用于盐胁迫处理的胡杨种子的60Co-γ射线辐射诱变方法与流程

本发明涉及辐射育种
技术领域：
，具体涉及用于盐胁迫处理的胡杨种子的60co-γ射线辐射诱变方法。
背景技术：
：辐射诱变(物理诱变)育种是利用种子辐射技术进行育种，是目前育种效率较高的技术，主要是用一定剂量的辐射处理材料，诱发材料基因的突变体或染色体的发生畸变，经过筛选、测定、选择，从而短时间内获得突变体，从中选育出新品种的过程。辐射诱变是利用一定剂量的射线，照射植物植株、花粉、种子或器官，诱导发生变异，使之产生有利突变的过程，通过人工筛选和培育而育成新品种。辐射诱变的前提是辐射处理，其效果受辐射剂量、处理方法、处理材料以及地域等因素的影响。由于人们经常忽视对辐射条件的控制，严重时甚至会造成辐照无效或大面积致死等现象。近年来，辐射诱变研究中，最常用的辐射诱变源包括：γ射线、x射线、紫外线、中子、激光、电子束、离子束等。通常在植物育种中被广泛应用γ射线的辐射源为60co，在辐射育种方面具有辐射条件容易控制、效果显著。除此以外，γ射线是中性射线、穿透力较强、辐射剂量均匀、一次可以处理大量的材料，是辐射育种的首选之一。目前，辐射诱变育种因具有突变率高、突变谱宽、在保持品种后代性状较稳定快、育种周期短、增强抗逆性等优点，已成为选育新种质资源的一项现代化育种技术，而且国内外在辐射诱变领域不断尝试新的技术、方法等，并取得了很大的成就。胡杨(populuseuphratica)为杨柳科(salicaceae)杨属(populusl.)胡杨亚属植物，是一种罕见的、古老的、濒临灭绝的物种，生长于极荒漠河岸和在干旱荒漠区的唯一优势成林树种。具有很强的适应性、耐盐碱、水湿、抗干旱风沙等特点,胡杨林主要分布于新疆塔里木盆地和准噶尔盆地，其面积占全国胡杨林面积的91.1％，在新疆分布较为集中，占我国胡杨林总面积的90％以上。胡杨作为绿洲河岸林中的高达落叶乔木物种，维护荒漠河岸林生态平衡的关键种树，对于改善区域生态环境，遏制沙漠化，防风固沙，调控干旱荒漠地区脆弱的生态系统与保护生物多样性等方面具有重要意义。近年来，由于大规模的水土开发(开垦)，河流断流以及人类滥砍、滥伐等人为和自然因素的影响，导致胡杨林面临日益衰败和濒危的处境，由于胡杨对于干旱荒漠区的重要性及生境恶化对胡杨种质资源造成威胁。因此，对胡杨种质资源保存势在必行。最近，人们对胡杨的繁殖进行了很多研究，但是对胡杨种子辐射育种工作甚少。诱变育种已经成为主要的育种手段之一，为植物育种提供了新的思路，展现出了广阔的前景。辐射诱变育种在我国其他植物育种中有所应用，但是在胡杨种子等植物中应用极少。而且很少学者通过nacl胁迫与60co-γ射线辐射处理对胡杨种子进行研究。技术实现要素：本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种发芽率高、耐盐性强、节约时间成本的用于盐胁迫处理的胡杨种子的60co-γ射线辐射诱变方法。本发明以胡杨种子为材料采用不同剂量60co-γ射线辐射进行处理，并在不同浓度的nacl条件下进行种子萌发试验，探索60co-γ射线辐射对nacl胁迫下胡杨种子萌发特性的影响，以探寻在nacl胁迫下能够显著的促进胡杨种子萌发的60co-γ射线辐射剂量，从而辐射诱变育种为胡杨种质资源创新和品种选育提供新的方法和途径。