在藻类中过量产生血红素的方法及由此而来的组合物与流程

背景技术：

随着工业化动物农业的出现，动物肉的消费量持续增加。占迄今为止产生的温室气体的18％以上，动物农业是导致气候变化的主要原因之一。除土地使用外，动物农业还需要大量的淡水，这种资源越来越难以获取。据估计，产生一磅牛肉需要1799加仑的淡水，以及产生一磅猪肉需要576加仑的水。将其与产生1磅大豆需要216加仑的淡水或产生1磅玉米需要108加仑进行比较。产生动物肉所需的淡水强度是动物消耗的植物生长所需的水和动物将其消耗的食物转化为实际肉类的低效率的结果。

为了解决动物肉消费的可持续性和伦理问题，食品工业一直在积极地尝试开发与肉制品一样的味道、触感和气味的基于植物的替代品。然而，目前许多基于植物的替代品尚未能够渗透到更大的食品和消费市场。通常，这些替代品由基于植物的材料组成，所述材料被挤压出以产生结实的质地以改善口感并随后与各种调料和香气混合形成化合物以改善这些产品的味道和气味。不幸的是，这些替代品在很大程度上吸引了已经致力于素食/素食生活方式的消费者，而不是那些习惯于吃肉的消费者。为了提高食品生态系统的可持续性，必须开发出吸引目前更喜欢肉的消费者的产品。通过产生下一代植物产品，可以大大减少动物农业产生的温室气体的贡献和水需求。

最近的进展证明了使用从宿主生物中纯化的含血红素的蛋白质以使产品的味道和香气特征更接近于肉的味道和香气特征的潜力。据认为，来自含血红素的蛋白质的血红素负责赋予肉制品“肉的”的味道和香气。然而，含血红素的蛋白质的可用来源昂贵且技术上集中，限制了它们的效用。例如，已经从大豆根中提取了血红素结合蛋白、豆血红蛋白，但是这种方法证明是昂贵的，使得将它掺入肉替代品中经济上不太可行。酵母，毕赤酵母(pichiapastoris)已经被设计成表达血红素结合蛋白，例如具有用于产生血红素分子的另外8种酶途径。该方法仍然需要在将其掺入成品之前，将血红素结合蛋白从表达宿主中纯化出来，该方法由于经济限制而限制了潜在积极影响。除了经济效益差外，该产品还经过基因改造，使其对许多消费者不太有吸引力，因为这些消费者选择食用不是基因工程的食物。

技术实现要素：

为了解决与将血红素掺入到产品中的当前方法相关的经济和消费者问题，本文提供了组合物和用于从过量产生血红素的藻类产生此类组合物的方法。血红素过量产生的藻类可以在没有昂贵的纯化方法的情况下掺入成品中。

本文还提供了生长血红素过量产生的藻类的方法、从藻类培养物分离含血红素部分的方法以及用藻类产生的血红素制备食品的组合物和方法。本文提供了株系和选择过量产生血红素的株系的方法。

还提供了组合物，包括含有由藻类产生的血红素的可食用组合物。在一些实施方案中，所述组合物适合作为食物配料，并且包括来自过表达(即过量产生)血红素的藻类株系的制剂。在一些实施方案中，制剂是来自藻类株系的生物质。在一些实施方案中，制剂是来自藻类株系的经分层(fractionated)的生物质。在一些实施方案中，经分层的生物质是富含血红素的组分(fraction)。在一些实施方案中，富含血红素的组分也富含蛋白质。在一些实施方案中，来自过表达血红素的藻类株系的制剂是藻类培养物的细胞外组分。在一些制剂的实施方案中，将制剂从蛋白质中纯化。

在一些实施方案中，来自过表达血红素的藻类株系的制剂赋予组合物红色或类似于红色的颜色。在一些实施方案中，制剂赋予组合物肉或类似肉的味道。在一些实施方案中，制剂赋予组合物肉或类似肉的质地。在一些实施方案中，该组合物用作食品中的配料。在一些实施方案中，食品是清洁的肉、经培养的肉、合成肉，基于植物的肉或基于非动物细胞的肉。

