本发明属于植物品种的组培快繁技术领域，更具体涉及一种恩施黄精品种复壮的组培快繁方法。
技术背景
黄精(polygonatumsibiricum)是百合科黄精属多年生的草本植物，黄精的化学成分主要有多糖、皂苷、蒽醌、黄酮、氨基酸及微量元素，黄精可食用，药用和观赏等。黄精性平，味甘，具有降血脂和抗动脉粥样化、调节免疫力、治疗糖尿病、防治肿瘤、增强记忆力、治疗抑郁症、抗病毒、抑制和降低葡萄糖苷酶的活性等方面的作用。湖北省恩施州，自然地理环境优越，属我国重要的中药材生产基地，素有“华中药库”和“世界硒都”之称，其出产的中药材有效成分含量高、品质佳且含有一定的天然硒.恩施是黄精生长的绝佳产区，其资源丰富。由于恩施黄精种植时间较长且种苗均采用块茎繁殖，其品种退化较为严重，使恩施黄精的产量及品质均有所下降。
然而茎尖生长点(约0.1～1.0mm区域)则几乎不含病毒。这是因为病毒只能通过胞间连丝传递，分生区域内无维管束。采用茎尖脱毒效果好，后代稳定，是培育无病毒苗的一个重要途径。
本发明通过黄精茎尖的组织培养得到了一种恩施黄精品种复壮的组培快繁技术，并确定了进行组织培养的几个培养基的最佳方案。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种恩施黄精品种复壮的组培快繁方法，该方法易行，操作简便，一是繁殖效率高，以无菌苗的茎尖为外植体，能有效地减少接种污染率，脱去植物体细胞内的病毒，成功率可达95％；二是条件可人工控制，通过茎尖直接诱导出芽，再诱导丛生芽增值，其增值倍数高，繁殖速度快，能高效培育优质的恩施黄精脱毒种苗。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种恩施黄精品种复壮的组培快繁方法，包括如下步骤：
(1)无菌苗的获得：取恩施黄精地下块茎，洗净后放于超净台上，用解剖刀将带芽眼的块茎切成方形小块；用酒精震荡冲洗黄精小块茎28-32s后转入0.1％的升汞溶液中消毒7～9min，然后用无菌水冲洗5～6次，再用吸水纸将消毒后黄精块茎中的水吸干，之后接种到组成为ms+6-ba3.0mg/l+naa0.2mg/l的培养基上，培养29-31天后从芽眼长出无菌苗；
(2)茎尖的培养：在解剖镜下切下步骤(1)所获得无菌苗的茎尖，接种到组成为1/2ms+6-ba0.5mg/l+0.7mg/lnaa的培养基上，培养24-26天后长出不定芽；
(3)不定芽的增值：将步骤(2)获得的不定芽转接入增殖培养基ms+6-ba4.0mg/l+naa0.2mg/l进行增殖培养，培养30-40天后获得长度为到3～5cm的增殖丛生芽；
(4)壮苗培养：将步骤(3)获得的增殖丛生芽切分成单株苗转接到ms基本培养基中培养30～40天；
(5)生根培养：将经过步骤(4)壮苗培养后的单株苗接种到生根培养基中进行生根培养20～30天，幼苗基部长出3～8条根，继续培养至50-60天，获得生根数多、根长、根壮的生根组培苗；
(6)移栽：将步骤(5)获得的生根组培苗移栽到基质中，在温室中培育1个月左右后，再移到室外培育1个月左右便可移栽至大田成苗。
其中，所述步骤(1)-(6)中各组培阶段的培养条件是：光照强度为40μmol.m-2.s-1，光照时间12h/d，其中培养基ph5.8-6.0，培养温度为20～21℃；蔗糖均为25g/l，琼脂为6.2g/l。
优选的，步骤(1)中所述洗净的过程为：首先将恩施黄精地下块茎上的泥土洗净，然后用洗洁精溶液浸泡8-12min，再用毛刷刷净并用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗2-4次即可。
