人工饲养方法，优选的，所述s4步骤中，所述使烟粉虱进行繁育的具体步骤为：光照14小时，并控制光照时温度为28℃；黑暗10小时，并控制黑暗时温度为25℃，饲养过程中过程中湿度保持在60％。上述的人工饲养方法，优选的，所述s5步骤中，所述s5步骤中，所述烟粉虱取虫包括以下步骤：采用小型昆虫吸虫器采集烟粉虱，吸取所需数量的昆虫，随后用手指轻轻堵住小型昆虫吸虫器尖端，将其转移到离心管中，进行后续试验。上述的人工饲养方法，优选的，所述小型昆虫吸虫器包括第一枪头、第二枪头、乳胶管和纱网，所述第一枪头接口端与乳胶管的一端连接，在连接处设置有纱网；所述第二枪头的尖端与所述乳胶管另一端连接。优选的，所述乳胶管为透明乳胶管。上述的人工饲养方法，优选的，所述第一枪头尖端剪去1cm，所述第二枪头尖端剪去0.5cm长，所述乳胶管直径为1cm、长度为20cm；所述纱网为100目。与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明提供了一种病毒媒介昆虫烟粉虱的人工饲养方法，能够同时获得不同种群的携带病毒的烟粉虱以及不带毒的烟粉虱，具有如下优点：1、可取生长发育一致的烟粉虱进行研究，与大田环境相比，可缩短昆虫的发育时间，提高产卵量，保证存活率，保证供试材料的持续、稳定供应。2、不带毒烟粉虱和饲养所用植物单独饲养，隔离效果好，保证样品纯度。3、用侵染性克隆接种生长发育一致的植物，定期检测，保证毒源供应稳定，带毒均匀。4、健康植株和带毒植株持续供应，保证烟粉虱活力。(2)本发明提供了一种病毒媒介昆虫烟粉虱的人工饲养方法，供试植物养在干净的无虫笼里，无虫笼是铝合金制成的框架笼，规格为60cm×40cm×80cm，底层和正面上端是用玻璃制成，顶层、两侧及后面是用100目尼龙网制成，正面下端是100目尼龙网制成的门，这种无虫笼的玻璃和尼龙网构造，既满足了植物生长过程中需要的光源和通透性，又防止了烟粉虱的逃逸，且铝合金框架坚固耐用。(3)本发明提供了一种病毒媒介昆虫烟粉虱的人工饲养方法，以泥炭∶蛭石∶有机肥料∶珍珠岩的比例为10∶10∶10∶1为基质种植蔬菜种子，既保证了土壤的通透性，又保证了肥料的供应，能够使植物健康生长。(4)本发明提供了一种病毒媒介昆虫烟粉虱的人工饲养方法，在病毒接种过程中，采用50ml悬浮液(含10mmmes、10mmmgcl2、200mm乙酰丁香酮)对菌体进行重悬浮的目的是调整菌液浓度，使其od600值在1.0～1.5的范围内，能够促进病毒接种后的发病，使接种的植物感染病毒率较高。(5)本发明提供了一种病毒媒介昆虫烟粉虱的人工饲养方法，在烟粉虱取虫的过程中，采用小型昆虫吸虫器采集烟粉虱，用直径1cm、长度为20cm的乳胶管加工而成，将1ml蓝枪头尖端剪去约1cm长的一小截，乳胶管的尾部接入蓝枪头后端，中间用100目纱网隔离，乳胶管的头部接入蓝枪头尖端，用嘴对准乳胶管头部的蓝枪头吸取所需数量的昆虫，小型昆虫吸虫器。这样设计的作用是借助气流的作用将烟粉虱吸入一个相对较小的空间，可将大量烟粉虱短时间转移到所需要的试验器材中，且防止了取虫过程中对烟粉虱的伤害，中间用100目纱网隔离的作用是防止将烟粉虱吸入嘴里。附图说明为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。