赤点石斑鱼与鞍带石斑鱼远缘杂交育种方法与流程

本发明涉及水产养殖领域。

背景技术：

赤点石斑鱼(epinephelusakaara)和鞍带石斑鱼(e.lanceolatus)都隶属于鲈形目(perciformes)，石斑鱼科(epinephelidae)，石斑鱼属。赤点石斑鱼俗称红斑，属冷水性鱼类，是亚洲重要的海水经济鱼类。鞍带石斑鱼主要产于东南亚、大洋洲海域，为暖温性海洋底层大型鱼类，是石斑鱼类中体型最大，生长速度最快的个体。石斑鱼营养丰富、肉质鲜美，是具有较高营养价值的名贵海产鱼类之一，也是华南沿海地区重要的海水养殖种类。随着石斑鱼养殖业的迅速发展，沿海地区养殖品种趋于单一化，因此迫切需要培育出具有优良养殖性状的石斑鱼新品种。

人工养殖条件下，赤点石斑鱼产卵时间为每年4月至6月，产卵时间集中，周期短；鞍带石斑鱼的发育时间为每年6月10月；因此，两者由于地理以及发育时间不同，难以有效进行杂交。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种赤点石斑鱼雌鱼与鞍带石斑鱼雄鱼杂交育种方法，本发明是基于工厂化循环水培育温度的可控性，通过将亲本进行不同水温的培育，解决两个不同品种间性腺发育不同步以及生殖隔离问题，同时通过远缘杂交，获得一种生长速度快和耐低温的优良杂交新品种。

本发明包括以下步骤：

一种赤点石斑鱼雌鱼与鞍带石斑鱼雄鱼杂交育种方法，它包括控温前亲本选择、亲本培育、亲本营养强化、亲本人工催产、人工授精和孵化。

所述的控温前亲本选择：

a.赤点石斑鱼雌性亲本：选择3～5龄、体重0.5～1kg、体型正常、活力强、无携带神经坏死病毒的赤点石斑鱼；b.鞍带石斑鱼雄性亲本：选择6龄以上、体型正常、活力强、无携带神经坏死病毒的鞍带石斑鱼。

所述的亲本培育：

赤点石斑鱼与鞍带石斑鱼分别在不同亲鱼培育池中养殖。

a.赤点石斑鱼：赤点石斑鱼雌鱼在控温前为工厂化流水养殖，培育温度与自然海水温度相同(15-31℃)，随着冬季的结束，每年的2月份开始，将赤点石斑鱼亲鱼移至循环水中养殖，通过人工控温的方法将赤点石斑雌性亲本培育水温控制在19-20℃，控温时间为每年的2月份至9月份。

b.鞍带石斑鱼：鞍带石斑鱼冬季在循环水中养殖(水温22～23℃)，每年的1月份开始鞍带石斑雄性亲本培育水温每3天升高1℃，逐步由23℃升高至30℃，之后保持在29～30℃，控温时间为1月份至7月份，当自然海水温度达到29℃时，可使用工厂化流水养殖方式培育鞍带石斑鱼雄鱼。

亲本培育期间保证海水的盐度27～33，ph7.8～8.2，溶解氧≥6mg/l，氨

氮＜0.1mg/l。

所述的亲本营养强化：

从控温开始，对赤点石斑鱼亲鱼和鞍带石斑鱼亲鱼进行营养强化，将营养强化剂黏附在冰鲜的蓝圆鲹或鲐鱼上，营养强化剂包括增加裂壶藻和维生素e，增加投饵量至鱼体重的2～3％，定时投喂饵料，每2天投喂一次。

所述的亲本人工催产：

赤点石斑鱼：亲鱼培育至4月中旬就可开始挑选个体健康，性腺发育至ⅳ期的雌鱼进行催产，注射催产激素，所用催产激素种类和剂量分别为：绒毛膜促性腺激素hcg(400～700iu/kg鱼体质量)和促黄体激素释放激素类似物lrh-a3(3～7μg/kg鱼体质量)。第一批赤点石斑鱼催产开始，每隔1周就要对赤点石斑鱼雌鱼进行挑选，选择腹部明显膨胀的雌鱼进行催产。

