本发明属于园艺植物组培技术领域，特别涉及一种利用红掌叶脉诱导分化不定芽的组培方法，该方法适用于红掌组培过程中不定芽的诱导分化。
技术背景
红掌(anthuriumandraeanum)，又称为安祖花或花烛，是一种经济效益较高的热带花卉植物。其花形奇特优美、花色鲜艳、花期特长，是各种场所的花卉装饰佳品。随着人民生活水平的不断提高，红掌在居家生活、礼仪交往、活动庆典等领域消费量不断增加，从而市场对红掌的需求量也在不断扩大。
利用组培技术繁育的植株后代保持了母本的优良性状，同时可以大量、快速地进行后代高效繁育，并且能够周年进行种苗繁育生产。
不定芽发生型是植物组培器官形成方式的重要类型之一，亦是红掌组培快繁器官形成的主要方式。通过此种器官形成方式，外植体首先经过脱分化形成愈伤组织，然后愈伤组织经过再分化形成不定芽。因此，愈伤组织诱导是组培过程中的首要环节，只有减少组培过程中外植体褐化现象的发生和提高愈伤组织诱导率，获得更多的愈伤组织，才能保证大量地形成不定芽。
目前，在商业化红掌种苗繁育生产中主要采用组培技术进行，国内外亦有大量的红掌组培技术领域研究，但都存在着外植体褐化现象严重、愈伤组织诱导率低的问题，也尚未检索到利用红掌叶脉作外植体的组培方法报道。此外，在商业化红掌组培生产中，若采用叶片作外植体，通常都会将叶脉除弃之，也造成了资源的浪费。
技术实现要素：
本发明目的是在于提供了一种利用红掌叶脉诱导分化不定芽的组培方法，该方法解决了红掌愈伤组织诱导培养过程中外植体容易褐化和愈伤组织诱导率低的问题，通过利用红掌叶脉作外植体，培养过程中外植体褐化率大大降低，褐化率减少了23.5～41.4％，愈伤组织诱导率大大增加，诱导率高达97.6％，从而进一步增加了后代增殖数量，方法易行，操作简便，降低了外植体褐化率，提高了愈伤组织诱导率，改善了红掌组培技术。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种利用红掌叶脉诱导分化不定芽的组培方法，其步骤是：
(1)母本材料选取：选取生长健壮、株型优美红掌植株作为母本材料。
(2)外植体处理：以母本幼嫩叶片的叶脉作组培外植体。将叶片从母本剪下后，用自来水冲洗20～30min，期间用手轻轻搓揉叶片表面。之后，在超净工作台上依次使用70～75％(体积比)酒精浸泡30～60s，灭菌水冲洗2～3遍，10～12％(体积比)双氧水溶液浸泡10～20min，灭菌水冲洗3～5遍。将叶脉沿其边缘剪切，并切割成1cm长小段待用。
(3)启动培养：将切割好的叶脉水平接入1号培养基，放入培养室培养。
(4)愈伤组织分化培养：启动培养30～60d后，叶脉边缘即形成愈伤组织，转接入2号培养基。
(5)不定芽诱导培养：愈伤组织分化培养30～60d后，愈伤组织增大，表面可见点状突起，转接入3号培养基。不定芽诱导培养30～60d后，即可见愈伤组织上诱导分化出1～2cm高不定芽。
所述的1号培养基为1/2ms+tdz0.01～0.05mg/l+6-ba0.5～2.0mg/l+naa0.1～1.0mg/l，1号培养基主要作用为外植体启动培养、诱导愈伤组织形成；
所述的2号培养基为1/2ms+6-ba0.5～2.0mg/l+naa0.1～1.0mg/l+2,4-d0.01～0.5mg/l，2号培养基主要作用为促进愈伤组织进一步脱分化；
所述的3号培养基为ms+6-ba0.2～1.5mg/l+naa0.01～0.8mg/l，3号培养基主要作用为促进不定芽诱导分化；
所述的1号、2号、3号培养基ph均调整为5.8～6.0。
所述的启动培养阶段和愈伤组织分化培养阶段，培养室的培养条件为：温度23－27℃，黑暗培养。
所述的不定芽诱导培养阶段，培养室的培养条件为温度23－27℃、光照强度1500～2000lx、光照周期12～14h/d。