图1是本发明实施例1中人工饲养的流程图。图2是本发明实施例1中小型昆虫取虫器的结构示意图，其中，1：第一枪头、2：第二枪头、3：乳胶管、4：纱网。具体实施方式以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。以下实施例和对比例中所采用的材料和仪器均为市售。实施例1一种本发明的病毒媒介昆虫烟粉虱的人工饲养方法，参见图1，包括寄主植物培养、病毒接种、烟粉虱接种、烟粉虱繁育、取虫等步骤，具体为：(1)寄主植物培养：1.1、寄主植物为番茄、辣椒、黄瓜等试验常用蔬菜，本实施例采用了番茄，因为番茄是多种植物病毒的寄主。1.2、供试植物养在干净的无虫笼里，无虫笼是铝合金制成的框架笼，规格为60cm×40cm×80cm，底层和正面上端是用玻璃制成，顶层、两侧及后面是用100目尼龙网制成，正面下端是100目尼龙网制成的门(是饲养烟粉虱常用的无虫笼)。1.3、将泥炭、蛭石、有机肥料和珍珠岩混合，按照质量比为10∶10∶10∶1进行混合，做为寄主植物培养的基质。1.4、在营养钵内加入步骤1.3中的基质进行播种，当植物长出3～4片真叶后备用。(2)病毒接种：2.1、侵染性克隆菌液的制备：将侵染性克隆首先在yep固体培养基(含50mg/lkan+和50mg/lrif+)上活化，随后从中挑取单菌落，并置于yep液体培养基(含50mg/lkan+和50mg/lrif+)中，在28℃200rpm条件下培养至少24h，从而获得侵染性的克隆菌液。将菌液于4000rpm在室温离心10min，然后弃上清，并用50ml悬浮液(含10mmmes(2-(n-吗啉)-乙基磺酸)、10mmmgcl2、200mm乙酰丁香酮)对菌体进行重悬浮得到侵染性克隆菌液，在室温静置2h备用。2.2、选取大约3片真叶的健康植株，用一次性医用注射器，取上述制备好的侵染性克隆菌液，对每棵植株注射大约0.5ml菌液，并以不注射菌液的植株(无毒植株)做为对照。将注射后的植物放在玻璃温室的干净无虫笼进行培养。待植株长有6～7片真叶时，选取有明显的发病症状的植株，用pcr进行检测，鉴别带毒植物和无毒植物。具体检测方法为：将检测样品与阳性对照和阴性对照进行对比，有目的条带且条带单一，与阳性对照一致的样品对应的植物为带毒植物，没有目的条带，或者与阴性对照一致的样品对应的植物为无毒植物。检测结果为：接种侵染性克隆菌液后带毒植物的比率≥80％。(3)烟粉虱接种：3.1、分别将b烟粉虱和q烟粉虱接种到带毒植物和无毒植物上，每个烟粉虱种群对应的每种植物用3个无虫笼，每个无虫笼放入4～6棵检测发病的植物或单独饲养的健康植物，分别取300头b烟粉虱和q烟粉虱放入发病及健康的的植株上，每个烟粉虱种群放入单独的笼子里，每个种群对应的3个笼子放一间人工气候室，共放入4间隔离的人工气候室。所有的烟粉虱在人工气候室内繁育，光照条件为14小时光照，10小时黑暗，14小时光照的温度为28℃，10小时黑暗的温度为25℃，光照和黑暗条件下湿度均保持在60％。得到接种有b烟粉虱的已感病植株、接种有q烟粉虱的已感病植株、接种有b烟粉虱的无毒植株、接种有q烟粉虱的无毒植株。3.2、饲养6代后，每棵植物上随机选取10头烟粉虱，用pcr检测烟粉虱带毒率和种群纯度。pcr的检测结果显示：带毒种群的带毒率为100％，同时烟粉虱种群纯度为100％。