鞍带石斑鱼：亲鱼培育至4月中旬开始挑选挤压腹部后可排出精液的鞍带石斑鱼雄鱼进行催产，所用催产激素种类和剂量分别为：绒毛膜促性腺激素hcg(200iu/kg鱼体质量)和促黄体激素释放激素类似物lrh-a3(2～3μg/kg鱼体质量)。

所述的人工授精和孵化：

赤点石斑鱼雌鱼催产激素最佳效应时间为32-38h，挑选腹部生殖孔微红的赤点石斑鱼，将成熟的卵子挤到容器中。再轻压鞍带石斑鱼雄鱼腹部，挤出精子，在显微镜下检查精子质量，确保用于受精的精子活力大于90％。将精子和卵子迅速混合(精卵比为1ml:1kg)，加入新鲜的海水搅拌均匀。静置10min，收集上浮卵至孵化桶中孵化。受精卵孵化方式为微充气、流水孵化，孵化温度为24～28℃，盐度27～33，ph7.8～8.2，溶解氧≥6mg/l，氨氮＜0.1mg/l，受精卵孵化至原肠期时，可收集受精卵移至育苗池中。。

本发明利用工厂化循环水的可控性，延长赤点石斑鱼雌鱼的产卵时间，通过挑选性腺发育良好的赤点石斑鱼雌鱼，可分多批次人工催产。同时将赤点石斑鱼雌性亲本与鞍带石斑鱼雄性亲本进行杂交，获得生长速度快和和耐低温的优良杂交新品种。

本发明的石斑鱼亲鱼工厂化循环水培育以及远缘杂交育种方法有如下优点：

1、华南沿海地区赤点石斑鱼的自然繁殖期为4～6月份，利于工厂化循环水控温方法，可将赤点石斑鱼雌鱼的繁殖期延长至4-9月份，增加了3个月的时间。通过人工催产使得赤点石斑鱼雌鱼的产卵期变长，产卵可控批次增加。

2、通过控温使得赤点石斑鱼的繁殖季节与鞍带石斑鱼的繁殖季节有较长的重叠期，人工杂交变得更加的容易。

3、延长赤点石斑鱼雌鱼养殖时间，同时配合营养强化，增加赤点石斑鱼雌鱼的营养积累，使得雌鱼性腺发育更好，卵质更加优良，有利于提高杂交的受精率和杂交子代的成活率。

4、赤点石斑鱼为冷水性鱼类，分布范围广；鞍带石斑鱼为热带亚热带暖水性鱼类，具有生长快速的特点，将两种石斑鱼进行杂交，可获得具有生长速度较母本快、温度适应范围超过双亲的优良后代。

5、亲鱼在培育过程中进行无神经坏死病毒筛选，避免了杂交子代垂直传播的可能。

附图说明

图1为本发明人工控温和自然海水温度下赤点石斑鱼雌性个体性腺发育he染色。

a图为人工控温下(19-20℃)，赤点石斑鱼雌鱼卵巢仍以ⅲ期和ⅳ期为主。

b图为自然流水养殖条件下(28-30℃)，卵巢发育以ⅱ期为主。

样品均为9月份福建厦门小嶝水产科技有限公司养殖池培育的赤点石斑鱼亲鱼。

图2为本发明杂交子代及双亲外形图。

具体实施方式

一种赤点石斑鱼雌鱼与鞍带石斑鱼雄鱼杂交育种方法，它包括控温前亲本选择、亲本培育、亲本营养强化、亲本人工催产、人工授精和孵化。

1.控温前亲本选择

本实验于2015年1月-2月进行，赤点石斑鱼雌性选择3-5龄、体重0.5-1kg、体型正常、活力强、无携带神经坏死病毒的赤点石斑鱼。鞍带石斑鱼雄性选择6龄以上、体型正常、活力强、无携带神经坏死病毒的鞍带石斑鱼。病毒检测是通过尾动脉取血，利于荧光定量pcr对神经坏死病毒进行检测，挑选检测结果为阴性的石斑鱼作为亲鱼，单独养殖。