为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：用于盐胁迫处理的胡杨种子的60co-γ射线辐射诱变方法，包括以下步骤：1)确定培养条件：采用氯化钠溶液进行胡杨种子盐胁迫处理，氯化钠溶液浓度为0-300mmol·l-1，胡杨种子的盐胁迫培养条件为培养温度23-27℃，光照强度为3000lx，光暗周期为16/8h；2)辐射处理：将胡杨种子以60co-γ射线进行辐射处理，60co-γ射线辐射剂量为0-200gy，辐射时间为0-16min；辐射后的种子用0.1％的hgcl2进行消毒5～7min，用蒸馏水冲洗3次，每次1min，再按照步骤1)的氯化钠溶液浓度，取氯化钠溶液5ml倒入铺两层滤纸的培养皿，将20粒种子接种于培养皿中，重复4次，用封口膜封好置于恒温光照培养箱内，采用步骤1)给出的培养条件进行培养；培养过程中，每天充一次蒸馏水以保证各盐浓度在种子萌发过程中保持恒定，每隔24h统计种子的萌发情况，接种后第二天开始计数，共统计7d。进一步的，上述的用于盐胁迫处理的胡杨种子的60co-γ射线辐射诱变方法，所述步骤1)中的盐胁迫处理中，氯化钠溶液浓度为181mmol·l-1，培养温度为25-27℃。进一步的，上述的用于盐胁迫处理的胡杨种子的60co-γ射线辐射诱变方法，所述步骤2)中，所述步骤2)中，60co-γ射线辐射剂量为150gy，辐射时间为0-16min。本发明的有益效果为：本发明提供的用于盐胁迫处理的胡杨种子的60co-γ射线辐射诱变方法，经不同剂量60co-γ射线辐射诱变对nacl浓度胁迫下进行种子萌发试验，通过方差分析和多重比较，对发芽率与各发芽指标值进行分析。在不同60co-γ射线辐射诱变对nacl浓度胁迫下，150gy剂量辐射诱变的发芽率、发芽势及相对发芽率显著高于其它辐射处理，相对盐害率降低。150gy剂量辐射诱变对胡杨种子的萌发有一定的促进作用，181mmol·l-1浓度为60co-γ射线辐射对nacl胁迫下胡杨种子萌发的耐盐临界浓度值，即对nacl胁迫表现出了较好的耐受性。通过建立胡杨种子60co-γ射线辐射诱变育种技术，为其辐射诱变育种最佳辐射剂量的选择和确定提供依据，揭示了胡杨种子对辐射诱变和nacl胁迫的萌发机制，提供了种子耐盐性的适宜辐射剂量，进一步通过辐射诱变育种为胡杨种植资源创新和品种选育提供新的方法和途径。附图说明图1显示为60co-γ射线辐射对胡杨种子的平均发芽率、发芽势及发芽指数间的差异。图2显示为60co-γ射线辐射对胡杨种子萌发阶段耐盐性的影响。图3显示为胡杨种子各项发芽指标均值在60co-γ射线辐射对nacl胁迫间的差异。具体实施方式实施例1：本发明提供的胡杨种子60co-γ射线辐射诱变方法，具体实施方式是：选择胡杨种子，包括步骤：a、培养条件：种子盐胁迫处理：盐分设置为nacl溶液，浓度均设置为0(ck)、25、50、150、250、300mmol/l，共6个盐分胁迫处理，其中1个对照处理。以上培养条件为温度25-27℃、光照强度为3000lx；光暗周期为16/8h。b、辐射处理：胡杨种子为试验材料，分组用60co-γ射线进行辐射处理；60co-γ射线辐射剂量(0、50、100、150、200gy)，辐射后的种子用0.1％的hgcl2进行消毒5～7min，用蒸馏水冲洗3次每次1min。试验共设0(ck，蒸馏水)、25、50、150、250和300mmol·l-1nacl浓度梯度，将其取5ml处理溶液倒入铺两层滤纸的培养皿，每20粒种子接种于培养皿中，共6个处理，每组处理重复4次，用封口膜封好置于恒温光照培养箱内，温度为25-27℃、光照强度为3000lx、光/暗周期为16/8h的条件下进行培养。