一种三倍体鲤鱼的育种方法与流程

本发明涉及鲤鱼育种技术领域，具体涉及一种三倍体鲤鱼的育种方法。

背景技术：

自然界绝大部分鱼类是由二倍体形式存在的，并以两性融合的方式繁殖后代，在二倍体鱼类的性成熟阶段，其性腺发育消耗大量能量，且由于性腺发育阶段和产卵季节鱼肉质量下降并延长上市时间，同时，性腺发育阶段个体生长停滞和死亡率增加，并且个体体型受到很大限制。自然二倍体鱼类需要人工诱导才能产生三倍体。人工诱导三倍体鱼的方法主要有冷休克、热休克、静水压等物理方法，采用化学物质(如6-二甲基氨基嘌呤(6-dmap)、秋水仙素等)处理的化学方法。目前用温度休克、静水压、药物处理等办法抑制受精卵第二极体外排，使染色体组三倍化来生产三倍体鱼在国内外也有不少报道，但大多数仍然处于探索与试验阶段，离实践应用仍有一定的距离，许多结果仍没有完全摸索出最佳的诱导参数，受精卵坏死率高、出苗率低、幼鱼畸形率高及三倍化比率偏低等现象，影响了三倍体产业化的进程。

从目前水产养殖行业的发展现状看，如果进一步优化三倍体诱导的处理条件，完善三倍体的诱导方法与技术流程，将会有更多的三倍体鱼类在水产养殖业中应用，促进鱼类养殖业的健康发展。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供一种三倍体鲤鱼的育种方法，技术方案包括以下步骤：

1)取鲤鱼成熟的卵和精液，混合均匀后撒在筛网上，浸入水中完成授精，得到受精卵；

2)将步骤1)得到的受精卵放入静水压力器仓内，进行静水压力处理；

3)将步骤2)静水压力处理后的受精卵取出，浸入冷水中处理；

4)将步骤3)得到的受精卵转移到水中孵化。

步骤1)所述鲤鱼优选镜鲤，更优选松浦镜鲤。

步骤1)所述精液和卵的体积比为500μl:(50-100)ml。

步骤1)中的水温为23-25℃。

步骤1)所述授精过程完成后，受精卵在水中继续发育3-4.5min。

步骤2)所述静水压力器仓内有500μg/ml的秋水仙素水溶液，步骤1)所得受精卵浸入秋水仙素水溶液中。

步骤2)所述静水压力处理，压力为600kg/cm²，处理时间为3min。

步骤2)所述静水压力处理过程中，秋水仙素水溶液温度为23-25℃。

步骤3)所述冷水温度为0-2℃，所述处理时间为10-15min。

步骤4)中的水温为23-25℃。

有益效果

本发明提供的方法便于现场操作、安全可靠、简单易行，利用本发明提供的方法培育三倍体鲤鱼，经检验三倍体转化率为91％，培育得到的三倍体鲤鱼，与普通二倍体相比，红细胞体积比为1.63:1，红细胞核体积比为1.56:1，三倍体鱼红细胞核长径、红细胞面积、核面积以及核体积与二倍体相比，差异极显著；三倍体鲤鱼性腺不发育，精巢切片观察呈现大面积空泡化；3龄鱼对比，三倍体鲤鱼与二倍体鲤鱼体重比为1.7±0.21。利用本方法培育的三倍体鲤鱼，不存在二倍体鱼类的性成熟阶段性腺发育消耗大量能量、由于性腺发育阶段和产卵季节鱼肉质量下降并延长上市时间、性腺发育阶段个体生长停滞和死亡率增加、等问题，在鲤科鱼类三倍体诱导和规模化养殖中具有重要应用价值。

