本发明涉及植物生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种山乌龟的组织培养技术。
背景技术：
山乌龟为防已科植物，取其干燥根。主产云南、贵州、广西、四川等地。全年均可采收，以秋季采挖为佳。除去泥土及细须根，切片晒干。气微、味苦。具有清热解毒，消痰，散瘀止痛。用于痈疽肿毒，胃痛，喉痛，跌打损伤，毒蛇咬伤。山乌龟长期以来供不应求，加上人为的掠夺式砍伐导致山乌龟野生资源枯竭，因此有必要对其资源进行保护。近年来，山乌龟资源开发有了一定的规模，在江西、湖北、广东、福建等建立了gap种植基地，对山乌龟野生资源保护工作起到了一定的促进作用。目前山乌龟主要通过种子进行种苗繁殖，但由于种子繁殖后代性状发生分离，不利于优质种质资源保护，制约了优质山乌龟的推广种植。因此，有必要建立山乌龟的组织培养技术，为其良种快速繁殖提供技术支撑和保障，也为满足我国对山乌龟种苗的需求，加速其资源扩充具有重要的现实意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种山乌龟的组织培养技术，本发明以山乌龟带芽茎段为外植体，经过外植体消毒、丛生芽诱导、生根培养、炼苗移栽等过程从而建立了山乌龟组织培养快速繁殖体系，从而实现了本发明的目的。
本发明的一种山乌龟的组织培养技术，包括以下的步骤：
步骤1，丛生芽诱导：选取生长健壮无病虫的幼树当年生的带芽茎段作为外植体,用洗洁精水溶液浸泡18min，然后用自来水冲洗38min，擦干表面水分后备用,在超净工作台中以70%～80%乙醇浸泡16s，0.1%升汞溶液消毒30min，再用无菌水清洗12次，擦干后切成长度为2cm的茎段接种到诱导培养基上,先在30℃条件下全暗培养28天，然后置于每天光照18小时，光照强度为1000lx，培养温度为30℃条件下培养，直至诱导形成丛生芽；诱导培养基为：ms+6mg/l6-ba+2mg/lnaa+0.9mmol/lla(no3)2+3.5%蔗糖+0.8%琼脂+0.2%活性炭，ph值为5.8;
步骤2，增殖培养：将步骤1所得的丛生芽转入增殖培养基上进行增殖培养，接种后先在30℃条件下全暗培养直至叶腋处萌生一个侧芽，然后置于每天光照18小时，光照强度为1000lx，培养温度为30℃的条件下培养直至各丛生芽伸长到8cm；增殖培养基为：ms+3mg/l6-ba+0.9mg/lnaa+3.5%蔗糖+0.6%琼脂+0.3%活性炭，ph值为5.8;
步骤3，生根培养：将步骤1或步骤2所获得的高度约为5cm的丛生芽芽切割并接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在30℃条件下全暗培养12天，然后置于每天光照18小时，光照强度为2000lx，培养温度为30℃的条件下培养至生根；生根培养基为：1/2ms+4mg/lnaa+3.5%蔗糖+0.8%琼脂+0.3%活性炭，ph值为5.8;
步骤4，炼苗移栽：山乌龟瓶内生根31天后，置于自然光照下炼苗10天后，洗净根部培养基，移栽由黄心土：河沙=4：2混合成的基质中。
与现有技术相比本发明的优点是：本发明通过离体快繁技术获得优质种苗的育苗方法。以山乌龟带芽茎段为外植体，经过外植体消毒、丛生芽诱导、生根培养、炼苗移栽等过程从而建立了山乌龟组织培养快速繁殖体系，加速山乌龟良种的推广和资源开发利用具有重要的现实意义。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1：
（1）丛生芽诱导：选取生长健壮无病虫的幼树当年生的带芽茎段作为外植体,用洗洁精水溶液浸泡6min，然后用自来水冲洗10min，擦干表面水分后备用。在超净工作台中以75%乙醇浸泡10s，0.1%升汞溶液消毒15min，再用无菌水清洗10次，擦干后切成长度为3.0cm的茎段接种到诱导培养基上,先在26℃条件下全暗培养20天，然后置于每天光照18小时，光照强度为1000x，培养温度为26℃条件下培养40天即可诱导形成丛生芽，诱导率为70%。所述诱导培养基为ms+3mg/l6-ba+0.7mg/lnaa+0.2mmol/lla(no3)2+3.6%蔗糖+0.30%琼脂+0.08%活性炭，ph值为5.7。
（2）增殖培养：将步骤（1）所得的丛生芽转入增殖培养基上进行增殖培养，接种后先在26℃条件下全暗培养直至叶腋处萌生一个侧芽，然后置于每天光照18小时，光照强度为1000lx，培养温度为26℃的条件下培养35天各丛生芽即可伸长到6cm，增殖率为6.0。所述增殖培养基为ms+2mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+1.5%蔗糖+0.30%琼脂+0.08%活性炭，ph值为5.7。
（3）生根培养：将步骤（1）或步骤（2）所获得的高度约为5cm的丛生芽芽切割并接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在26℃条件下全暗培养8天，然后置于每天光照10小时，光照强度为2500lx，培养温度为26℃的条件下培养41天即可生根，生根率为75%。
（4）炼苗移栽：山乌龟瓶内生根20天后，置于自然光照下炼苗8天后，洗净根部培养基，移栽由黄心土：河沙=3：2混合成的基质中。移栽成活率为90%。
实施例2：
（1）丛生芽诱导：选取生长健壮无病虫的幼树当年生的带芽茎段作为外植体,用洗洁精水溶液浸泡6min，然后用自来水冲洗16min，擦干表面水分后备用。在超净工作台中以75%乙醇浸泡4s，0.1%升汞溶液消毒10min，再用无菌水清洗4次，擦干后切成长度为2.5cm的茎段接种到诱导培养基上,先在26℃条件下全暗培养18天，然后置于每天光照14小时，光照强度为1600x，培养温度为26℃条件下培养30天即可诱导形成丛生芽，诱导率为76%。所述诱导培养基为ms+7mg/l6-ba+1.0mg/lnaa+0.5mmol/lla(no3)2+3.5%蔗糖+0.40%琼脂+0.2%活性炭，ph值为5.9。
（2）增殖培养：将步骤（1）所得的丛生芽转入增殖培养基上进行增殖培养，接种后先在26℃条件下全暗培养直至叶腋处萌生一个侧芽，然后置于每天光照16小时，光照强度为2000lx，培养温度为26℃的条件下培养34天各丛生芽即可伸长到6cm，增殖率为7.3。所述增殖培养基为ms+1.8mg/l6-ba+0.9mg/lnaa+2.6%蔗糖+0.36%琼脂+0.2%活性炭，ph值为5.9。
（3）生根培养：将步骤（1）或（2）所获得的高度约为6cm的丛生芽芽切割并接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在26℃条件下全暗培养6天，然后置于每天光照12小时，光照强度为2000lx，培养温度为26℃的条件下培养31天即可生根，生根率为90%。
（4）炼苗移栽：山乌龟瓶内生根26天后，置于自然光照下炼苗6天后，洗净根部培养基，移栽由黄心土：河沙＝3：1混合成的基质中。移栽成活率为92%。