2.亲本培育

赤点石斑鱼雌鱼与鞍带石斑鱼雄鱼分别在不同亲鱼培育池中养殖。

a.赤点石斑鱼：2015年2月开始，将赤点石斑鱼亲鱼移至循环水中养殖，通过人工控温的方法将赤点石斑雌性亲本培育水温控制在19-20℃，控温时间为2月份至9月份。赤点石斑鱼循环水培育池为两口面积(15m²)的正方形水泥池，四角取圆，池底15°的斜坡，在池子中央为排水口，池深1.2m，生物滤池为长方形(2m×6m)面积12m²，池深1.2m，配有蛋白分离器和紫外杀菌。

b.鞍带石斑鱼：2015年1月开始，将鞍带石斑雄性亲本培育水温每3天升高1℃，逐步由23℃升高至30℃，之后保持在29～30℃，控温时间为1月份至7月份，当自然海水温度达到29℃时，可使用工厂化流水养殖方式培育鞍带石斑鱼亲鱼。鞍带石斑雄性亲本循环水培育池为两口面积各为30m²的正方形水泥池，池子四角取圆，池底15°的斜坡，在池子中央为排水口，池深2.5m，生物滤池为长方形(3m×5m)面积15m²，池深2.5m，配有蛋白分离器和紫外杀菌。

亲本培育期间保证海水的盐度27～33，ph7.8～8.2，溶解氧≥6mg/l，氨氮＜0.1mg/l。所述的海水均经过沙滤、紫外消毒之后进入亲鱼培育池中。

3.亲本营养强化

2015年2月开始，对赤点石斑鱼亲鱼和鞍带石斑鱼亲鱼进行营养强化，将营养强化剂黏附在冰鲜的蓝圆鲹或鲐鱼上，营养强化剂包括增加裂壶藻和维生素e，增加投饵量至鱼体重的2～3％，定时投喂饵料，每2天投喂一次。

4.亲本人工催产

赤点石斑鱼：亲鱼培育至2015年4月中旬就可开始挑选个体健康，性腺发育至ⅳ期的雌鱼进行催产，注射催产激素，所用催产激素种类和剂量分别为：绒毛膜促性腺激素hcg(400～700iu/kg鱼体质量)和促黄体激素释放激素类似物lrh-a3(3～7μg/kg鱼体质量)。第一批赤点石斑鱼催产开始，每隔1周就要对赤点石斑鱼雌鱼进行挑选，选择腹部明显膨胀的雌鱼进行催产，直至2015年9月结束。

鞍带石斑鱼：亲鱼培育至2015年4月中旬开始挑选挤压腹部后可排出精液的鞍带石斑鱼雄鱼进行催产，所用催产激素种类和剂量分别为：绒毛膜促性腺激素hcg(200iu/kg鱼体质量)和促黄体激素释放激素类似物lrh-a3(2～3μg/kg鱼体质量)。

5.人工授精和孵化

赤点石斑鱼雌鱼催产激素最佳效应时间为32～38h，挑选腹部生殖孔微红的赤点石斑鱼，将成熟的卵子挤到容器中。再轻压鞍带石斑鱼雄鱼腹部，挤出精子，在显微镜下检查精子质量，确保用于受精的精子活力大于90％。将精子和卵子迅速混合(精卵比为1ml:1kg)，加入新鲜的海水搅拌均匀。静置10min，收集上浮的卵至孵化桶中孵化。受精卵孵化方式为微充气、流水孵化，孵化温度为24～28℃，盐度27～33，ph7.8～8.2，溶解氧≥6mg/l，氨氮＜0.1mg/l，受精卵孵化至原肠期时，可收集受精卵移至育苗池中。

本实施例中赤点石斑鱼产卵期可持续到9月份，这种延长赤点石斑鱼雌鱼性腺发育的方法在2016和2017年都得到了验证。同时获得的杂交受精卵受精率可达95％，孵化率达85％；2015年培育出杂交幼鱼超过1万尾，2016年培育出杂交幼鱼超过6万尾，2017年培育出杂交幼鱼超过15万尾。

杂交子代生长速度比赤点石斑鱼(母本)快150％；杂交子代的最低耐受温度为7℃，比父本鞍带石斑鱼(最低耐受温度为16℃)明显提高。