葡萄糖和乙醇在协同调控斑马鱼心血管发育中的应用的制作方法

本发明属于生物发育领域，涉及葡萄糖和乙醇在协同调控斑马鱼心血管发育中的应用。

背景技术：

胚胎的发育毒性大多由环境与遗传因素共同造成，环境因素对胚胎发育的影响日益受到重视。因此，借助动物模型深入研究环境因素对心血管的发育毒性作用具有重要的现实意义。

斑马鱼是一种新型模式生物，具有体外受精、发育快速、胚胎透明等优点，已经广泛应用于发育生物学和环境毒理学研究。能够在转基因斑马鱼tg(fli1a:egfp)和tg(cmlc2:gfp)活体对胚胎发育早期的血管生成和心脏发育进行实时、定性和定位观察，为研究环境因素对心血管系统发育的影响提供了极为便利的条件。本申请以tg(fli1a:egfp)和tg(cmlc2:gfp)两种转基因斑马鱼为研究对象，观察了葡萄糖和乙醇对斑马鱼胚胎血管发生的干扰作用以及对心脏发育的影响，并对其作用机制做初步探讨。

技术实现要素：

根据本发明的一个方面，本发明提供了葡萄糖在制备诱导斑马鱼血管生成缺陷的药物中应用。

进一步，诱导斑马鱼血管生成缺陷时，葡萄糖的作用浓度至少为50mm。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了葡萄糖在构建具有血管生成缺陷的斑马鱼模型中的应用。

进一步，构建具有血管生成缺陷的斑马鱼模型时，葡萄糖的作用浓度至少为50mm。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了乙醇制备诱导斑马鱼血管生成缺陷的药物中的应用。

进一步，血管生成缺陷包括躯干节间血管生成缺陷、肠下静脉血管生成缺陷。

诱导躯干节间血管生成缺陷时乙醇的作用浓度至少为500mm；诱导肠下静脉血管生成缺陷时乙醇的作用浓度至少为400mm。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了乙醇在构建具有血管生成缺陷的斑马鱼模型中的应用。

进一步，血管生成缺陷包括躯干节间血管生成缺陷、肠下静脉血管生成缺陷。

构建具有躯干节间血管生成缺陷的斑马鱼模型时乙醇的作用浓度至少为500mm；构建具有肠下静脉血管生成缺陷的斑马鱼模型时乙醇的作用浓度至少为400mm。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了乙醇制备诱导斑马鱼心脏发育缺陷的药物中的应用。

进一步，诱导心脏发育缺陷时乙醇的作用浓度至少为300mm。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了乙醇制备构建具有心脏发育缺陷的斑马鱼模型中的应用。

进一步，构建具有心脏发育缺陷的斑马鱼模型时乙醇的作用浓度至少为300mm。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括葡萄糖、乙醇。

进一步，保持葡萄糖含量恒定，葡萄糖与乙醇的摩尔质量比至多为1:2。

更进一步，当所述药物组合物用于诱导斑马鱼躯干节间血管生成缺陷时，葡萄糖与乙醇的摩尔质量比至多为1:4。

当所述药物组合物用于诱导斑马鱼肠下静脉血管生成缺陷时，葡萄糖与乙醇的摩尔质量比至多为1:6。

当所述药物组合物用于诱导斑马鱼心脏发育缺陷时，葡萄糖与乙醇的摩尔质量比至多为1:2。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了葡萄糖和乙醇的组合在制备诱导斑马鱼血管生成缺陷的药物中的应用。

进一步，血管生成缺陷包括躯干节间血管生成缺陷、肠下静脉血管生成缺陷。

诱导躯干节间血管生成缺陷时葡萄糖的作用浓度至少为50mm，乙醇的作用浓度至少为200mm；诱导肠下静脉血管生成缺陷时葡萄糖的作用浓度至少为50mm，乙醇的作用浓度至少为300mm。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了葡萄糖和乙醇的组合在构建具有血管生成缺陷的斑马鱼模型中的应用。

进一步，血管生成缺陷包括躯干节间血管生成缺陷、肠下静脉血管生成缺陷。

构建躯干节间血管生成缺陷的斑马鱼模型时葡萄糖的作用浓度至少为50mm，乙醇的作用浓度至少为200mm；构建肠下静脉血管生成缺陷的斑马鱼模型时葡萄糖的作用浓度至少为50mm，乙醇的作用浓度至少为300mm。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了葡萄糖和乙醇的组合在制备诱导斑马鱼心脏发育缺陷的药物中的应用。

进一步，葡萄糖的作用浓度至少为50mm，乙醇的作用浓度至少为100mm。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了葡萄糖和乙醇的组合在构建具有心脏发育缺陷的斑马鱼模型中的应用。

