一种复合授粉系统选育甘蓝型油菜杂交种的方法与流程

本发明属于甘蓝型油菜育种技术领域，尤其涉及一种复合授粉系统选育甘蓝型油菜杂交种的方法。具体涉及一种复合甘蓝型油菜细胞质雄性不育和自交不亲和两种授粉系统选育杂交种的方法。

背景技术：

目前，业内常用的现有技术是这样的：

甘蓝型油菜杂种优势利用途径包括细胞质雄性不育(cms)、细胞核雄性不育(gms)、自交不亲和(si)和化学杀雄等。当前国内外利用最多的是甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育(polcms)和萝卜细胞质雄性不育(oguracms)，它们具有以下主要特点：(1)为核质互作不育，需同时具备细胞质不育基因和细胞核不育基因才表现出不育，杂交种须携带恢复基因才能正常结籽；(2)恢复源少，；(3)有限的恢复材料不断用作亲本，育成恢复系的遗传差异越来越小；(4)保持系和恢复系的选育周期长。

与甘蓝型油菜细胞质雄性不育杂种相比，甘蓝型油菜si杂种具有：(1)母本(si系)容易改良；(2)恢复源广，杂交种组配自由；(3)具有“两系”杂种和“三系”杂种选育模式；(4)si系可以是cms的保持系或恢复系，cms的保持系或恢复系可以是si的恢复系(马朝芝等，华中农业大学学报，2003，22(1):13-17)，。因而在甘蓝型油菜si系中可以筛选到cms杂种的恢复系，同样地，在cms的保持系或恢复系中，可以筛选到si的恢复系。整合和利用授粉系统间的育种资源，不但可以促进育种家交换材料、协力选育杂交种，而且由于地理、资源和材料的差异，选育出的杂交种会更具有优势。当前利用甘蓝型油菜细胞质雄性不育或甘蓝型油菜自交亲和选育杂交种的程序通常为，首先分别选育不育系和恢复系，然后不育系与恢复系配置杂交种，最后筛选杂交种。我们提出一种复合甘蓝型油菜细胞质雄性不育和自交不亲和两种授粉系统选育杂交种的方法，整合两种授粉系统间的育种资源，先一次配置多个杂交种、筛选杂交种，再依照父本特性或杂种亲和性，获得以cms恢复系/保持系作父本的si两系杂种、以cms恢复系/保持系为亲本之一的si三系杂种、以si系为恢复系的细胞质雄性不育三系杂种、以si系为亲本之一的细胞质雄性不育双交杂种。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)现有技术没有关于整合甘蓝型油菜系统授粉来选育杂交种的方法。

现有技术在父、母本改良过程中，有限的携带不育或恢复基因的资源反复被用作亲本，同时，育种家在分离后代进行个体选择时，往往具有倾向性，育成母本间、父本间，以及父本与母本间遗传差异小的缺陷，因而增加育成强优势杂交种的难度。

现有技术选育出的细胞质雄性不育杂交种存在保持系和恢复系的选育周期长等缺陷。

现有技术利用细胞质雄性不育授粉系统选育杂交种时，需要选育同核异质的保持系以繁殖不育系、需要选育恢复系将不育性完全恢复为可育，育种程序复杂、育种效率低。

(2)现有技术的自交不亲和系可以是细胞质雄性不育的保持系或恢复系，细胞质雄性不育的保持系或恢复系可以是自交不亲和的恢复系，但是没有得以利用，油菜资源利用效率低。

(3)现有技术利用甘蓝型油菜细胞质雄性不育或甘蓝型油菜自交亲和选育杂交种的程序通常为，首先分别选育不育系、恢复系，然后不育系与恢复系配置杂交种，最后筛选杂交种，盲目性大、难以获得强优势杂交种。

解决上述技术问题的难度：

甘蓝型油菜杂种优势利用途径多，包括细胞质雄性不育、细胞核雄性不育、自交不亲和和化学杀雄等，各有优缺点。甘蓝型油菜细胞核雄性不育具有育性存在分离，自交不亲和具有表型不能直观鉴别和繁殖不育系易受外来花粉污染等，化学杀雄途径存在污染环境和生产出的杂交种纯度不高等缺点。