进一步的，所述的叶脉直径大于1.5mm，若叶脉直径太小不利于接种操作，故选用直径大于1.5mm的叶脉。
如表1所示，通过上述方案，解决了红掌愈伤组织诱导培养过程中外植体容易褐化和愈伤组织诱导率低的问题。通过利用红掌叶脉作外植体，培养过程中外植体褐化率减少了23.5～41.4％，愈伤组织诱导率高达97.6％，从而进一步增加了后代增殖数量。该发明与现有技术主要区别在于，本发明提供了一种利用红掌叶脉作外植体诱导分化不定芽的组培方法，而现有技术报道尚未检索到利用红掌叶脉作外植体的案例。
表1不同外植体组培效果比较
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：
(1)相较于其它外植体，红掌叶脉作外植体培养过程中不易失水，外植体发生褐化现象的风险降低。
(2)叶脉作外植体，切割后其边缘切口愈伤面积大，与培养基接触充分，愈伤组织诱导率大幅提高。
(3)外植体叶脉切割成小段后，体积较小，接种操作方便快捷，减少了接种操作时间，降低了接种操作发生污染的风险。
(4)常规红掌组培方法中，若选用叶片作外植体，通常都会将叶脉切除弃之。本发明选用叶脉作外植体，可作为常规组培的一种补充形式，充分利用了叶片组织。
附图说明
图1为一种利用红掌叶脉诱导分化不定芽的组培方法所形成的不定芽，
其中，1a为直径大于1.5mm的叶脉；1b为形成愈伤组织的外植体叶脉边缘；1c为愈伤组织上的点状突起，1d为愈伤组织上诱导分化出的不定芽。
图2为一种利用红掌叶脉诱导分化不定芽的组培方法所形成的不定芽，
其中，1a为直径大于1.5mm的叶脉；1b为形成愈伤组织的外植体叶脉边缘；1c为愈伤组织上的点状突起，1d为愈伤组织上诱导分化出的不定芽。
具体实施方式
下面说明本发明的具体实施方式。
实施例1：
一种利用红掌叶脉诱导分化不定芽的组培方法，其步骤为：
(1)母本材料选取：从武汉维尔福生物科技股份有限公司基地选取生长健壮、株型优美的盆栽红掌品种“17-04”作母本材料。
(2)外植体处理：选择幼嫩新叶从母本植株剪下后，用自来水冲洗20min，期间用手轻轻搓揉叶片表面。在超净工作台上依次使用75％(体积比)酒精溶液浸泡60s，无菌水冲洗2遍，10％(体积比)双氧水溶液浸泡15min，无菌水冲洗5遍。将叶脉沿其边缘从叶片上剪切下，并将直径大于1.5mm的叶脉切割成1cm长小段待用(图1a)。
(3)启动培养：将切割好的叶脉水平接入1号培养基1/2ms+tdz0.01mg/l+6-ba1.8mg/l+naa0.8mg/l，培养基ph调节为5.95，放入培养室培养45d。培养室培养环境条件控制为温度25±2℃、黑暗培养。
(4)愈伤组织分化培养：启动培养结束后，仅有1.3％外植体发生褐化现象，其余外植体叶脉边缘形成愈伤组织(图1b)，愈伤组织诱导率96.6％，将愈伤组织转接入2号培养基1/2ms+6-ba1.5mg/l+naa0.2mg/l+2,4-d0.2mg/l。培养基ph调节为5.95，放入培养室培养培养45d。培养室培养环境条件控制为温度25±2℃、黑暗培养。
(5)不定芽诱导培养：愈伤组织分化培养45d后，愈伤组织上可见点状突起(图1c)，转接入3号培养基ms+6-ba1.2mg/l+naa0.05mg/l，培养基ph调整为5.95，放入培养室培养。培养室培养环境条件为温度25±2℃、光照强度1700-1900lx、光照周期13h/d。培养40d后，即可见愈伤组织上诱导分化出不定芽(图1d)，不定芽诱导率97.8％。
实施例2：
一种利用红掌叶脉诱导分化不定芽的组培方法，其步骤为：
(1)母本材料选取：从武汉维尔福生物科技股份有限公司基地选取无病虫危害、株型优美的红掌“17-07”作母本材料。