进一步，葡萄糖的作用浓度至少为50mm，乙醇的作用浓度至少为100mm。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种诱导斑马鱼血管生成缺陷的方法。所述方法包括施用作用浓度至少为50mm的葡萄糖。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种诱导斑马鱼血管生成缺陷的方法。所述方法包括：当血管生成缺陷为躯干节间血管生成缺陷时，施用作用浓度至少为500mm的乙醇；当血管生成缺陷为肠下静脉血管生成缺陷时，施用作用浓度至少为400mm的乙醇。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种诱导斑马鱼血管生成缺陷的方法。所述方法包括：当血管生成缺陷为躯干节间血管生成缺陷时，施用作用浓度至少为50mm的葡萄糖和作用浓度至少为200mm的乙醇；当血管生成缺陷为肠下静脉血管生成缺陷时，施用作用浓度至少为300mm的乙醇。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种构建具有血管生成缺陷的斑马鱼模型的方法。所述方法包括：施用作用浓度至少为50mm的葡萄糖。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种构建具有血管生成缺陷的斑马鱼模型的方法。所述方法包括：当血管生成缺陷为躯干节间血管生成缺陷时，施用作用浓度至少为500mm的乙醇；当血管生成缺陷为肠下静脉血管生成缺陷时，施用作用浓度至少为400mm的乙醇。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种构建具有血管生成缺陷的斑马鱼模型的方法。所述方法包括：当血管生成缺陷为躯干节间血管生成缺陷时，施用作用浓度至少为50mm的葡萄糖和作用浓度至少为200mm的乙醇；当血管生成缺陷为肠下静脉血管生成缺陷时，施用作用浓度至少为300mm的乙醇。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种诱导斑马鱼心脏发育缺陷的方法。所述方法包括：施用作用浓度至少为300mm的乙醇。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种诱导斑马鱼心脏发育缺陷的方法。所述方法包括：施用作用浓度至少为50mm的葡萄糖和作用浓度至少为100mm的乙醇。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种构建具有心脏发育缺陷的斑马鱼模型的方法。所述方法包括：施用作用浓度至少为300mm的乙醇。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种构建具有心脏发育缺陷的斑马鱼模型的方法。所述方法包括：施用作用浓度至少为50mm的葡萄糖和作用浓度至少为100mm的乙醇。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了利用前面所述的构建具有血管生成缺陷的斑马鱼模型的方法构建而成的具有血管生成缺陷的斑马鱼模型。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了利用前面所述的构建具有心脏发育缺陷的斑马鱼模型的方法构建而成的具有心脏发育缺陷的斑马鱼模型。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了同时利用前面所述的构建具有血管生成缺陷的斑马鱼模型的方法以及构建具有心脏发育缺陷的斑马鱼模型的方法构建而成的具有血管生成缺陷和心脏发育缺陷的斑马鱼模型。

本发明的优点和有益效果：

(1)本发明提供了诱导具有心血管缺陷的斑马鱼模型的新方法。

(2)本发明利用转基因斑马鱼tg(fli1a:egfp)和tg(cmlc2:gfp)为模型，研究了乙醇和葡萄糖两种常见的环境危险因素在胚胎心血管系统发育中的毒性，发现胚胎期乙醇和/或葡萄糖作用下可以引起严重的心血管系统发育障碍。研究结果对人类预防胎儿心血管发育畸形的产生具有借鉴意义，特别是糖尿病合并妊娠或妊娠期间摄入乙醇类物质对心血管发育潜在的严重影响，应该加以预防。

附图说明

图1显示葡萄糖影响斑马鱼微细血管形成的荧光图；

图2显示乙醇影响斑马鱼微细血管形成的荧光图；

图3显示乙醇影响斑马鱼心脏发育的荧光图；

图4显示乙醇对cmlc2基因mrna表达水平影响的统计图；

图5显示葡萄糖和乙醇影响斑马鱼微细血管形成的荧光图；

图6显示葡萄糖和乙醇影响斑马鱼心脏发育的荧光图；

图7显示葡萄糖和乙醇对has2基因mrna表达水平影响的统计图；

图8显示葡萄糖和乙醇对cmlc2基因mrna表达水平影响的统计图；。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例葡萄糖和乙醇对斑马鱼心血管发育的影响

1、实验动物

转基因斑马鱼tg(fli1a:egfp)(该转基因斑马鱼的构建过程参见文献：lawsonnd,weinsteinbm.invivoimagingofembryonicvasculardevelopmentusingtransgeniczebrafish.devbiol.2002aug15；248(2):307-18.pubmedpmid:12167406)和tg(cmlc2:gfp)(该转基因斑马鱼的构建过程参见文献：burnscg,milandj,grandeej,rottbauerw,macraeca,fishmanmc.high-throughputassayforsmallmoleculesthatmodulatezebrafishembryonicheartrate.natchembiol.2005oct；1(5):263-4.epub2005sep18.pubmedpmid:16408054)。按标准化方案养殖斑马鱼。水温28.5℃，光照/黑暗周期为14h/10h，成体斑马鱼产卵后一小时收集胚胎，养殖于e3孵化液，以受精的小时数(hourspost-fertilization，hpf)表示胚胎和幼鱼的发育阶段。为避免发育过程中的色素沉着产生假阳性荧光信号，在e3孵化液中加入0.003％的1-苯基-2-硫脲(1-phenyl-2-thiourea，ptu，sigma)至96hpf。

