一种灵芝不脱袋栽培方法与流程

本发明涉及食药用菌栽培领域，具体的说涉及一种灵芝不脱袋覆土栽培方法。

背景技术：

在我国灵芝是极具传奇色彩的药用真菌，被《神农本草经》和《本草纲目》等列为上品，是滋补强身、扶正培本的珍贵中药，有久服轻身延年之功效。现代医学研究已证明灵芝具有抗肿瘤、调节免疫、保肝、镇静安神、降血压等多种生物功效。目前，其已被《中国药典》、《美国草药药典与治疗概要》(americanherbalpharmacopoeiaandtherapeuticcompendium)等收录,这表明灵芝的药用价值得到了极为广泛的认同。随着药食同源、健康养生的观念日益为大众所接受，灵芝作为“有病治病、无病养生”的主要的中药之一，已经被越来越多的消费者所食用。现在我国灵芝产业的年产值达150亿元；人口不到5000万的韩国灵芝的年消费量也达到4500吨。

随着市场需求的日益旺盛，灵芝的栽培规模也随之扩大。其中，绝大部分为菌棒覆土栽培。覆土栽培有脱袋和半脱袋两种形式。因此，菌棒在覆土栽培中都会和土壤充分接触。土壤中承载着一些残留农药、重金属等污染物及一些其他的有害微生物等。研究表明，食药用真菌均具有从土壤和栽培基质中转移、吸附重金属的特性。因此当土壤中的有害物质超过土壤的自净能力，就会引起土壤理化特性和功能上的变化，其中的微生物活动即会受限，有害物质或其下游产物在土壤中逐渐积累并通过“土壤→植物(或食用真菌)→人体”，或通过“土壤→水→人体”间接被人体吸收，从而危及健康。另外一个不容忽视的问题就是灵芝的栽培及其生长发育过程伴随的虫害问题。一些研究表明，土壤中存在螨类、白蚁类等害虫喜食灵芝菌棒(菌丝体)，对灵芝栽培造成很大影响。一旦这类虫害严重，种植户就会施用一些诸如三氯杀螨醇之类的毒性强、残留期较长的农药，给食品安全带来较大风险。因此，目前的灵芝栽培方式使得灵芝原料及其产品面临着重金属和农药残留超标的风险。

研究表明灵芝栽培上存在连作障碍现象，即连续在同一地块上栽培灵芝，灵芝的产量和品质均会出现显著下降。因而，种植户几乎每年都要努力寻找新地块来栽培灵芝。这就造成了土地及其上建立的大棚等栽培设施利用效率极其低下，相应地增加了生产成本。

目前，也有一些针对灵芝栽培中出现的问题进行的探索和尝试，比如有些机构或个人利用水泥将栽培灵芝的场所进行固化，隔离菌棒和下面的土壤，从别处运来新土进行灵芝栽培，希望通过频繁更换土来减轻灵芝的连作障碍效应。这种方法也面临两个方面的问题：一是频繁更换土需要有广泛来源，同时这些土是否适合灵芝栽培；二是对这些基本为农业用地进行固化，会完全改变土壤的理化性质，造成这块土地将来无法进行其他农作物生产。还有一些企业期望利用工厂化来实现灵芝栽培，但是从实践结果来看，目前效果非常不好。这里有两个方面的制约因素：一是生产成本过高；另一个是生产中还存在目前一些技术难题。

基于上述，为了获得食用安全的灵芝子实体和孢子粉，同时为了减轻甚至消除连作障碍对灵芝产业造成的负面效应，降低生产成本，需要开发出一种新的灵芝栽培方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种灵芝不脱袋覆土栽培方法，其包括如下步骤：

栽培场地的选择、灵芝栽培基质的选择、优质灵芝菌种的挑选、灵芝菌棒的制作、灵芝不脱袋覆土栽培、灵芝孢子粉的采集、灵芝生长发育中后期菌棒的注水保湿、灵芝和孢子粉的采收；