每天补充一次蒸馏水以保证各盐浓度在种子萌发过程中保持恒定。每隔24h统计种子的萌发情况。(接种后第二天开始计数)统计7d。确定辐射诱变的种子在盐胁迫下发芽的耐盐临界浓度。c、统计种子的发芽指标值、相对盐害率及累积发芽率：观察统计每个剂量处理发芽的时间及发芽种子数：计算发芽指标值相对盐害率及幼苗存活率。发芽指标测定：发芽率(％)＝(n/n)×100％；式中n为7d正常发芽的种子数，n为供试种子总数；发芽势(％)＝规定天数(3d)的发芽种子数/供试验种子数×100％；发芽指数＝∑(gt/dt)，(式中，gt为t日的发芽数，dt为相应的发芽日数)；相对发芽率(％)＝(盐处理发芽率/对照发芽率)×100％；相对盐害率(％)＝(对照发芽率－盐处理发芽率)/对照发芽率×100％；累积发芽率：g＝n/s×100％；n为发芽种子的总数，s为供试验的种子数。d、辐射处理对不同浓度nacl胁迫下发芽种子的辐射效应：将辐射处理种子在不同辐射剂量与不同nacl浓度梯度下进行种子萌发试验，7天后统计种子发芽指标、相对盐害率及幼苗成活率，分析不同剂量辐射组与不同nacl浓度之间的差异。e、数据处理与统计方法：用excel2010进行数据处理和图表绘制，用spss18.0统计软件进行双因素方差分析和用lsd法进行差异显著性比较。所述步骤a和b中，辐射剂量及不同nacl浓度梯度见下表1所示。表1实验组辐射剂量(gy)时间(min)nacl浓度梯度(mmol·l-1)1000、25、50、150、250、30025040、25、50、150、250、300310080、25、50、150、250、3004150120、25、50、150、250、3005200160、25、50、150、250、300本发明的胡杨种子60co-γ射线辐射诱变方法，利用60co-γ进行诱变处理，在水培培养条件下观察不同辐射剂量与nacl浓度梯度对胡杨种子的诱变效应。确定最佳辐射剂量。建立胡杨种子60co-γ射线辐射诱变的耐盐育种技术。为其辐射诱变育种最佳辐射剂量和nacl浓度的选择确定提供依据，并为当前新疆荒漠化、盐碱化和次生盐渍化土地的有效利用和开发，对胡杨林植被的天然更新，通过种子繁殖营造人工胡杨林，恢复受损生态环境等方面具有极其重要的现实意义。探索60co-γ射线辐射对盐胁迫下胡杨种子萌发特性的影响，以探寻在盐胁迫下能够显著的促进胡杨种子萌发的60co-γ射线辐射剂量，从而辐射诱变育种为胡杨种质资源创新和品种选育提供新的方法和途径。本发明选用胡杨种子为研究材料，对胡杨种子进行辐射诱变试验。60co-γ射线辐射育种具有突变率高、变异的范围大等优点，因此，使用60co-γ射线对胡杨种子进行辐射诱变，有利于具有发芽率高、耐盐性和育种效率较高的胡杨新品种。2015年9月甘家湖国家级自然保护区采集的胡杨蒴果作为辐射诱变材料，将蒴果经登记编号，蒴果自然干燥，种子绒毛随其自然开裂散出，得到较纯净的种子，在4℃条件下储存备用的种子2016年作为实验材料，因此，种子的发芽率低，而种子又很小，对辐射具有较高的敏感性。选择胡杨种子作为辐射育种研究对象，便于不同nacl浓度的培养皿培养条件下，种子具有较高的发芽率，为通过辐射育种高发芽率条件下成功筛选获得耐盐性幼苗奠定基础。具体实施过程：1、材料：胡杨(populuseuphratica)种子取自于北疆优选天然胡杨林甘家湖国家级自然保护区。2、方法：培养条件：种子盐胁迫处理：盐分设置为nacl溶液，浓度均设置为0(ck)、25、50、150、250、300mmol·l-1，共6个盐分胁迫处理，其中1个对照处理。