本发明属于保种培养技术领域，尤其涉及一种斑马鱼保种培养方法。
背景技术：
斑马鱼是一种小型热带淡水鱼，其基因与人类基因相似度达到87％，并作为胚胎发育生物学和遗传学的实验动物模型被广泛地运用于早期胚胎发育基因表达控制的研究。斑马鱼和人类基因有着87％的高度同源性，作为模式生物的优势很突出，其实验结果大多数情况下适用于人体，常可用于水质环境的监测。
成熟的斑马鱼每隔几天可产卵一次，卵子体外受精，体外发育，胚胎发育速度快，胚胎透明。发育温度要求在25℃～31℃之间。雌鱼每次产卵200-300枚，到达繁殖期，可连续产卵几周。胚胎在24小时内就可发育成形，这使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验，进而研究病理演化过程并找到病因。
斑马鱼从胚胎发育至成鱼需要经历4个时期：胚胎期(0-4dpf)，幼苗期(5-15dpf)，幼鱼期(16-90dpf)，成鱼期(>90dpf)。斑马鱼在胚胎期不需要喂食，经过胚胎期后需要喂食，幼苗期每日需人工投喂开口料2-3次。但是，斑马鱼在成鱼期的人工养殖过程较为繁琐，且人工换水等操作易造成斑马鱼幼鱼损伤。
技术实现要素：
本发明提供了一种斑马鱼幼鱼保种培养方法，用于解决斑马鱼在成鱼期的人工养殖过程较为繁琐，且人工换水等操作易造成斑马鱼损伤的问题。
具体方案如下：
一种斑马鱼保种培养方法，包括以下步骤：
a)在装有灭菌水的透光容器内接种绿藻并进行曝气增氧；
b)在所述透光容器内接种草履虫，加入有益菌后接种斑马鱼幼鱼，投入斑马鱼胚胎；
其中，所述透光容器光暗比为10～14：10～14的环境下，在预置时间对所述透光容器进行灭菌水的补充。
本发明斑马鱼保种培养方法中，建立了一个有益菌-绿藻-草履虫-斑马鱼食物链式单缸水生生态培养系统，孵化后的斑马鱼胚胎绒毛膜和斑马鱼幼鱼的排泄物在透光容器底部形成有机物，经过有益菌的降解，为绿藻的生长提供了n、p等营养物质，促进绿藻生长繁殖。绿藻-草履虫-斑马鱼为捕食关系，而有益菌降解有机物可保持绿藻生长所必须的营养元素，草履虫数量增多，斑马鱼捕食草履虫使草履虫数量维持稳定，通过人工控制斑马鱼幼鱼数量，防止斑马鱼过度捕食草履虫，同时草履虫和斑马鱼所产生的有机排泄物被有益降解，绿藻可在底部形成植被，维持水生生态培养系统中所需要的氧气，可使溶解氧维持在6mg/l以上，菌-藻-草履虫-斑马鱼可以维持一个相对平衡的水生生态系统，模拟出自然生态系统，使其具有循环性和稳定性。水生生态培养系统让斑马鱼胚胎稳定孵化和生长，除在透光容器补充蒸发的水分外，无需添加额外的饲料，无须人工维持水中的ph、溶解氧等条件，操作简单，经济有效，且使斑马鱼胚胎能够稳定孵化和生长至成鱼期，斑马鱼幼鱼生长至成鱼期，可稳定获得大量斑马鱼成鱼，省去一般培养中对环境系统条件的控制，减少了大量的时间，且达到了实验室保种和获得大量同亲代斑马鱼成鱼的目的。
斑马鱼每次可以产卵200～300颗，坏死的胚胎可能会影响到健康胚胎，在现有的斑马鱼胚胎培养中，需要将成功受精的健康胚胎与坏死的胚胎进行分离，分离工作繁琐，而采用本发明斑马鱼保种培养方法，坏死的胚胎会被水生生态培养系统中的有益菌分解，不需进行分离步骤，大大节约了人力，并且有益菌分解坏死的胚胎可作为有机物的补充。