其中灵芝栽培基质为木段和木屑培养料；

其中木段为小木段(13-16cm)；培养料选择木屑培养料使用时加水使含水量为70％；

具体的说，本发明的灵芝不脱袋栽培方法，包括如下步骤：

⑴栽培场地的选择：栽培场地远离高速公路，直线距离500m以上；因为汽车排放的尾气中含有重金属成分；

⑵栽培基质的选择：木段为小木段(13-16cm)；培养料选择木屑培养料；优选的木屑培养料的组成为：木屑78％，麸皮13％，玉米粉7％,蔗糖1％，石膏粉或碳酸钙1％，使用时加水使含水量为70％；

栽培基质的农药和重金属含量要符合国家标准和行业标准；

⑶优质灵芝菌种的挑选：将灵芝菌株接种于pda平板或类似固体培养基上，避光培养4-6天，形成的菌落是圆整的、菌丝体粗壮且致密的，即为较优菌种；

栽培种以不难碾碎为宜；栽培种培养时间过短，会影响灵芝菌棒的发育，培养时间过长，导致栽培菌种难以碾碎，影响木屑栽培种在菌棒上的快速定植和有效利用栽培基质；

⑷灵芝菌棒的制作：

ⅰ.装袋与灭菌

将截好的木段装袋，在其两端填充木屑培养料，袋口不可扎得过紧；确保热蒸汽能够正常进出，木段能被彻底杀菌；

木段的堆叠以能保证热蒸汽畅通为准，灭菌设施内的温度要迅速提升至98℃以上。

ⅱ.接种与培养(菌棒的培养时间为2.5-4个月)

将栽培种接种至木段两端的木屑培养料上；以墙式方式堆叠培养；在培养期间，给予适当的通风，并进行菌棒上下层次位置的调整，确保生长发育进程较为一致；

⑸灵芝不脱袋覆土栽培：

ⅰ.大棚的搭建

在菌棒覆土前一个月，选择晴天对步骤(1)中选出的栽培场地的土地进行翻耕，清除杂草、石块等，经阳光暴晒数日且沙土发白后，建畦；畦高20cm左右，畦宽1.5-1.8m，畦长依地形而定,一般要求不超过20m，以免影响通风；在可能发生山洪的地方还应预先开好排洪沟；每两畦建1.8-2.2m高的塑料大棚，上面覆上7m宽的塑料薄膜，以调节棚内的温、湿度，在薄膜上再覆盖2层黑色遮阳网,以获得光强合适的均匀散射光,满足灵芝生长发育对光的需要；也可在每畦上建一个塑料小拱棚，然后建一个平顶的、高2.5m左右的大棚，覆盖2层遮阳网；

ⅱ.菌棒排放与覆土

当灵芝菌棒培养成熟后，将其运输至已经布置整理好的栽培场地，不要脱去表面的袋子，将其竖直放置于地畦上，并将细土(颗粒度为0.5-1.0cm)覆盖其上，使菌棒的上端刚好露出；

ⅲ.栽培袋开口与保湿

菌棒覆土后，在棚内开挖数条沟渠，每条宽25-30cm，深30-40cm；沟渠内蓄有水，确保大棚内的湿度高于棚外，有益于灵芝的生长发育；当菌棒覆土10-15天后，沿袋口系绳处剪掉，但不要撑开袋口；

ⅳ.原基形成与发育

经过一段时间开口处会形成原基；若原基或原基上表面为浅褐色，则注水15-25ml于木屑培养基质中；若原基上表面有一些黄色，则要注水25-35ml于木屑培养基质中；若整个原基为均匀白色，而且用手触碰感觉很硬，则应立即注水40-50ml于木屑培养基质中,以补充生长发育过程中消耗掉的水分，确保灵芝正常生长需要；