在一些实施方案中，用于制剂的藻类是衣藻(chlamydomonas)种。

本文还提供了产生血红素组合物的方法。在一些实施方案中，该方法包括使藻类培养物生长，其中藻类是血红素过量产生者，并从培养物中分离血红素组合物。在一些实施方案中，藻类通过需氧发酵生长。在一些实施方案中，该方法中使用的藻类含有叶绿体。在一些实施方案中，血红素生物合成发生在叶绿体中。

在本文提供的方法和组合物的一些实施方案中，藻类缺乏产生叶绿素的能力。在一些实施方案中，藻类缺乏产生功能性mg-螯合酶的能力。在一些实施方案中，藻类缺乏功能性chld1、chld2或chldh基因产物。在一些实施方案中，藻类缺乏功能性光依赖性原叶绿素酸酯。在一些实施方案中，藻类缺乏功能性光非依赖性原叶绿素酸酯。在一些实施方案中，藻类缺乏功能性chlb、chll或chln基因产物。

在本文提供的方法和组合物的一些实施方案中，藻类过表达选自由以下项组成的组的基因：谷氨酰-trna还原酶、谷氨酰-1-半醛转氨酶、ala脱氢酶、胆色素原脱氨酶、upgiii合酶、upgiii脱羧酶、cpg氧化酶、ppg氧化酶和亚铁螯合酶。

在一些实施方案中，本文的方法和组合物中使用的藻类通过交配(mating)产生，并且其中衍生的株系是红色或类似于红色的颜色。在一些实施方案中，通过诱变产生藻类。在一些实施方案中，交配或诱变产生红色或类似于红色的颜色的藻类，其用于组合物和产生组合物的方法。

在产生血红素组合物的方法的一些实施方案中，血红素作为藻类生物质的一部分被分离。在一些实施方案中，血红素包含在经分层的藻类生物质中。在一些实施方案中，经分层的生物质也富含蛋白质。在一些实施方案中，含血红素的组合物从藻类培养物的细胞外培养基中分离。在一些实施方案中，该方法包括将血红素组合物与藻类蛋白质分离。在一些实施方案中，组合物由缺乏类胡萝卜素的藻类产生。

在用于产生血红素组合物的方法的一些实施方案中，藻类是衣藻(chlamydomonas)种。在一些实施方案中，该藻类是莱茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)。

在本文方法的一些实施方案中，用于该方法的血红素过表达藻类株系是通过将相同条件下在黑暗中比野生型藻类生长得更快的株系与已经表现出红色或类似于红色的颜色的株系交配而获得。在一些实施方案中，血红素过量产生者藻类是通过将缺乏类胡萝卜素的株系与表现出红色或类似于红色的颜色的株系交配而产生的株系。在一些实施方案中，通过诱变第一起始株系并选择在黑暗中比第一起始株系生长更快的第二株系来产生血红素过量产生者藻类。在一些实施方案中，通过诱变第一起始株系并选择缺乏一种或更多种类胡萝卜素的第二株系来产生血红素过量产生者藻类。

本文的方法可用于提供血红素组合物，其用作食品或食物配料。在一些实施方案中，血红素组合物赋予产品或其一部分红色或类似于红色的颜色。在一些实施方案中，血红素组合物赋予产品或其一部分肉或类似肉的味道。在一些实施方案中，血红素组合物赋予产品或其一部分肉或类似肉的质地。本文的方法还可用于提供经分离的血红素(诸如通过从藻类中纯化)。在一些实施方案中，产生的组合物包括使用缺乏类胡萝卜素的藻类。

本文还提供了产生含血红素的组合物的方法，其包括以下步骤：(a)在黑暗条件下培养藻类株系，其中，所述培养在黑暗中进行，其中所述株系不产生叶绿素或者减少叶绿素的产生，和(b)收集藻类培养物的一部分。在该方法的一些实施方案中，藻类是衣藻(chlamydomonas)种。在一些实施方案中，藻类是莱茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)。在该方法的一些实施方案中，藻类的原卟啉原ix增加。在一些实施方案中，当在黑暗条件下生长时，藻类表现出红色或类似于红色的颜色。在一些实施方案中，藻类株系缺乏一种或更多种选自由以下项组成的组的功能性基因产物：chld、chld2、ch1h、光活化的原叶绿素酸酯氧化还原酶和不依赖光的原叶绿素酸酯基因产物。