以上培养条件为温度25-27℃、光照强度为3000lx；光暗周期为16/8h。(2)辐射处理胡杨种子为试验材料，分组用60co-γ射线进行辐射处理；60co-γ射线辐射剂量(0、50、100、150、200gy)，辐射后的种子用0.1％的hgcl2进行消毒5～7min，用蒸馏水冲洗3次每次1min。试验共设0(ck，蒸馏水)、25、50、150、250和300mmol·l-1nacl浓度梯度，将其取5ml处理溶液倒入铺两层滤纸的培养皿，每20粒种子接种于培养皿中，共6个处理，每组处理重复4次，用封口膜封好置于恒温光照培养箱内，温度为25-27℃、光照强度为3000lx、光/暗周期为16/8h的条件下进行培养。每天补充一次蒸馏水以保证各盐浓度在种子萌发过程中保持恒定。每隔24h统计种子的萌发情况。(接种后第二天开始计数)统计7d。确定辐射诱变的种子在盐胁迫下发芽的耐盐临界浓度。(3)统计种子的发芽指标值、相对盐害率及累积发芽率：观察统计每个剂量处理发芽的时间及发芽种子数：计算发芽指标值相对盐害率及幼苗存活率。发芽指标测定：发芽率(％)＝(n/n)×100％；式中n为7d正常发芽的种子数，n为供试种子总数；发芽势(％)＝规定天数(3d)的发芽种子数/供试验种子数×100％；发芽指数＝∑(gt/dt)，(式中，gt为t日的发芽数，dt为相应的发芽日数)；相对发芽率(％)＝(盐处理发芽率/对照发芽率)×100％；相对盐害率(％)＝(对照发芽率－盐处理发芽率)/对照发芽率×100％；累积发芽率：g＝n/s×100％；n为发芽种子的总数，s为供试验的种子数。(4)辐射处理对不同浓度nacl胁迫下发芽种子的辐射效应将辐射处理种子在不同辐射剂量与不同nacl浓度梯度下进行种子萌发试验，7天后统计种子发芽指标、相对盐害率及幼苗成活率，分析不同剂量辐射组与不同nacl浓度之间的差异。(5)数据处理与统计方法用excel2010进行数据处理和图表绘制，用spss18.0统计软件进行双因素方差分析和用lsd法进行差异显著性比较。实施本发明的最终结果：不同剂量的辐照与盐浓度处理对胡杨种子的发芽产生不同的影响。从图1可知，发芽率、发芽势及发芽指数在不同剂量辐射处理间(f＝3.28，p<0.05；f＝7.66，p<0.01；f＝19.965，p<0.01)和nacl浓度间(f＝20.061，p<0.01；f＝13.159，p<0.01；f＝16.002，p<0.01)的差异性均达到极显著水平，表明不同辐射剂量处理下的种子在不同盐浓度的发芽率、发芽势及发芽指数存在较大差异。胡杨种子在60co-γ射线辐射对平均发芽率、发芽势及发芽指数间的多种比较结果显示(图3)，在不同剂量辐射处理中，150gy处理下的种子发芽率(73.75±1.25％，均值±se)、发芽指数(28.36±1.21)及发芽势(66.25±2.39％)高于对照和其它处理组，与对照组和50gy辐射处理相比差异显著(p<0.05)，但与100和200gy辐射处理相比差异不显著(p>0.05)。50gy处理下种子的平均发芽率为最低(43.75±8.5)，与对照组和200gy辐射剂量的差异无显著(p>0.05)。图2可知，100和150gy的辐射处理均可显著提高种子的发芽率(p＜0.05)，与无辐射处理相比分别提高了20％和27.50％；200gy的辐射处理提高了17.50％，但差异不显著(p>0.05)；50gy辐射处理则抑制了种子的萌发，使发芽率降低了2.5％(p>0.05)(图2)。