当原基逐渐分化形成菌盖，并进行水平横向生长后，要根据菌盖边缘颜色来确定是否要喷水；若菌盖边缘、次边缘分别为米色、米黄色，则暂时不用喷水；若菌盖边缘为(浅)黄色，则应该喷水；若菌盖边缘的颜色为深黄色，则增加喷水频次；

⑹灵芝孢子粉的采集：

当灵芝开始喷射孢子粉后，停止喷水，并开始进行孢子粉采集；

⑺灵芝生长发育中后期菌棒的注水保湿：

在开始采集孢子粉后，灵芝生长发育还要消耗水分；所以利用注射器将20-30ml水从菌棒的袋口附近注入菌棒的木屑基质内，补充生长发育过程中消耗掉的水分，确保灵芝正常生长需要；频次平均为1次/周；

⑻灵芝和孢子粉的采收，其方法在于：

孢子粉采集时间持续了1-1.5个月后，即可进行灵芝和孢子粉的采收。

若过度延时采收，则会影响灵芝子实体和孢子粉的品质。

本发明的一种灵芝不脱袋覆土栽培方法，具有如下的有益效果：

通过本发明的灵芝不脱袋覆土栽培方法，可以连续三年以上在同一地块进行灵芝栽培，且灵芝产量没有明显变化，能够较好地缓解甚至消除连作障碍对灵芝栽培的负面影响，获得安全和品质上均有保障的灵芝子实体和孢子粉原料。同时在不显著改变土壤理化性质的前提下，大幅提高土地及其上建立的栽培设施的利用率，能显著降低生产成本，增加栽培户的收入。同时也有效提高灵芝中多糖和三萜类物质的含量。

附图说明：

图1：灵芝子实体乙醇提取物的hplc指纹图谱

具体实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1(于2014.10-2017.12三年期间，在同一地块进行连续三年灵芝栽培)

灵芝菌种：“沪农灵芝1号”，由上海市农业科学院选育。

1.栽培场地的选择

选取了安徽霍山县太阳乡没有高速路的地块，此处地势开阔，灌溉条件良好，不会出现因雨水过大而淹没的情况。

2.栽培基质的选择

灵芝栽培基质为木段(青冈栎)和木屑培养料；

其中木段截为小木段(15cm)；木屑培养料的组成为：78％木屑、13％麸皮、7％玉米粉、1％蔗糖、1％石膏粉，使用时加水混匀使含水量为70％；

对木屑培养料、木段和栽培中使用的水进行农药残留和重金属检测：

先将木段和木屑培养料中的木屑、麸皮和玉米粉等沸水浴提取1-2个小时，通过加热蒸发水分，后冷冻干燥，送有资质的检测机构(sgs集团)检测常用的农药种类残留和铅、砷、汞、镉等重金属含量；对水也进行农残和重金属检测。

检测结果均符合国家或行业标准，方可投入使用。

3.优质灵芝菌种的选择

将“沪农灵芝1号”菌株活化后接种至pda平板中央，培养4天后，观察菌落形态，选择菌落圆整、菌丝体粗壮且紧贴平板的菌株作为母种，进行后续的原种和栽培种制作。在原种和栽培种培养期间，经常观察长势情况。对于染有杂菌的原种或栽培种都要及时剔除。栽培种培养了28-32天，此时的栽培种较易碾碎用于接种。

4.灵芝菌棒的制作

⑴装袋与灭菌

将木材按照15cm的长度截好段，装入17cm×35cm规格的聚乙烯塑料袋中，在其木段的两端填充厚度约为1.0-1.2cm的木屑培养料(该培养料的含水量为70％左右，湿度要均匀)覆盖木段截面。袋口扎的松紧程度以确保热蒸汽能够正常进出，木段能被彻底杀菌为准。

木段的堆叠不做规定，以能保证热蒸汽畅通为准，灭菌设施内的温度要迅速提升至98℃，并持续保温30小时。

⑵接种与培养(培养时间为2.5-3个月)