当前最被广泛利用的是甘蓝型油菜细胞质雄性不育(国内为polcms、国外为oguracms)。polcms和oguracms为核质互作的雄性不育，即需同时具备细胞质不育基因和细胞核不育基因才表现出不育，其中polcms为自然突变、oguracms是人为将萝卜细胞质转入甘蓝型油菜创建而成。polcms恢复源来自于甘蓝型油菜起源中心的地中海附近，在天然甘蓝型油菜中没有oguracms恢复基因，在萝卜中找到oguracms恢复源、再转入甘蓝型油菜，极其有限的恢复源作为亲本育成的polcms或oguracms恢复系遗传差异小。polcms和oguracms仍然存在恢复源少、保持系和恢复系的选育周期长等缺点，育成母本间、父本间，以及父本与母本间遗传差异小。

解决上述技术问题的意义：

本发明提供的一种复合授粉系统选育甘蓝型油菜杂交种的方法，整合甘蓝型油菜波里马/萝卜细胞质雄性不育和自交不亲和两个授粉系统，成功地选育出以cms恢复系/保持系作父本的si两系杂种、以cms恢复系/保持系为亲本之一的si三系杂种、以si系为恢复系的细胞质雄性不育三系杂种、以si系为亲本之一的细胞质雄性不育双交杂种，创建了油菜杂种优势的多途径利用，将整合育种资源、提高育种效率、缩短育种周期，促进强优势杂交种的选育。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种复合授粉系统选育甘蓝型油菜杂交种的方法。

本发明是这样实现的，一种复合授粉系统选育甘蓝型油菜杂交种的方法包括：si两系杂种(si系×cms保持系/恢复系)的选育、si三系杂种{(si系×cms保持系/恢复系)×si恢复系}的选育、细胞质雄性不育三系杂种{(cms系×保持系)×si系}的选育、细胞质雄性不育双交杂种{(cms系×保持系)×(si系×cms恢复系)}的选育。

进一步，所述复合授粉系统选育甘蓝型油菜杂交种的方法具体步骤包括：

步骤一：在人工隔离区以多个si系作母本、cms保持系/恢复系作父本配置si×cms保持系/恢复系f1；筛选f1；鉴定f1的自交亲和性，若f1自交亲和，则f1为si两系杂种：si系×cms保持系/恢复系；

步骤二：以步骤一自交不亲和的f1为母本、与si恢复系作父本配置杂交种，获得si三系杂种：(si系×cms保持系/恢复系)×si恢复系；

步骤三：配置步骤一si×cms保持系f1的反交f1：si系作父本、与cms保持系对应的同核异质cms系作母本的cms系×sif1；调查cms系×si的育性，可育的cms系×si即为细胞质雄性不育三系杂种：(cms系×保持系)×si系；

步骤四：以步骤一自交不亲和的si×cms恢复系f1作父本，与cms系配置杂交种，获得细胞质雄性不育双交杂种:(cms系×保持系)×(si系×cms恢复系)。

进一步，步骤一中，优良f1在人工隔离区以多个si系作母本、cms保持系/恢复系作父本配置而成。

进一步，步骤三中，配置优良f1的反交f1中，si系作父本、与cms保持系对应的同核异质cms系作母本的cms系×sif1。

进一步，步骤四中的细胞质雄性不育双交杂种，父本为自交不亲和的si×cms恢复系f1。

进一步，选育的甘蓝型油菜杂交种包括以cms恢复系/保持系作父本的si两系杂种、以cms恢复系/保持系为亲本之一的si三系杂种、以si系为恢复系的细胞质雄性不育三系杂种、以si系为亲本之一的细胞质雄性不育双交杂种。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明整合甘蓝型油菜波里马/萝卜细胞质雄性不育授粉系统与自交不亲和授粉系统，创建了油菜杂种优势的多途径利用，成功地选育出以si系为恢复系的cms三系杂种、以si系为亲本之一的cms双交杂种、以cms恢复系/保持系作父本的si两系杂种，以及以cms恢复系/保持系为亲本之一的si三系杂种。