2、乙醇和葡萄糖暴露

选取胚胎发育至75％外包(epiboly)毒性敏感期进行乙醇和葡萄糖暴露。单独葡萄糖暴露组设置10mm、25mm、50mm、75mm、100mm五种浓度。单独乙醇暴露组设置100mm、200mm、300mm、400mm、500mm五种浓度。葡萄糖-乙醇联合暴露组采用50mm的葡萄糖分别与100mm、200mm、300mm、400mm、500mm五种浓度的乙醇联合作用。各组均在溶液环境下暴露16小时，24hpf暴露结束后用e3孵化液冲洗3次后置于含0.003％ptu的e3孵化液常规养殖。每个浓度的暴露实验重复三次，每次设置3个平行组，每组30枚胚胎；相同数目的胚胎加入等体积e3孵化液为对照组。

3、血管发生和心脏发育的检测指标

血管发生以tg(fli1a：egfp)在72hpf躯干节间血管(intersegmentalvessel，isv)和96hpf肠下静脉(subintestinalveinvessel，siv)出现荧光信号减弱、连续性中断视为发育迟缓。心脏发育以tg(cmlc2:gfp)在96hpf是否出现心包水肿作为心脏异常的指标。使用显微镜观察斑马鱼的形态以及荧光染色部位。

4、心血管发育相关标志基因的检测

提取72hpf胚胎总rna，rt-pcr方法分别检测心脏发育相关标志基因cmlc2和has2的mrna的表达水平，引物序列见表1。

表1pcr扩增相关引物序列

pcr反应条件为：94℃2min预变性，94℃30s，62℃30s，72℃30s，35个循环，72℃5min延伸。利用biorad的universalhood3凝胶成像系统的quantityone软件进行半定量分析。

5、统计学分析

利用spss13.0软件对多组数据进行方差分析，p<0.05表示具有统计学意义。

6、结果

(1)高浓度葡萄糖阻碍斑马鱼微细血管形成

在生理情况下，对照组在72hpf已经形成完整的isv，绿色荧光蛋白分布于躯干节间。葡萄糖暴露下，isv表型的改变主要发生在50mm以上高浓度，50mm表现为部分区域isv荧光信号减弱，提示血管变细(白色箭头)；75mm部分区域荧光信号消失，提示isv的连续性中断(红色箭头)；100mm组isv的变细(白色箭头)和断裂(红色箭头)更为显著。生理情况下，siv在96hpf发育完成，在腹部卵黄囊形成纤细的篮状血管网。在50mm组开始出现siv篮状血管网的血管数目减少(黄色箭头)；75mm组血管数目减少更为明显(橙色箭头)；至100mm组siv的形成几乎完全被抑制，未见篮状血管网(蓝色箭头)，结果见图1。

(2)乙醇干扰斑马鱼的血管发生和心脏发育

乙醇干扰斑马鱼血管发生的表现形式与葡萄糖处理组相似，isv的变细(白色箭头)或断裂(红色箭头)出现在500mm组。siv的表型改变出现在400mm以上组，篮状血管网数目减少(黄色箭头)，500mm组更为明显(橙色箭头)，结果见图2。

乙醇对心脏发育的影响主要表现为心包水肿，300mm以上尤其明显，结果见图3。心脏发育标志基因cmlc2的mrna表达水平在300mm以上组与对照组相比差异有统计学意义，结果见图4。

(3)葡萄糖和乙醇联合暴露加重心血管发育的毒性

在50mm葡萄糖作用下，200mm的乙醇即发生isv的变细(白色箭头)、断裂甚至缺失(红色箭头)；300mm乙醇可导致siv的变化，如篮状血管网的数目减少(白色箭头)、面积减小(橙色箭头)甚至完全被抑制(蓝色箭头)，结果见图5。

以50mm葡萄糖和乙醇共同暴露，在100mm乙醇组就出现了心包的明显水肿，其程度与单独乙醇处理时300mm相似，结果见图6。对心脏发育相关标志基因has2和cmlc2的mrna的表达水平分析显示，100mm以上乙醇组has2和cmlc表达水平与对照组相比差异有统计学意义，结果见图7和图8。

此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>南开大学

<120>葡萄糖和乙醇在协同调控斑马鱼心血管发育中的应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

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<213>人工序列(artificialsequence)

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