(4)烟粉虱取虫：采用小型昆虫吸虫器采集烟粉虱，小型昆虫取虫器是用直径1cm、长度为20cm的透明乳胶管及移液枪的枪头进行改造而成。具体的改造方法是：取两个1ml枪头(枪头为移液枪配套使用的枪头)，命名为第一枪头1和第二枪头2。第一枪头1的尖端剪去1cm后，与尖端相对的接口端(即枪头与移液枪接口的那一端)套入乳胶管3的一端，并在第一枪头1和乳胶管3中间用100目纱网4隔离。第二枪头2剪去尖端0.5cm，将尖端套入乳胶管3的另一端。采用小型昆虫取虫器取虫时，用嘴对准第二枪头2接口端，而第一枪头1的尖端对准昆虫，吸取所需数量的昆虫，随后用手指轻轻堵住第一枪头1尖端，将其转移到离心管中。分别考察实施例1和大田环境中烟粉虱的昆虫的发育时间，产卵量，存活率，单一带毒率、复合侵染率、烟粉虱稳定性等。烟粉虱发育时间和存活率：在人工饲养环境下及大田环境下，分别取30株同一时期播种的，大小一致的植物，在每株植物的相同位置选取一片叶子，放入一个微虫笼(是测定烟粉虱生长发育常用的微虫笼)，每个微虫笼中放入10对羽化3天内的烟粉虱成虫，待其产卵24小时后去除所有成虫，在显微镜下统计每笼中的产卵量，随后每天观察卵及若虫的发育情况，定时检查羽化的成虫数量，直到所有成虫羽化，计算烟粉虱由卵至成虫的存活率和发育时间。单头烟粉虱产卵量：在人工饲养及大田环境下，分别取30株同期播种且大小一致的植物，在每株植物的相同位置选取一片叶子，放入一个微虫笼，每个微虫笼中放入1头初羽化的烟粉虱雌虫，每隔7天将微虫笼中的烟粉虱转移到1株新的大小一致的植物叶片上，同时在显微镜下观察原叶片上烟粉虱的产卵量(大田环境下的植物观察时，将叶片取回实验室在显微镜下进行观察)，直至烟粉虱死亡，统计每头烟粉虱总的产卵数量。烟粉虱单一带毒率和复合侵染率：将人工饲养的和大田取回的烟粉虱，用pcr方法分别检测在田间发生率高的且媒介昆虫为烟粉虱的病毒，如番茄黄化曲叶病毒(tylcv)、中国番茄黄化曲叶病毒(tylccnv)、番茄褪绿病毒(tocv)等。将每个烟粉虱样品用所有病毒进行检测，以确定烟粉虱对单一病毒的带毒率和同时携带一种或几种病毒的复合侵染率。烟粉虱稳定性：包括烟粉虱种群纯度以及烟粉虱体长、雌雄比，烟粉虱纯度的测定方法参照步骤3.2；烟粉虱雌雄比测定方法是将两种条件下的烟粉虱分别在显微镜下进行观察，记录雌虫和雄虫的数量，计算雌雄比；烟粉虱体长测量方法是用显微镜上的刻度尺测量单头烟粉虱的体长，进行统计和对比；综合三个指标，得出烟粉虱的稳定性。表1：人工饲养方法与大田环境中烟粉虱质量对比表人工饲养环境大田环境烟粉虱发育时间20～30天25～35天单头烟粉虱产卵量100～200头50～150头烟粉虱存活率90％10～70％烟粉虱单一带毒率100％0～80％烟粉虱复合侵染率0％50～100％烟粉虱稳定性稳定不稳定农药等其他因素影响无有从表1的结果可知：本发明的人工饲养方法不管从发育时间、产卵量、还是烟粉虱存活率、带毒率、稳定性等方面，均明显优于大田环境的自然饲养方法。以上所述，仅是本发明的一部分实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以将一部分较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。当前第1页12