本发明中以多个si为母本，与cms恢复系/保持系杂交，一次可以获得若干f1，杂交种组配效率高。本发明首先一次配置多个杂交种、筛选杂交种，克服了现有技术利用甘蓝型油菜细胞质雄性不育或甘蓝型油菜自交亲和选育杂交种时首先分别选育不育系和恢复系、然后不育系与恢复系配置杂交种、最后筛选杂交种，因而盲目性大、效率低的缺陷。

本发明选育出的杂交种同时含有甘蓝型油菜波里马/萝卜细胞质雄性不育的资源和甘蓝型油菜自交不亲和系统的资源，杂种亲本间的遗传差异得以扩大，易得到强优势杂交种。本发明选育出的杂交种，可以是cms三系杂种和cms双交杂种，也可以是si三系杂种和si两系杂种，杂种选育模式灵活。本发明有利于合作，育种单位利用地理远缘、差异明显和变异丰富的资源选育杂交种，杂种优势会更强。

另外，本发明的cms三系杂种和cms双交杂种，父本都自交不亲和，可以与母本混种混收配置杂交种，降低种子生产成本；自交不亲和材料作父本，比作母本用种量少，克服了繁殖si系易受外来花粉污染的问题。本发明提供了一种甘蓝型油菜杂种优势多途径利用的模式，将整合育种资源、提高育种效率、缩短育种周期，促进强优势杂交种的选育。

附图说明

图1是本发明实施例提供的复合授粉系统选育甘蓝型油菜杂交种的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的复合授粉系统选育甘蓝型油菜杂交种的方法原理图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

现有技术没有关于整合甘蓝型油菜系统授粉来选育杂交种的方法。

现有技术在父、母本改良过程中，有限的携带不育或恢复基因的资源反复被用作亲本，同时，育种家在分离后代进行个体选择时，往往具有倾向性，育成母本间、父本间，以及父本与母本间遗传差异小的缺陷，因而增加育成强优势杂交种的难度。

现有技术选育出的细胞质雄性不育杂交种存在潜在的细胞质负效应、保持系和恢复系的选育周期长等缺陷。

现有技术利用细胞质雄性不育授粉系统选育杂交种时，需要选育同核异质的保持系以繁殖不育系、需要选育恢复系将不育性完全恢复为可育，保持系和恢复系的选育周期长，因而育种程序复杂、育种效率低。

为解决上述技术问题，下面结合具体方案对本发明作详细描述。

如图1所示，本发明实施例提供的复合授粉系统选育甘蓝型油菜杂交种的方法包括：

s101:在人工隔离区以多个si系作母本、cms保持系/恢复系作父本配置si×cms保持系/恢复系f1；筛选符合育种目标性状的f1；鉴定f1的自交亲和性，若f1自交亲和，则f1为si两系杂种：si系×cms保持系/恢复系。

s102:以步骤s101自交不亲和的f1为母本、与si恢复系作父本配置杂交种，获得si三系杂种：(si系×cms保持系/恢复系)×si恢复系。

s103:配置步骤s101si×cms保持系f1的反交f1：si系作父本、与cms保持系对应的同核异质cms系作母本的cms系×sif1；调查cms系×si的育性，可育的cms系×si即为细胞质雄性不育三系杂种：(cms系×保持系)×si系。

s104:以步骤s101自交不亲和的si×cms恢复系f1作父本，与cms系配置杂交种，获得细胞质雄性不育双交杂种:(cms系×保持系)×(si系×cms恢复系)。

在本发明实施例中，图2是本发明提供的复合授粉系统选育甘蓝型油菜杂交种的方法原理。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

1)、甘蓝型油菜si系与polcms保持系“1141b”f1的获得：

2010年9月在人工隔离棚，种植自交不亲和系“s-40”、“s-1300”、“s-1310”和“s-1320”(马朝芝等，1998，华中农业大学学报，3(1)：211-213)，和cms保持系“1141b”(“华油杂4号”的保持系，“华油杂4号”是由华中农业大学育成的pol细胞质雄性不育双低油菜品种，1998年通过湖北省农作物品种审定委员会审定)。以4个si系作母本、“1141b”作父本，父母本行比为4:2。隔离棚规格为：3m宽×7m长×3m高，隔离棚中间为走道，走道两边和隔离棚的左、右外侧行都是父本，剩余空间均分为4块，以1行父本为边界隔开，分别种植“s-40”、“s-1300”、“s-1310”和“s-1320”。