在用于产生含血红素的组合物的方法的一些实施方案中，与野生型藻类株系相比，所述藻类株系的亚铁螯合酶表达增加。在一些实施方案中，藻类株系具有增加量的血红素、含血红素的蛋白质、原卟啉原ix、胆绿素ix、植物色素(photochromobilin)、亚铁螯合酶或其组合。在一些实施方案中，藻类株系缺乏镁螯合酶、镁原卟啉原ix、原叶绿素酸酯、叶绿素酸酯和叶绿素中的一种或更多种。

在用于产生含血红素的组合物的方法的一些实施方案中，藻类通过需氧发酵生长。在一些实施方案中，藻类生长至密度大于约10g/l、约20g/l、约30g/l、约40g/l、约50g/l、约75g/l、约100g/l、约125g/l或约150g/升。在一些实施方案中，用乙酸盐作为还原性碳源(reducedcarbonsource)使藻类生长。在一些实施方案中，用糖作为还原性碳源使藻类生长。在一些实施方案中，在培养步骤期间藻类培养物补充有铁。在一些实施方案中，藻类培养物以大于约0.1g/l、约1.0g/l、约5.0g/l、约10g/l、约20g/l、约50g/l、约80g/l，或约100g/l的密度接种。

在一些实施方案中，藻类培养物的经收集的部分表现出红色或类似于红色的颜色。在一些实施方案中，经收集的部分是来自藻类培养物的细胞外培养基。在一些实施方案中，经收集的部分是来自藻类培养物的生物质或经分层的生物质。在一些实施方案中，对经收集的部分进行分层从该部分中除去基本上所有或大部分类胡萝卜素。在一些实施方案中，对经收集的部分进行分层从该部分中除去基本上全部或大部分的淀粉。在一些实施方案中，对经收集的部分进行分层产生富含蛋白质的组分。在一些实施方案中，经收集的部分是富含血红素的组分或经纯化的血红素。

在所述方法的一些实施方案中，产生清洁的肉制品，并且该方法进一步包括将经收集的部分与清洁的肉制造组合物组合，其中经收集的部分为清洁的肉制品提供红色或类似于红色的颜色。

在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物包括重组藻类。在其他实施方案中，本文提供的方法和组合物不包括重组藻类，并且藻类株系不是转基因株系。

附图说明

图1是显示用于在藻类中产生血红素的示例性途径的示意图。该示例性途径可以用于通过野生型藻类产生叶绿素，但它同样可以用于产生血红素。

图2是显示过表达血红素的藻类的示例性分层的示意图，其显示分离成蛋白质和富含血红素的生物质，其分离自淀粉和类胡萝卜素组分。

图3是显示当在需氧发酵条件下生长时过量产生血红素的株系的示例性生长曲线(干细胞重量)的图解。

具体实施方式

本文提供了将自然选择、生长并将过表达分子血红素的藻类掺入基于植物的替代食物中的方法。已知藻类产生许多化合物，其使得这些水生生物具有各种颜色。这些化合物包括但不限于使藻类变绿的叶绿素、使藻类呈现黄色或橙色的β-胡萝卜素、使藻类呈现红色的虾青素或诸如使藻类变蓝的花青素的其它各种色素。尽管这些先前提到的化合物中的每一种都已添加到食品中，但迄今为止还没有掺入藻类过量产生血红素的产品以赋予红色和/或肉的味道和气味。

本文提供了使用过量产生血红素的藻类的株系、方法和组合物。在一些实施方案中，藻类株系在生长时是红色或类似于红色的颜色。在一些实施方案中，由过量产生血红素的藻类培养物制备的制剂在掺入食物和其他可食用产品中时赋予粉红色或红色。在一些实施方案中，由过量产生的血红素的藻类培养物制备的制剂在掺入食品和其他可食用产品中时赋予“肉的”味道、气味和/或质地。