附图说明

图1二倍体与三倍体鲤大小比较(3龄组)；

图23龄二倍体与三倍体性腺差异对比；其中2n表示二倍体，3n表示三倍体；

图33龄二倍体鲤鱼精巢组织切片光学显微镜40倍照片；

图43龄三倍体鲤鱼精巢组织切片光学显微镜40倍照片；

图5二倍体松浦镜鲤红细胞(he染色)；

图6三倍体松浦镜鲤红细胞(he染色)；

图7二倍体松浦镜鲤中期分裂相；

图8三倍体松浦镜鲤中期分裂相；

图9二倍体松浦镜鲤dna含量；

图10三倍体松浦镜鲤dna含量。

具体实施方式

实施例1

一种三倍体鲤鱼的育种方法，包括以下步骤：

1)取鲤鱼成熟的卵和精液，混合均匀后撒在筛网上，浸入水中完成授精，得到受精卵；

2)将步骤1)得到的带有受精卵的筛网迅速折叠放入静水压力器仓内，进行静水压力处理；

3)将步骤2)静水压力处理后的受精卵取出，浸入冷水中处理；

4)将步骤3)得到的受精卵转移到水中孵化。

步骤1)所述鲤鱼为松浦镜鲤。

步骤1)所述精液和卵的体积比为500μl:100ml。

步骤1)中的水温为23℃。

步骤1)所述授精过程完成后，受精卵在水中继续发育3min。

步骤2)所述静水压力器仓内有500μg/ml的秋水仙素水溶液，步骤1)所得受精卵浸入秋水仙素水溶液中。

步骤2)所述静水压力处理，压力为600kg/cm²，处理时间为3min。

步骤2)所述静水压力处理过程中，秋水仙素水溶液温度为23℃。

步骤3)所述冷水温度为0℃，所述处理时间为10min。

步骤4)中的水温为23℃。

步骤1)-3)受精卵均在筛网承载下进行操作。

实施例2

一种三倍体鲤鱼的育种方法，包括以下步骤：

1)取鲤鱼成熟的卵和精液，混合均匀后撒在筛网上，浸入水中完成授精，得到受精卵；

2)将步骤1)得到的带有受精卵的筛网迅速折叠放入静水压力器仓内，进行静水压力处理；

3)将步骤2)静水压力处理后的受精卵取出，浸入冷水中处理；

4)将步骤3)得到的受精卵转移到水中孵化。

步骤1)所述鲤鱼为松浦镜鲤。

步骤1)所述精液和卵的体积比为500μl:50ml。

步骤1)中的水温为25℃。

步骤1)所述授精过程完成后，受精卵在水中继续发育4.5min。

步骤2)所述静水压力器仓内有500μg/ml的秋水仙素水溶液，步骤1)所得受精卵浸入秋水仙素水溶液中。

步骤2)所述静水压力处理，压力为600kg/cm²，处理时间为3min。

步骤2)所述静水压力处理过程中，秋水仙素水溶液温度为25℃。

步骤3)所述冷水温度为2℃，所述处理时间为15min。

步骤4)中的水温为25℃。

步骤1)-3)受精卵均在筛网承载下进行操作。

实施例3

一种三倍体鲤鱼的育种方法，包括以下步骤：

1)取鲤鱼成熟的卵和精液，混合均匀后撒在筛网上，浸入水中完成授精，得到受精卵；

2)将步骤1)得到的带有受精卵的筛网迅速折叠放入静水压力器仓内，进行静水压力处理；

3)将步骤2)静水压力处理后的受精卵取出，浸入冷水中处理；

4)将步骤3)得到的受精卵转移到水中孵化。

步骤1)所述鲤鱼为松浦镜鲤。

步骤1)所述精液和卵的体积比为500μl:80ml。

步骤1)中的水温为24℃。

步骤1)所述授精过程完成后，受精卵在水中继续发育4min。

步骤2)所述静水压力器仓内有500μg/ml的秋水仙素水溶液，步骤1)所得受精卵浸入秋水仙素水溶液中。

步骤2)所述静水压力处理，压力为600kg/cm²，处理时间为3min。

步骤2)所述静水压力处理过程中，秋水仙素水溶液温度为24℃。

步骤3)所述冷水温度为1℃，所述处理时间为13min。

步骤4)中的水温为24℃。

步骤1)-3)受精卵均在筛网承载下进行操作。

对比例

实验组1

1)取鲤鱼成熟的卵和精液，混合均匀后撒在筛网上，浸入水中完成授精，得到受精卵；

2)将步骤1)得到的带有受精卵的筛网迅速折叠放入静水压力器仓内，进行静水压力处理；

3)将步骤2)静水压力处理后的受精卵取出，转移到水中孵化；

步骤1)所述鲤鱼为松浦镜鲤。

步骤1)所述精液和卵的体积比为500μl:80ml。

步骤1)中的水温为24℃。

步骤1)所述授精过程完成后，受精卵在水中继续发育4min。

步骤2)所述静水压力器仓内有水，步骤1)所得受精卵浸入水中。

步骤2)所述静水压力处理，压力为600kg/cm²，处理时间为3min。

步骤3)中的水温为24℃。

步骤1)-2)受精卵均在筛网承载下进行操作。

实验组2

1)取鲤鱼成熟的卵和精液，混合均匀后撒在筛网上，浸入水中完成授精，得到受精卵；

2)将步骤1)得到的带有受精卵的筛网迅速折叠放入静水压力器仓内，进行静水压力处理；

3)将步骤2)静水压力处理后的受精卵取出，浸入冷水中处理；

4)将步骤3)得到的受精卵转移到水中孵化。

步骤1)所述鲤鱼为松浦镜鲤。

步骤1)所述精液和卵的体积比为500μl:80ml。

步骤1)中的水温为24℃。

步骤1)所述授精过程完成后，受精卵在水中继续发育4min。