2011年春天油菜开花期，摘除已经开放花朵，套尼龙网帐以防止外来花粉污染，在棚内放置蜜蜂以辅助授粉。油菜终花后，拔除父本植株。角果成熟期，分别收获自交不亲和系植株的种子，得到s-40×1141b、s-1300×1141b、s-1310×1141b和s-1320×1141b4种f1种子。

2)、优良f1的筛选：

2011年秋天，在华中农业大学校内农场布置杂种的品种比较试验，完全随机区组试验设计，3重复，小区5长行，每行定苗25株。2012年春天，得到4个品种的产量结果，s-1300×1141b产量最高、其次为s-40×1141b、s-1310×1141b和s-1320×1141b(表1)。

表1品种田间试验小区产量结果(单位：公斤)

3)、自交不亲和两系杂种s-1300×1141b的获得：

田间自交不亲和表型调查(调查方法详见李春艳等，作物学报，1997，33(9):1452-1457)结果表明，s-1300×1141b为自交亲和。由于喷施盐水的方法(详见专利“一种繁殖甘蓝型油菜自交不亲和系的方法，zl200810236719.x”)繁殖母本s-1300，s-1300×1141b为自交不亲和两系杂种。

4)、1141a×s-1300f1的获得：

由于不育系1141a与保持系1141b同核异质，因而自交不亲和两系杂种s-1300×1141b等同于1300×1141a，但是1141a为不育，将其作为母本配置组合1141a×s-1300。

2012年秋天，种植“1141a”和“s-1300”，“1141a”为母本、“s-1300”为父本，父、母本行比为3:1，两端的边行为父本，母本共30行，每行约15株。

2013年春天，用钢管搭框架、钢架上套尼龙网帐以隔离外来花粉，在棚内放置蜜蜂以辅助授粉。油菜终花后，拔除父本植株。角果成熟期，收获种子。

5)、pol细胞质雄性不育三系杂种的获得：

2013年5月，将1141a×s-1300f1种子种植在甘肃和政县，5行，共43株。7月下旬调查植株的育性，全部植株为可育。不育系1141a需要保持系1141b来繁殖，1141a×s-1300f1实际是pol细胞质雄性不育三系杂种(1141a×1141b)×s-1300。

实施例2

1)、甘蓝型油菜si系与polcms恢复系“恢5200”f1的获得：

2010年9月在人工隔离区，种植自交不亲和系“s-40”、“s-1300”、“s-1310”和“s-1320”(马朝芝等，1998，华中农业大学学报，3(1)：211-213)，和cms恢复系“恢5200”。“恢5200”是“华油杂4号”的恢复系，“华油杂4号”由华中农业大学选育，于1998年通过湖北省农作物品种审定委员会审定。以4个si系作母本、“恢5200”作父本，父母本行比为4:2。隔离区规格为：3m宽×7m长×3m高，隔离棚中间为走道，走道两边和隔离棚的左、右外侧行都是父本，剩余空间均分为4块，以1行父本为边界隔开，分别种植“s-40”、“s-1300”、“s-1310”和“s-1320”。

2011年春天油菜开花期，摘除已经开放花朵，用尼龙网帐套着父母本以隔离外来花粉污染，在棚内放置蜜蜂以辅助授粉。油菜终花后，拔除父本植株。角果成熟期，分别收获自交不亲和系植株的种子，得到s-40×恢5200、s-1300×恢5200、s-1310×恢5200和s-1320×恢52004种f1种子。

2)、优良f1的筛选：

2011年秋天，在华中农业大学校内农场布置杂种的品种比较试验，完全随机区组试验设计，3重复，小区5长行，每行定苗25株。2012年春天，得到4个品种的产量结果，s-1300×恢5200产量最高、其次为s-40×恢5200、s-1320×恢5200和s-1310×恢5200(表1)。

3)、自交不亲和两系杂种s-1300×恢5200的获得：

田间自交不亲和表型调查(调查方法详见李春艳等，作物学报，1997，33(9):1452-1457)结果表明，s-1300×恢5200为自交亲和，得到自交不亲和两系杂种s-1300×恢5200。