优选的，步骤(1)中所述方形小块块茎的长度约0.5cm，所述酒精溶液的体积浓度为75％。
优选的，步骤(2)中切下的茎尖长度为0.4-0.6mm。
优选的，步骤(5)中所述的生根培养基为：1/2ms+1.0mg/l6-ba+0.4mg/lnaa。
优选的，步骤(6)中移栽前要对组培苗进行驯化，具体为：在组培室中将培养瓶盖第一天不全打开，第二天再全部打开，瓶中每天喷洒蒸馏水，驯化一周后再进行移栽。
优选的，步骤(6)中所述基质由草炭:蛭石按体积比1:3配制而成。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：
(1)本发明以黄精块茎为材料，用组培技术培养出无菌苗，再以无菌苗茎尖为外植体，快速脱毒，培养出优质的黄精；其中，关键步骤是脱毒和高效繁殖，以茎尖作为外植体达到脱毒目的；通过茎尖直接诱导出芽，跳过愈伤组织这一阶段，可以节省时间，达到高效快速繁殖的目的；
(2)本发明方法简单易行，操作简便，繁殖效率高。一是以无菌苗的茎尖为外植体，能有效地减少接种污染率，脱去植物体细胞内的病毒，成功率可达95％；二是培养条件可人工控制，通过茎尖直接诱导出芽，再诱导丛生芽增值，其增值倍数高，繁殖速度快，能高效培育出优质的恩施黄精脱毒种苗，适用于商业生产；第三，本发明方法得到的恩施黄精在产量及品质方面均有所提高，达到了品种复壮目的。
具体实施方式
下面结合实例说明本发明的具体实施方式。
实施例1
一种恩施黄精品种复壮的组培快繁方法，包括如下步骤：
(1)无菌苗的获得：取恩施黄精地下块茎，将恩施黄精地下块茎上的泥土洗净，然后用洗洁精溶液浸泡10min，再用毛刷刷净并用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗3次，洗净后放于超净台上，用解剖刀将带芽眼的块茎切成长度约0.5cm方形小块；用体积浓度为75％的酒精震荡冲洗黄精小块茎30s后转入0.1％的升汞溶液中消毒8min，然后用无菌水冲洗5次，再用吸水纸将消毒后黄精块茎中的水吸干，之后接种到组成为ms+6-ba3.0mg/l+naa0.2mg/l的培养基上，培养30天后从芽眼长出无菌苗；
(2)茎尖的培养：在解剖镜下切下步骤(1)所获得无菌苗的茎尖0.4-0.6mm，接种到组成为1/2ms+6-ba0.5mg/l+0.7mg/lnaa的培养基上，培养25天后长出不定芽；
(3)不定芽的增值：将步骤(2)获得的不定芽转接入增殖培养基ms+6-ba4.0mg/l+naa0.2mg/l进行增殖培养，培养35天后获得长度为到3～5cm的增殖丛生芽；
(4)壮苗培养：将步骤(3)获得的增殖丛生芽切分成单株苗转接到ms基本培养基中培养35天；
(5)生根培养：将经过步骤(4)壮苗培养后的单株苗接种到生根培养基中进行生根培养25天，幼苗基部长出3～8条根，继续培养至55天，获得生根数多、根长、根壮的生根组培苗；其中，所述的生根培养基为：1/2ms+1.0mg/l6-ba+0.4mg/lnaa；
(6)移栽：在组培室中将培养瓶盖第一天不全打开，第二天再全部打开，瓶中每天喷洒蒸馏水，驯化一周后将步骤(5)获得的生根组培苗移栽到基质中，在温室中培育1个月左右后，再移到室外培育1个月左右便可移栽至大田成苗；所述基质由草炭:蛭石按体积比1:3配制而成。
以上所述的各组培阶段的培养条件是：光照强度为40μmol.m-2.s-1，光照时间12h/d；其中，培养基ph5.8-6.0，培养温度为20或21℃，蔗糖均为25g/l，琼脂为6.2g/l。
病毒检测：对茎尖成苗的植株进行移栽后,随机抽取10株幼苗，用电子显微镜观察叶片的内部结构，未发现病毒粒子。