步骤2)所述静水压力器仓内有水，步骤1)所得受精卵浸入水中。

步骤2)所述静水压力处理，压力为600kg/cm²，处理时间为3min。

步骤2)所述静水压力处理过程中，水温度为24℃。

步骤3)所述冷水温度为1℃，所述处理时间为13min。

步骤4)中的水温为24℃。

步骤1)-3)受精卵均在筛网承载下进行操作。

实验组3

1)取鲤鱼成熟的卵和精液，混合均匀后撒在筛网上，浸入水中完成授精，得到受精卵；

2)将步骤1)得到的带有受精卵的筛网迅速折叠放入静水压力器仓内，进行静水压力处理；

3)将步骤2)静水压力处理后的受精卵取出，转移到水中孵化；

步骤1)所述鲤鱼为松浦镜鲤。

步骤1)所述精液和卵的体积比为500μl:80ml。

步骤1)中的水温为24℃。

步骤1)所述授精过程完成后，受精卵在水中继续发育4min。

步骤2)所述静水压力器仓内有500μg/ml的秋水仙素水溶液，步骤1)所得受精卵浸入秋水仙素水溶液中。

步骤2)所述静水压力处理，压力为600kg/cm²，处理时间为3min。

步骤2)所述静水压力处理过程中，秋水仙素水溶液温度为24℃。

步骤3中的水温为24℃。

步骤1)-2)受精卵均在筛网承载下进行操作。

结果验证：

三倍体鉴定方法

1)红细胞体积鉴定法

从试验鱼尾静脉采血，制备血涂片，he染色，中性光学树胶封片，在油镜下测量红细胞及核长、短径，每张血涂片随机测量10个红细胞及核大小，按照公式ab²/1.91其中a为长径，b为短径计算红细胞及核的体积，并通过二、三倍体红细胞长径范围来确定鉴定倍性时所用长径标准。

1)染色体核型分析

每尾按照5μl/g胸鳍注射pha(小牛血清溶解)，12～24h后秋水仙素按1.5μg/g体重比例注射入鱼体内，两小时后断尾、剪鳃放血，取头肾于0.75％的生理盐水中清洗3～5次，研磨后1000r/min离心5～7min，取上清，0.5％kcl室温处理40min，离心收集细胞，用卡诺固定液固定3次，每次不少于15min，冰玻片滴片，静置晾干，giemsa染色20min，自来水冲洗后晾干，显微镜下观察。

3)dna含量检测

鱼静脉取血，将300～400μl全鱼血鱼900μl生理盐水(0.75％)充分混合，将混合液缓慢滴加于6ml人淋巴细胞分离液液面之上，常温2500～3000rpm离心20min，弃上清，用生理盐水(0.75％)漂洗2～3次后加入1ml生理盐水(0.75％)重悬，取100μl细胞悬液于6ml预冷的卡诺固定液固定(冰醋酸：甲醇＝1：3)，4℃2h，800rpm，5min离心弃上清，加入6ml生理盐水(0.75％)，600rpm，3min漂洗，重复3次，最终1ml生理盐水重悬，pi避光染色，4℃染色30min，400目过滤后上机，鸡血与标准二倍体对照。

实验结果(以下结果中，三倍体为实施例3所获得的三倍体鲤鱼，二倍体为同等条件下饲养的普通二倍体鲤鱼)

1、表观性状观测

图1为二倍体与三倍体鲤(实施例3)大小比较，3龄及2龄组中，3倍体与2倍体鲤鱼，在体重及可量性状上均存在显著性差异，3龄组中，体重3n/2n＝1.7±0.21。

2、性腺表型

图2为3龄二倍体与三倍体(实施例3)性腺差异对比，可以看出3倍体性腺败育；通过精巢切片对比(图3、4)，可见三倍体鲤鱼精巢切片相比二倍体鲤鱼精巢切片,呈现大面积空泡化。

3、红细胞核大小观察及统计

表1二、三倍体红细胞测量值及比值

^**表示呈极显著差异

二倍体鱼和三倍体鱼(实施例3)的红细胞及细胞核的大小及二者之间的差异显著性检验结果见表1。由表可以看出，三倍体鱼各项数值都高于二倍体鱼，二者之间表现出极显著差异。二倍体鱼和三倍体鱼的体积比为1:1.63，红细胞核体积比为1:1.56，三倍体鱼红细胞核长径、红细胞面积、核面积以及核体积与二倍体相比，差异极显著(p﹤0.001)。

4、染色体检测

二倍体松浦镜鲤染色体数目为2n＝100，三倍体松浦镜鲤(实施例3)染色体数目为3n＝150，见图7、图8，二倍体松浦镜鲤和三倍体松浦镜鲤染色体数目与理论预期相符。

5、dna含量检测

松浦镜鲤2n与松浦镜鲤3n(实施例3)dna相对含量见图9、图10，三倍体样本染色体数目和dna含量于标准二倍体的比值约为1:1.58，与红细胞大小测定结果相符合。染色体数目和dna含量符合比例关系，与红细胞大小测定结果相符合。

三倍体与二倍体的细胞核dna含量比值约为1:1.58，与红细胞直径、体积及染色体数目呈正相关。

6、不同诱导方法的三倍化比率(对比例)

按上述鉴定三倍体的方法，每个实验组鉴定100尾，确定各实验组三倍化比率。见表2。

表2不同实验组诱导三倍体比率

实验组1三倍体转化率为53％，实验组2三倍体转化率为67％，实验组3三倍体转化率为62％，本发明实施例3三倍体转化率为91％，另外本发明实施例1、2三倍体转化率分别为83％和87％，说明本发明极大的提高了三倍体诱导成功率，具有便于现场操作、安全可靠、简单易行等优点，在鲤科鱼类三倍体诱导和规模化养殖中具有重要应用价值。