不受理论束缚，如图1所示，血红素途径是从叶绿素生化途径分支的生化途径。简而言之，该途径以谷氨酸trna开始，其通过glutrna还原酶和gsa氨基转移酶转化为5-氨基乙酰丙酸(ala)。接下来，通过ala脱水酶将ala转化为胆色素原。接下来，通过胆色素原脱氨酶将胆色素原转化为羟甲基胆素。接下来，通过upgiii合酶将羟甲基胆素转化为尿卟啉原iii。接下来，通过upgiii脱羧酶将尿卟啉原iii转化为粪卟啉原(coprophyrinogen)。接下来，通过cpg氧化酶将粪卟啉原转化为原卟啉原ix。接下来，通过ppg氧化酶将原卟啉原ix转化为原卟啉ix。原卟啉ix可以穿梭到氯醛生成途径或朝向血红素b。最后，通过将铁连接到原卟啉ix上的亚铁螯合酶将原卟啉ix被转化为血红素b。

通过减少朝向叶绿素的代谢流量，可以增加朝向血红素b的代谢流量。在本文的一些实施方案中，在方法和产生的组合物中使用的藻类株系的朝向叶绿素的代谢流量减少并且朝向血红素b的代谢流量增加。在一些实施方案中，藻类株系是叶绿素和类胡萝卜素合成减少并且血红素合成或积累增加的藻类株系。在一些实施方案中，藻类株系的叶绿素量缺乏或减少。在一些实施方案中，藻类株系为红色或类似于红色的颜色。

在一些实施方案中，藻类株系缺乏叶绿素生物合成途径中的一种或更多种酶。这些缺陷包括但不限于导致酶缺乏表达或酶功能性缺陷的基因缺失、突变和其他改变。在一些实施方案中，藻类株系缺乏镁螯合酶，其是将原卟啉ix转化为叶绿素的第一步。在一些实施方案中，藻类株系缺乏光依赖性原叶绿素酸酯，其将原叶绿素酸酯转化为叶绿素。在一些实施方案中，藻类株系缺乏光非依赖性原叶绿素酸酯，其在黑暗中将原叶绿素酸酯转化为叶绿素。在一些实施方案中，藻类株系缺乏chlb、chll或chln基因产物中的一种或更多种。在一些实施方案中，藻类株系缺乏或减少镁螯合酶、镁原卟啉原ix、原叶绿素酸酯、叶绿素酸酯和叶绿素中的一种或更多种。在一些实施方案中，藻类株系缺乏chld1、chld2和ch1h基因产物中的一种或更多种。

在一些实施方案中，藻类株系过表达一种或更多种酶，使得途径的平衡有利于血红素产生。在一些实施方案中，藻类株系过表达谷氨酰-trna还原酶、谷氨酰-1-半醛氨基转移酶、ala脱氢酶、胆色素原脱氨酶、upgiii合酶，upgiii脱羧酶、cpg氧化酶、ppg氧化酶和亚铁螯合酶中的一种或更多种。在一些实施方案中，改善了藻类株系产生ala的能力，所述ala是血红素b合成的限速前体。在一些实施方案中，改善了藻类株系产生功能性亚铁螯合酶基因的能力，该酶负责原卟啉ix向血红素b的转化。在一些实施方案中，改善了藻类株系产生upgiii合酶、upgiii脱羧酶、cpg氧化酶或ppg氧化酶的能力。在一些实施方案中，与野生型株系相比，藻类株系具有增加量的血红素、含血红素的蛋白质、原卟啉原ix、胆绿素ix、植物色素和亚铁螯合酶中的一种或更多种。

在一些实施方案中，藻类株系产生类胡萝卜素或类胡萝卜素的前体。不受理论束缚，类胡萝卜素赋予颜色并且可以对基于植物的替代品的视觉外观产生影响。示例性类胡萝卜素包括但不限于γ-胡萝卜素、β-胡萝卜素、β隐黄质，玉米黄质、花药黄质、叶黄素、前番茄红素和番茄红素。