由本实施例的方法进行黄精品种的培育，比传统的方法快将近4个月，繁殖系数达到4倍，经过驯化炼苗后移栽，成活率达到90％以上。
实施例2
一种恩施黄精品种复壮的组培快繁方法，包括如下步骤：
(1)无菌苗的获得：取恩施黄精地下块茎，将恩施黄精地下块茎上的泥土洗净，然后用洗洁精溶液浸泡12min，再用毛刷刷净并用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗4次，洗净后放于超净台上，用解剖刀将带芽眼的块茎切成长度约0.5cm方形小块；用体积浓度为75％的酒精震荡冲洗黄精小块茎28s后转入0.1％的升汞溶液中消毒9min，然后用无菌水冲洗5次，再用吸水纸将消毒后黄精块茎中的水吸干，之后接种到组成为ms+6-ba3.0mg/l+naa0.2mg/l的培养基上，培养29天后从芽眼长出无菌苗；
(2)茎尖的培养：在解剖镜下切下步骤(1)所获得无菌苗的茎尖0.4-0.6mm，接种到组成为1/2ms+6-ba0.5mg/l+0.7mg/lnaa的培养基上，培养24天后长出不定芽；
(3)不定芽的增值：将步骤(2)获得的不定芽转接入增殖培养基ms+6-ba4.0mg/l+naa0.2mg/l进行增殖培养，培养36天后获得长度为到3～5cm的增殖丛生芽；
(4)壮苗培养：将步骤(3)获得的增殖丛生芽切分成单株苗转接到ms基本培养基中培养36天；
(5)生根培养：将经过步骤(4)壮苗培养后的单株苗接种到生根培养基中进行生根培养25天，幼苗基部长出3～8条根，继续培养至56天，获得生根数多、根长、根壮的生根组培苗；其中，所述的生根培养基为：1/2ms+1.0mg/l6-ba+0.4mg/lnaa；
(6)移栽：在组培室中将培养瓶盖第一天不全打开，第二天再全部打开，瓶中每天喷洒蒸馏水，驯化一周后将步骤(5)获得的生根组培苗移栽到基质中，在温室中培育1个月左右后，再移到室外培育1个月左右便可移栽至大田成苗；所述基质由草炭:蛭石按体积比1:3配制而成。
以上所述的各组培阶段的培养条件是：光照强度为40μmol.m-2.s-1，光照时间12h/d；其中，培养基ph5.8-6.0，培养温度为20或21℃，蔗糖均为25g/l，琼脂为6.2g/l。
病毒检测：对茎尖成苗的植株进行移栽后,随机抽取10株幼苗，用电子显微镜观察叶片的内部结构，未发现病毒粒子。
由本实施例的方法进行黄精品种的培育，比传统的方法快将近4个月，繁殖系数达到4倍，经过驯化炼苗后移栽，成活率达到90％以上。
实施例3
一种恩施黄精品种复壮的组培快繁方法，包括如下步骤：
(1)无菌苗的获得：取恩施黄精地下块茎，将恩施黄精地下块茎上的泥土洗净，然后用洗洁精溶液浸泡8min，再用毛刷刷净并用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗3次，洗净后放于超净台上，用解剖刀将带芽眼的块茎切成长度约0.5cm方形小块；用体积浓度为75％的酒精震荡冲洗黄精小块茎32s后转入0.1％的升汞溶液中消毒7min，然后用无菌水冲洗6次，再用吸水纸将消毒后黄精块茎中的水吸干，之后接种到组成为ms+6-ba3.0mg/l+naa0.2mg/l的培养基上，培养29天后从芽眼长出无菌苗；
(2)茎尖的培养：在解剖镜下切下步骤(1)所获得无菌苗的茎尖0.4-0.6mm，接种到组成为1/2ms+6-ba0.5mg/l+0.7mg/lnaa的培养基上，培养24天后长出不定芽；
(3)不定芽的增值：将步骤(2)获得的不定芽转接入增殖培养基ms+6-ba4.0mg/l+naa0.2mg/l进行增殖培养，培养32天后获得长度为到3～5cm的增殖丛生芽；