(2)外植体处理：选择幼嫩新叶从母本剪下后，使用自来水冲洗30min，期间用手轻轻搓揉叶片表面。在超净工作台上依次使用70％(体积比)酒精溶液浸泡50s，无菌水冲洗3遍，12％(体积比)双氧水溶液浸泡13min，无菌水冲洗4遍。将叶脉沿其边缘剪切下，并将直径大于1.5mm的叶脉切割成1cm长小段待用(图2a)。
(3)启动培养：将切割好的叶脉水平接入1号培养基1/2ms+tdz0.04mg/l+6-ba0.5mg/l+naa0.2mg/l，培养基ph调整为5.85，放入培养室培养60d。培养室培养环境条件为温度25±2℃、黑暗培养。
(4)愈伤组织分化培养：启动培养结束后，仅有2.0％外植体发生褐化现象，其余外植体叶脉边缘形成愈伤组织(图2b)，愈伤组织诱导诱导率97.3％，转接入2号培养基1/2ms+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l+2,4-d0.1mg/l，培养基ph调整为5.85，放入培养室培养培养30d。培养室培养环境条件为温度25±2℃、黑暗培养。
(5)不定芽诱导培养：愈伤组织分化培养结束后，愈伤组织上可见点状突起(图2c)，转接入3号培养基ms+6-ba1.0mg/l+naa0.04mg/l，培养基ph调整为5.85，放入培养室培养。培养室培养环境条件为温度25±2℃、光照强度1800～2000lx、光照周期12h/d。不定芽诱导培养60d后，即可见愈伤组织上诱导分化出不定芽(图2d)，不定芽诱导率98.2％。
实施例3：
一种利用红掌叶脉诱导分化不定芽的组培方法，其步骤为：
(1)母本材料选取：从武汉维尔福生物科技股份有限公司基地选取生长健壮、株型优美的盆栽红掌品种“17-04”或“17-07”作母本材料。
(2)外植体处理：选择幼嫩新叶从母本植株剪下后，用自来水冲洗20或25或30min，期间用手轻轻搓揉叶片表面。在超净工作台上依次使用70或75％(体积比)酒精溶液浸泡30或40或50或60s，无菌水冲洗2或3遍，10或12％(体积比)双氧水溶液浸泡10或15或20min，无菌水冲洗3或4或5遍。将叶脉沿其边缘从叶片上剪切下，并将直径大于1.5mm的叶脉切割成1cm长小段待用(图1a)。
(3)启动培养：将切割好的叶脉水平接入1号培养基1/2ms+tdz0.01或0.02或0.04或0.05mg/l+6-ba0.5或1.0或1.5或1.8或2.0mg/l+naa0.1或0.2或0.4或0.8或1.0mg/l，培养基ph调节为5.8或5.9或5.95或6.0，放入培养室培养30或45或60d。培养室培养环境条件控制为温度23或24或25或26或27℃、黑暗培养。
(4)愈伤组织分化培养：启动培养结束后，仅有0.9％～1.4％外植体发生褐化现象，其余外植体叶脉边缘形成愈伤组织，愈伤组织诱导率95.9％～98.1％，将愈伤组织转接入2号培养基1/2ms+6-ba0.5或1.0或1.5或2.0mg/l+naa0.1或0.2或0.4或0.8或1.0mg/l+2,4-d0.01或0.05或0.1或0.2或0.4或0.5mg/l。培养基ph调节为5.8或5.9或5.95或6.0，放入培养室培养培养30或45或60d。培养室培养环境条件控制为温度23或24或25或26或27℃、黑暗培养。
(5)不定芽诱导培养：愈伤组织分化培养30或45或60d后，愈伤组织上可见点状突起，转接入3号培养基ms+6-ba0.2或0.5或1.0或1.2或1.5mg/l+naa0.01或0.05或0.1或0.2或0.4或0.8mg/l，培养基ph调整为5.8或5.9或5.95或6.0，放入培养室培养。培养室培养环境条件为温度23或24或25或26或27℃、光照强度1700或1800或1900lx、光照周期12或13或14h/d。培养30或40或50或60d后，即可见愈伤组织上诱导分化出不定芽，不定芽诱导率97.4％～98.2％。