在一些实施方案中，藻类株系缺乏类胡萝卜素或类胡萝卜素的前体。类胡萝卜素生物合成的缺陷可能由于突变(诸如影响类胡萝卜素生物合成的突变，例如茄红素合酶基因的突变)而发生。

在一些实施方案中，基于一种或更多种表型和/或基因型选择或鉴定用于本文方法和用于制备含血红素组合物的藻类株系。在一些实施方案中，用于过量产生血红素的藻类株系可以通过交配方法产生。在一些实施方案中，用于过量产生血红素的藻类株系可以通过诱变产生(诸如紫外线诱变)。在一些实施方案中，用于过量产生血红素的藻类株系可以通过使用导致dna改变的化合物的化学诱变产生。

如本文所用，术语“遗传修饰”用于指以不在自然条件下发生的方式对生物体遗传物质的任何操作。进行这种操作的方法是本领域普通技术人员已知的，且包括但不限于利用载体用目的核酸序列转化细胞的技术。定义中包括各种形式的基因编辑，其中使用工程化的核酸酶或“分子剪刀”在生物体的基因组中插入、删除或替换dna。这些核酸酶在基因组中的所需位置产生位点特异性双链断裂(dsb)。诱导的双链断裂通过非同源末端连接(nhej)或同源重组(hr)修复，引起靶向突变(即编辑)。

在基因编辑中存在几个工程化核酸酶家族，例如但不限于，大范围核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)、crispr-cas系统和arcus。然而，应该理解，任何已知的利用工程化核酸酶的基因编辑系统都可以用于本文所述的方法中。因此，在一些实施方案中，可以通过使用诸如crispr-cas9的技术或通过使用锌指核酸酶来对过量产生血红素的藻株进行遗传修饰。

crispr(成簇的、规律间隔的短回文重复序列)是包含多个、短的碱基序列的直接重复的dna基因座的首字母缩写。原核生物crispr/cas系统已经适合用作真核生物中的基因编辑(沉默、增强或改变特定基因)(参见，例如，cong,science,15:339(6121):819-823(2013)和jinek,etal.,science,337(6096):816-21(2012))。通过用包含cas基因和特别设计的crispr的元件转染细胞，可以在任何所需位置切割和修饰核酸序列。使用crispr/cas系统制备用于基因组编辑的组合物的方法详细描述于uspub.no.2016/0340661、uspub.no.20160340662、uspub.no.2016/0354487、uspub.no.2016/0355796、uspub.no.20160355797和wo2014/018423中，其全部内容通过引用明确并入本文。

锌指核酸酶(zfn)是通过将锌指dna结合结构域与dna切割结构域融合而产生的人工限制酶。可以设计锌指结构域以靶向特定的所需dna序列，这使得锌指核酸酶能够靶向复杂基因组内的独特序列。通过利用内源dna修复机制，这些试剂可用于精确改变高等生物的基因组。最常见的切割结构域是iis型酶fok1。fok1催化dna的双链切割，其一条链上的识别位点为9个核苷酸，另一条链上的识别位点为13个核苷酸。参见，例如，u.s.pat.nos.5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及lietal.proc.,natl.acad.sci.usa89(1992):4275-4279；lietal.proc.natl.acad.sci.usa,90:2764-2768(1993)；kimetal.proc.natl.acad.sci.usa.91:883-887(1994a)；kimetal.j.biol.chem.269:31,978-31,982(1994b)，所有这些文献都通过引用并入本文。这些酶(或其酶促功能片段)中的一种或更多种可用作切割结构域的来源。

用于选择藻类的方法包括但不限于叶绿素生物合成途径和/或叶绿素积累的缺陷、突变和变化的遗传筛选或表型筛选、血红素、血红素生物合成中间体和血红素生物合成酶的表达和/或积累增加的遗传筛选或表型筛选。在一些实施方案中，基于藻类株系的光谱分布和/或藻类株系的红色或类似于红色的颜色选择或鉴定用于本文方法和用于制备含血红素组合物的藻类株系。在一些实施方案中，基于藻类株系在黑暗条件下的生长速率选择或鉴定用于本文方法和用于制备含血红素组合物的藻类。在一些实施方案中，所述选择基于黑暗条件下的生长速率和在黑暗条件下生长时红色或类似于红色的颜色的外观或增强。在一些实施方案中，选择产生或积累的类胡萝卜素的量缺乏或减少的藻类株系。