本发明中，透光容器置于24℃～30℃的环境下，采用自来水用高压灭菌锅灭菌并冷却至室温得到灭菌水，曝气增氧采用增氧泵进行，曝气增氧的时间为2～3天，去除灭菌水中的氯气并为培养系统提供氯气。透光容器放置的环境无阳光直射，温度优选保持在28℃±1℃，生态培养系统的ph维持在6～8，光暗比优选为14∶10，更优选为室内恒温环境。透光容器优选为玻璃质容器，容量大于10l，形态不做具体限定。
本发明中，在预置时间对透光容器进行灭菌水的补充，预置时间优选为每隔一周，添加蒸发掉的水分使透光容器内的灭菌水保持稳定。
优选的，所述绿藻选自蛋白核小球藻、衣藻或栅藻。
更优选的，绿藻为蛋白核小球藻。
优选的，所述绿藻的接种密度为5×106个/l～10×106个/l。
更优选的，绿藻的接种密度为5×106个/l。
优选的，所述草履虫选自绿草履虫、尾草履虫、双小核草履虫或多小核草履虫。
更优选的，草履虫为绿草履虫。
优选的，所述草履虫的接种密度为10000个/l～15000个/l。
更优选的，草履虫的接种密度为10000个/l。
优选的，所述有益菌选自发光细菌、光合细菌或硝化细菌。
更优选的，有益菌为发光细菌，可以降解有机物如斑马鱼胚胎的绒毛膜、斑马鱼的排泄物等和有毒物质，可以净化水体，也可以作为草履虫的食物。
本发明中，加入有益菌的数量为1×107个/l～10×108个/l，更优选为5×107个/l。
优选的，所述斑马鱼幼鱼为10dpf～30dpf幼鱼。
优选的，所述斑马鱼幼鱼的接种密度为50条/l～150条/l。
更优选的，斑马鱼幼鱼的接种密度为100条/l。
优选的，步骤b)之后还包括：
将成长至成鱼期的斑马鱼进行转移并投放新的斑马鱼胚胎。
本发明中，斑马鱼幼鱼和斑马鱼胚胎成长至成鱼期时，需从该水生生态培养系统中转移至普通水族箱，控制水生生态培养系统中的斑马鱼幼鱼数量在50～150条/l，防止斑马鱼在水生生态培养系统中成为优势群种，防止草履虫和绿藻过度繁殖，将成长至成鱼期的斑马鱼进行转移能够防止大鱼吃小鱼和大鱼吃鱼卵的情况。投放新的斑马鱼胚胎为同亲代斑马鱼胚胎，同亲代斑马鱼胚胎在该水生生态培养系统中共同成长至成鱼期，再进行转移，使得能够获得大量同亲代斑马鱼成鱼。
优选的，步骤b)之后还包括：
步骤d)添加所述草履虫和所述有益菌，以保证有足够的草履虫供斑马鱼食用，有足够的有益菌处理有机污染物。
本发明斑马鱼保种培养方法建立了一个有益菌-绿藻-草履虫-斑马鱼食物链式单缸水生生态培养系统，在水生生态培养系统中，孵化后的斑马鱼胚胎绒毛膜在容器底部形成有机物，经过发光细菌的降解，为蛋白核小球藻的生长提供了n、p等营养物质，促进蛋白核小球藻生长繁殖，蛋白核小球藻-草履虫-斑马鱼为捕食关系，而发光细菌降解有机物可保持蛋白核小球藻生长所必须的营养元素，草履虫数量增多，斑马鱼捕食草履虫使草履虫数量维持稳定，通过人工控制斑马鱼幼鱼数量，防止斑马鱼过度捕食草履虫，同时草履虫和斑马鱼所产生的有机排泄物被发光细菌降解，蛋白核小球藻可在底部形成植被，维持系统中所需要的氧气，有益菌可以降解有机物如斑马鱼胚胎的绒毛膜、斑马鱼的排泄物等和有毒物质，可以净化水体，也可以作为草履虫的食物，草履虫以蛋白核小球藻、有益菌等为食，斑马鱼胚胎孵化后遗落的胚胎绒毛膜有利于绿藻的生长，从而可以相辅相成，从而可以保持水生生态系统水质的稳定性，让斑马鱼胚胎在该生态系统中稳定孵化和生长，除在透光容器补充蒸发的水分外，无需添加额外的饲料，无须人工维持水中的ph、溶解氧等条件，操作简单，经济有效，且使斑马鱼胚胎能够稳定孵化和生长至成鱼期，斑马鱼幼鱼生长至成鱼期，可稳定获得大量斑马鱼成鱼，省去一般培养中对环境系统条件的控制，减少了大量的时间，且达到了实验室保种的目的。