灭菌结束后，待灭菌设施内温度降至40℃左右，搬运至已经作消毒处理过的接种室(棚或箱)内。戴上乳胶手套，用75％的酒精表面消毒。用力碾碎栽培种，接种至木段两端的木屑培养料上，扎好袋口，以墙式方式堆叠培养。在培养期间，给予一定的通风，以保证菌棒生长对氧气的需求，同时调整菌棒上下层次位置，确保生长速度较为一致。在培养的中后期，培养室(棚)内放置盛满水的盆子，以保证菌棒的生长对湿度的要求。

5.灵芝的不脱袋覆土栽培

⑴大棚的搭建

在菌棒覆土前一个月，选择晴天对步骤1中选择的栽培场地的土壤进行翻耕，清除杂草、石块等，经阳光暴晒数日且沙土发白后，建畦。畦高20cm左右，畦宽1.5-1.8m，畦长依地形而定,一般要求不超过20m，以免影响通风。在每畦上建一个塑料小拱棚，然后利用竹子等搭建一个平顶的、高2.5m左右的大棚，铺上2层遮阳网，以获得光强合适的均匀散射光，满足灵芝生长发育对光的需要；

⑵菌棒排布与覆土

当灵芝菌棒发育成熟后，且当地气温上升并维持在12-15℃时，尽可能将其完好无损地运输至栽培场地大棚内，不要脱去菌棒表面的袋子；如有破损，用胶带封闭破损处。按照行距、间距均为5-6cm的规格将其竖直排布于地畦上，并将细土(颗粒度为0.5-1.0cm)覆盖于菌棒之上，使菌棒的上端刚好露出。

⑶栽培袋开口与保湿

菌棒覆土后，在棚内开挖数条沟渠，每条宽28cm左右，深32cm左右。沟渠内蓄有较多干净的水，确保天气略显干燥时，大棚内的湿度高于棚外，有利于灵芝的生长发育。当菌棒覆土后10-15天，在袋口扎绳处剪掉，使得原基从此处长出。

⑷原基形成与发育

待开口处形成原基；若原基或原基上表面为浅褐色，则将20ml的水注入木屑培养基质中；若原基上表面有一些黄色，则将30ml的水注入木屑培养基质中；若整个原基为均匀白色，而且用手触碰感觉很硬，则应立即将40ml的水注入木屑培养基质中,以补充生长发育过程中消耗掉的水分，确保灵芝正常生长需要。

当原基逐渐分化形成菌盖，并进行水平横向生长后，要根据菌盖边缘颜色来确定是否要喷水。若菌盖边缘、次边缘分别为米色、米黄色，则暂时不用喷水；若菌盖边缘为(浅)黄色，则应该喷水；若菌盖边缘的颜色为深黄色，则增加喷水频次。

6.灵芝孢子粉采集

当灵芝开始喷射孢子后，利用无纺布将子实体包住，要确保形成的内部空间满足灵芝的生长发育需求。

7.灵芝生长发育中后期菌棒的注水保湿

灵芝开始喷射孢子后，每周一次给菌棒注水：利用一次性注射器将25ml的水从菌棒的袋口附近注入菌棒内，以补充生长发育过程中消耗掉的水分，确保灵芝正常生长需要。

8.灵芝子实体和孢子粉的采收

前期的研究表明灵芝的采收时间同灵芝中的生物活性物质的含量有较强的相关性。所以，当孢子粉采集时间持续了1-1.5个月后，即可进行灵芝子实体和孢子粉的采收。

连续三年在同一地块上进行上述灵芝栽培，采集灵芝子实体和孢子粉。

表1同一地块不脱袋覆土栽培方式下连续3年栽培的表现

^*：每百千克栽培基质产生的孢子粉单产、子实体单产重量，单位均为：kg/100kg木材；

^#：数值均以均值±标准误表示。

从表1可以看出，在连续三年的不脱袋覆土栽培中，灵芝菌棒的出芝率、孢子粉单产、子实体单产没有出现极其显著的变化。这表明，不脱袋覆土栽培方法能够缓解甚至克服连作障碍效应。