实施例3

1)、甘蓝型油菜si系与polcms恢复系“丙409”f1的获得：

2013年9月在人工隔离区，种植自交不亲和系“s-1300”、“s-32”、“s-29”和“s-34”，cms恢复系“丙409”。其中，“s-1300”、“s-32”、“s-29”和“s-34”分别于2010年、2012年、2015年和2015年通过湖北省农作物品种审定委员会组织的专家鉴定，“丙409”为pol细胞质雄性不育杂交种“华油杂62”(国审油2011021)的父本。四个si系“s-1300”、“s-32”、“s-29”和“s-34”为母本，“丙409”为父本；父母本相间种植，行比为4:2。隔离区规格为：3m宽×7m长×3m高，隔离区中间为走道，走道两边和隔离棚的左、右外侧行都是父本，剩余空间均分为4块，以1行父本为边界隔开，分别种植“s-1300”、“s-32”、“s-29”和“s-34”。

2014年春天油菜开花期，摘除已经开放花朵，用尼龙网帐套住父母本以隔离外来花粉污染，在棚内放置蜜蜂以辅助授粉。油菜终花后，拔除父本植株。角果成熟期，分别收获自交不亲和系植株的种子，得到s-1300×丙409、s-32×丙409、s-29×丙409和s-34×丙409的种子。

2)、优良f1的筛选：

2014秋天，在武汉、荆州和鄂州三个试验点布置品种比较试验，完全随机区组试验设计，3重复，小区面积0.02亩，田间管理同大田生产。2015年春天，分小区收获、脱离、晒干，再称重，得到各品种的产量结果(表2)。产量第一位的杂交种为s-34×丙409。

表2四个杂交种三点试验的小区产量结果(单位：公斤)

3)、自交不亲和三系杂种“(s-34×丙409)×浙油18”的获得：

2015年春天，对大田生长的s-34×丙409f1植株进行套袋自交，调查10株的自交亲和表型(调查方法详见李春艳等，作物学报，1997，33(9):1452-1457)结果表明，s-34×丙409的10株的亲和指数均低于1，说明s-34×丙409为自交不亲和。2015年9月在人工隔离区，种植s-34×丙409f1与“浙油18”(浙审油2006001)。s-34×丙409f1植株为母本，“浙油18”为父本。

2016年春天，油菜开花期，摘除已经开放花朵，用尼龙网帐套住父母本以隔离外来花粉污染，在棚内放置蜜蜂以辅助授粉。油菜终花后，拔除父本植株。角果成熟期，分别收获自交不亲和系植株的种子，在隔离区以s-34×丙409f1植株为母本，与“浙油18”授粉，得到杂种种子。(s-34×丙409)×浙油18为自交不亲和三系杂种。

4)、pol细胞质雄性不育双交杂种“(1141a×1141b)×(s-34×丙409)”的获得：

2015年9月育苗“1141a”与s-34×丙409f1。不育系“1141a”为pol细胞质雄性不育三系杂种“华油杂4号”(1998年通过湖北省农作物品种审定委员会审定)的母本，其同核异质保持系为“1141b”。约一个月后，苗长至6-7叶，移栽入人工隔离区，以polcms不育系“1141a”为母本、s-34×丙409f1为父本“1141b”，父母本行比为4:2。

2016年春天，油菜开花期，摘除已经开放花朵，用尼龙网帐套住父母本以隔离外来花粉污染，在棚内放置蜜蜂以辅助授粉。油菜终花后，拔除父本植株。角果成熟期，收获不育系“1141a”植株的种子，由于不育系由其同核异质保持系“1141b”繁殖，收获的不育系“1141a”植株种子为pol细胞质雄性不育双交杂种“(1141a×1141b)×(s-34×丙409)”，丙409为pol细胞质雄性不育恢复系，杂种可育。

本发明实施例中自交不亲和系“s-1300”、“s-32”、“s-29”和“s-34”，分别于2010年、2012年、2015年和2015年通过湖北省农作物品种审定委员会组织的专家鉴定。越冬前期，“s-1300”裂叶多、深，叶片匍匐地面；“s-32”叶色长形，浅黄，半直立；“s-29”裂叶多、深，叶片半匍匐，叶色深；“s-34”叶片卵圆形、顶叶宽大，深绿、半直立。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。