在25、50和150mmol·l-1nacl胁迫下，50gy的辐射显著地抑制胡杨种子发芽，分别使发芽率降低了23.75％、36.25％、41.25％，其他剂量的处理与对照间差异不显著(图2)。在25mmol·l-1nacl胁迫下，100和150gy的辐射处理下发芽率提高，较对照分别提高了15％、16.25％，差异不显著(p>0.05)；在50mmol·l-1nacl胁迫下，100和150gy的辐射对种子发芽的促进作用最明显，分别提高了20％、25％(p＜0.05)。150-300mmol·l-1nacl胁迫下，随着nacl浓度的上升，辐射处理对胡杨种子萌发的抑制作用更显著，但250mmol·l-1nacl胁迫下，50gy剂量辐射处理的发芽率与对照相比极显著提高了21.25％(p＜0.01)(图2)。不同剂量辐射处理下的种子发芽率、发芽势、相对伤害率及相对发芽率在nacl浓度间差异性均通过极显著性检验(p<0.01)。由图3可知，在150gy剂量辐射处理下，不同nacl胁迫下的发芽率、发芽势及相对发芽率提高，相对盐害率降低，据方差分析结果，除了100gy剂量辐射外，平均发芽率、发芽势、相对发芽率及相对盐害率与对照组和其它处理组之间的发芽指标值差异极显著(p＜0.01)，说明150gy剂量辐射对nacl胁迫下的胡杨种子萌发有一定的促进作用。辐射剂量为50gy时，种子发芽率、发芽势及相对发芽率明显降低(p＜0.01)，相对盐害率增大(p＜0.01)。随着辐射剂量的升高(100～200gy)，各项发芽指标呈升高的趋势，与对照组相比极显著性差异(p＜0.01)，200gy与对照组差异不显著(p>0.05)，与对照组(0gy)相比增大7.29％、10.2％和4.0％(图3)。表2显示为60co-γ射线辐射对胡杨种子相对发芽率与不同盐浓度之间的回归方程。表2其中，**表示在0.01水平上差异显著，其中x表示盐浓度，y表示相对发芽率。由表2可知，60co-γ射线辐射处理下的胡杨种子相对发芽率与盐浓度间存在显著负相关关系(p<0.01)。由不同辐射剂量处理的相对发芽率和盐浓度之间的回归方程推算出种子萌发的耐盐适宜浓度(发芽率达到75％的nacl浓度)，耐盐临界浓度(发芽率达到50％的nacl浓度)和耐盐致死浓度(发芽率为10％的nacl浓度)。不同辐射剂量处理下，100gy和150gy种子的耐盐适宜浓度为123～135mmol·l-1，耐盐临界浓度为172～181mmol·l-1，与其它辐射剂量相比其耐盐浓度高(辐射剂量ck组、50与200gy的耐盐适宜浓度和耐盐临界浓度分别为26～104mmol·l-1，119～159mmol·l-1)。耐盐临界浓度常作为评价耐盐性的一个指标[18]，根据不同辐射剂量处理下的胡杨种子的耐盐临界浓度值(表2)，其150gy处理下的种子的耐盐性(181mmol·l-1)强于其它辐射处理种子的耐盐临界浓度，其耐盐性强弱排序为：150gy>100gy>200gy>0gy>50gy。综上所述，胡杨种子的萌发最适萌发条件为150gy剂量辐射与181mmol·l-1nacl浓度。本发明的技术关键点：1、以胡杨种子为研究材料，使用60co-γ射线进行辐射处理；2、对胡杨种子的辐射处理研究表明181mmol·l-1高盐环境下，150gy剂量辐射处理可促进种子的萌发；3、在所确定的剂量下进行辐射，诱变率最佳，有利于胡杨种子萌发。最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12