实施例2

对实施例1中第一年采得的灵芝子实体进行三萜和多糖含量检测，其中三萜的检测方法见中华人民共和国药典(2015版)。

多糖的检测方法(苯酚-硫酸法)如下：

1.以葡萄糖为标准品，用苯酚-硫酸法测定总糖

①标准曲线的制作

取标准葡萄糖105℃烘干至恒重，配制成10.0mg/ml的葡萄糖标品母液，再稀释至50μg/ml，即为葡萄糖标准溶液。分别吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml标准葡萄糖溶液置于分析试管中，用蒸馏水补至1.0ml，再加入5％重蒸苯酚溶液0.5ml，混匀后迅速加入2.5ml浓硫酸，使用漩涡振荡器使反应液充分混合，然后将试管置于沸水浴中反应15min，水浴冷却至室温，测其490nm的吸光度值。以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制标准曲线。

②样品总糖含量测定

将已烘干的所有子实体进行粉碎，称取0.50～1.00g样品放入100.0ml容量瓶中，加入95.0ml蒸馏水，经沸水浴2h，静置至室温并定容至100.0ml，取上清0.5ml并加水补至1.0ml，加入5％苯酚溶液0.5ml，混匀后迅速加入2.5ml浓硫酸，使用漩涡振荡器使反应液充分混合，然后将试管置于沸水浴中反应15min，水浴冷却至室温，测其490nm处的吸光度值。依据标准曲线得到样品中总糖的重量(g)。

总糖含量(％)＝样品中总糖的重量*稀释倍数*100/样品的重量

2.以葡萄糖为标准品，用dns法测定还原糖。

①dns的制备：

甲液：溶解6.9g重蒸酚于15.2mlnaoh(10％)溶液中，并稀释至69.0ml，在此溶液中加入6.9g亚硫酸氢钠。

乙液：将255.0g酒石酸钾钠溶解于300.0mlnaoh(10％)溶液中，再加入880.0ml3,5-二硝基水杨酸(10％)。

将甲液和乙液混合即得黄色试剂，储存于棕色试剂瓶中，在室温下放置7天以后使用。

②样品还原糖含量的测定

量取上述的样品上清和葡萄糖标品溶液(50μg/ml)各1.0ml，分别置于25.0ml容量瓶中，各加入1.5mldns试剂，摇匀后置沸水浴中加热15min，迅速用凉水冷却。用蒸馏水分别定容至25.0ml，摇匀。同时以1.0ml蒸馏水按同样方法操作所得溶液作空白对照，在520nm处分别测得吸光度值。

还原糖含量(％)＝样品液的吸光度值*每ml对照品中所含糖的重量*稀释倍数*100/样品的重量/标准品吸光度值

3.样品中多糖的含量＝总糖含量-还原糖含量。

灵芝子实体三萜和多糖含量检测结果见如下表2，

表2实施例1中第一年得到的灵芝子实体中多糖和三萜含量*

*：数值均以均值±标准误表示。

实施例3hplc法检测灵芝醇提物：

具体方法见：贾红艳等，高效液相色谱法测定不同产地及品种灵芝三萜类成分的含量，微生物学通报，2017,44(1)：238-244.

从灵芝子实体的乙醇提取物的指纹图谱(图1)可以看出，第一年获得的灵芝中三萜类化合物含量高，与表2中关于灵芝中三萜含量的测量结果是一致的。

实施例4重金属含量和农药残留的检测

为检测灵芝中的重金属和农药残留情况，我们对第一年获得的灵芝子实体进行粉碎处理，沸水浴3小时，浓缩滤液，冻干，获得灵芝提取物干粉。委托sgs集团对样品进行重金属和农药残留检测。具体结果见表3、表4。

表3重金属残留检测结果

表4农药残留结果