本发明斑马鱼保种培养方法能够在实验室条件下使用，操作简单，可大量保存幼鱼，可大批量培养同一传代的斑马鱼幼鱼，对研究斑马鱼传代实验提供基础，成功解决了传统斑马鱼幼鱼培养中、对斑马鱼胚胎培养中的人工控制如水体的更换、排泄物的清理和定期的喂食的复杂及繁琐，并尽可能地模拟出正常斑马鱼胚胎在河体中的孵化及发育环境，只需把斑马鱼胚胎投放至该水生生态系统中，斑马鱼胚胎即可在其中完成孵化及发育至成鱼的过程，中间只需要定期补充水分，并把已发育至成鱼的斑马鱼移出即可，操作简单，能够得到稳定的斑马鱼成鱼。
综上所述，本发明提供了一种斑马鱼保种培养方法，包括以下步骤：a)在装有灭菌水的透光容器内接种绿藻并进行曝气增氧；b)在所述透光容器内接种草履虫，加入有益菌后接种斑马鱼幼鱼，投入斑马鱼胚胎；其中，所述透光容器置于光暗比为14～12：10～12的环境下，在预置时间对所述透光容器进行灭菌水的补充。本发明斑马鱼保种培养方法中，建立了一个有益菌-绿藻-草履虫-斑马鱼食物链式单缸水生生态培养系统，让斑马鱼胚胎在该生态系统中稳定孵化和生长，除在透光容器补充蒸发的水分外，无需添加额外的饲料，无须人工维持水中的ph、溶解氧等条件，操作简单，经济有效，且使斑马鱼胚胎能够稳定孵化和生长至成鱼期，斑马鱼幼鱼生长至成鱼期，可稳定获得大量斑马鱼成鱼，省去一般培养中对环境系统条件的控制，减少了大量的时间，且达到了实验室保种的目的。
具体实施方式
本发明提供了一种斑马鱼幼鱼保种培养方法，用于解决斑马鱼在成鱼期的人工养殖过程较为繁琐，且人工换水等操作易造成斑马鱼损伤的问题。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例将10l自来水经高压灭菌锅灭菌并冷却至室温后装入容量为20l的立方体透光容器内，按照接种5×106个/l的密度接种蛋白核小球藻并用增氧泵进行曝气增氧，三天后按照10000个/l的密度在透光容器内接种纯化后的绿草履虫，然后加入5×107个/l发光细菌，增氧泵不再曝气，再按照加入100条/l的密度接种10dpf～30dpf的斑马鱼幼鱼，投入斑马鱼胚胎，将透光容器放入人工光照的环境，温度保持在28℃±1℃，光暗比为14：10，每隔一周往透光容器中添加蒸发掉的水分，使透光容器内的水量维持在10l，并添加绿草履虫和蛋白核小球藻生长的发光细菌。
斑马鱼幼鱼和斑马鱼胚胎成长至成鱼期时，将斑马鱼成鱼从透光容器中转移至普通水族箱，控制斑马鱼幼鱼数量在50条/l～100条/l，防止斑马鱼在水生生态培养系统中成为优势群种并过度繁殖。待该水生生态培养系统稳定后，投放斑马鱼胚胎的数量等于斑马鱼成鱼转移的数量即可继续保持该系统食物链的稳定。该水生生态培养系统无需换水，无需人工饲养斑马鱼幼鱼，直接投放斑马鱼胚胎即可让斑马鱼胚胎在系统中稳定孵化和发育至成鱼期，可以稳定获得斑马鱼成鱼，达到为实验室长期提供优良纯种的目的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。