(4)壮苗培养：将步骤(3)获得的增殖丛生芽切分成单株苗转接到ms基本培养基中培养32天；
(5)生根培养：将经过步骤(4)壮苗培养后的单株苗接种到生根培养基中进行生根培养24天，幼苗基部长出3～8条根，继续培养至54天，获得生根数多、根长、根壮的生根组培苗；其中，所述的生根培养基为：1/2ms+1.0mg/l6-ba+0.4mg/lnaa；
(6)移栽：在组培室中将培养瓶盖第一天不全打开，第二天再全部打开，瓶中每天喷洒蒸馏水，驯化一周后将步骤(5)获得的生根组培苗移栽到基质中，在温室中培育1个月左右后，再移到室外培育1个月左右便可移栽至大田成苗；所述基质由草炭:蛭石按体积比1:3配制而成。
以上所述的各组培阶段的培养条件是：光照强度为40μmol.m-2.s-1，光照时间12h/d；其中，培养基ph5.8-6.0，培养温度为20或21℃，蔗糖均为25g/l，琼脂为6.2g/l。
病毒检测：对茎尖成苗的植株进行移栽后,随机抽取10株幼苗，用电子显微镜观察叶片的内部结构，未发现病毒粒子。
由本实施例的方法进行黄精品种的培育，比传统的方法快将近4个月，繁殖系数达到4倍，经过驯化炼苗后移栽，成活率达到90％以上。
实施例4
一种恩施黄精品种复壮的组培快繁方法，包括如下步骤：
(1)无菌苗的获得：取恩施黄精地下块茎，将恩施黄精地下块茎上的泥土洗净，然后用洗洁精溶液浸泡10min，再用毛刷刷净并用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗4次，洗净后放于超净台上，用解剖刀将带芽眼的块茎切成长度约0.5cm方形小块；用体积浓度为75％的酒精震荡冲洗黄精小块茎30s后转入0.1％的升汞溶液中消毒8min，然后用无菌水冲洗6次，再用吸水纸将消毒后黄精块茎中的水吸干，之后接种到组成为ms+6-ba3.0mg/l+naa0.2mg/l的培养基上，培养29天后从芽眼长出无菌苗；
(2)茎尖的培养：在解剖镜下切下步骤(1)所获得无菌苗的茎尖0.4-0.6mm，接种到组成为1/2ms+6-ba0.5mg/l+0.7mg/lnaa的培养基上，培养25天后长出不定芽；
(3)不定芽的增值：将步骤(2)获得的不定芽转接入增殖培养基ms+6-ba4.0mg/l+naa0.2mg/l进行增殖培养，培养32天后获得长度为到3～5cm的增殖丛生芽；
(4)壮苗培养：将步骤(3)获得的增殖丛生芽切分成单株苗转接到ms基本培养基中培养31天；
(5)生根培养：将经过步骤(4)壮苗培养后的单株苗接种到生根培养基中进行生根培养25天，幼苗基部长出3～8条根，继续培养至54天，获得生根数多、根长、根壮的生根组培苗；其中，所述的生根培养基为：1/2ms+1.0mg/l6-ba+0.4mg/lnaa；
(6)移栽：在组培室中将培养瓶盖第一天不全打开，第二天再全部打开，瓶中每天喷洒蒸馏水，驯化一周后将步骤(5)获得的生根组培苗移栽到基质中，在温室中培育1个月左右后，再移到室外培育1个月左右便可移栽至大田成苗；所述基质由草炭:蛭石按体积比1:3配制而成。
以上所述的各组培阶段的培养条件是：光照强度为40μmol.m-2.s-1，光照时间12h/d；其中，培养基ph5.8-6.0，培养温度为20或21℃，蔗糖均为25g/l，琼脂为6.2g/l。
病毒检测：对茎尖成苗的植株进行移栽后,随机抽取10株幼苗，用电子显微镜观察叶片的内部结构，未发现病毒粒子。
由本实施例的方法进行黄精品种的培育，比传统的方法快将近4个月，繁殖系数达到4倍，经过驯化炼苗后移栽，成活率达到90％以上。
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。