在一些实施方案中，将藻类株系交配以组合或增强有助于血红素产生、血红素积累、叶绿素减少和/或类胡萝卜素减少的特征。在一些实施方案中，在黑暗条件下具有快速生长(例如，比野生型株系更快)的藻类株系与表现出红色或类似于红色的颜色的藻类株系交配。在一些实施方案中，缺乏类胡萝卜素产生或积累的藻类株系与表现出红色或类似于红色的颜色的藻类株系交配。

在一些实施方案中，诱变藻类株系，并然后选择或鉴定新株系，其表现出血红素产生增加、血红素积累、叶绿素减少和/或类胡萝卜素减少的一种或更多种特征。在一些实施方案中，通过诱变第一起始株系并选择在黑暗中比第一起始株系生长更快的第二株系产生藻类株系。在一些实施方案中，通过诱变第一起始株系并选择缺乏一种或更多种类胡萝卜素的第二株系来产生藻类株系。

用于组合物和方法的藻类

在本文提供的用于产生血红素和含血红素的组合物的组合物和方法中，使用具有血红素生物合成途径的藻类株系。在一些实施方案中，用于过量产生血红素的藻类株系是绿藻门(chlorophyta)(绿藻greenalgae)。在一些实施方案中，绿藻选自由以下项组成的组：衣藻(chlamydomonas)、杜氏藻(dunaliella)、红球藻(haematococcus)、小球藻(chlorella)和栅裂藻(scenedesmaceae)。在一些实施方案中，衣藻(chlamydomonas)是莱茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)。在不同的实施方案中，绿藻可以是chlorophycean、衣藻(chlamydomonas)、莱茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)、莱茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)137c或缺乏psba的莱茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)株系。在一些实施方案中，所选宿主是莱茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)，诸如在rasalaandmayfield,bioengbugs.(2011)2(1):50-4；rasala,etal.,plantbiotechnolj.(2011)may2,pmid21535358；coragliotti,etal.,molbiotechnol.(2011)48(1):60-75；specht,etal.,biotechnollett.(2010)32(10):1373-83；rasala,etal.,plantbiotechnolj.(2010)8(6):719-33；mulo,etal.,biochimbiophysacta.(2011)may2,pmid:21565160；和bonente,etal.,photosynthres.(2011)may6,pmid:21547493；uspub.no.2012/0309939；uspub.no.2010/0129394；以及intl.pub.no.wo2012/170125中的。出于所有目的，所有前述参考文献通过全文引用并入本文。

在一些实施方案中，用于过量产生血红素的藻类株系是单细胞藻类。所关注的示例性和另外的微藻种包括但不限于：东方曲壳藻(achnanthesorientalis)、阿格门氏藻(agmenellum)、透明茧形藻(amphiprorahyaline)、咖啡形双眉藻(amphoracoffeiformis)、咖啡形双眉藻线状变种(amphoracoffeiformislinea)、咖啡形双眉藻斑点变种(amphoracoffeiformispunctata)、咖啡形双眉藻泰勒氏变种(amphoracoffeiformistaylori)、咖啡形双眉藻细薄变种(amphoracoffeiformistenuis)、咖啡形双眉藻优美变种(amphoradelicatissima)、咖啡形双眉藻优美头状变种(amphoradelicatissimacapitata)、双眉藻属(amphorasp.)、项圈藻(anabaena)、纤维藻(ankistrodesmus)、镰形纤维藻(ankistrodesmusfalcatus)、黄金色藻(boekeloviahooglandii)、包特氏菌属(borodinellasp.)、布朗葡萄藻(botryococcusbraunii)、苏台德葡萄籽(botryococcussudeticus)、四鞭藻属(carteria)、纤细角毛藻(chaetocerosgracilis)、牟氏角毛藻(chaetocerosmuelleri)、牟氏角毛藻亚盐变种(chaetocerosmuellerisubsalsum)、角毛藻属(chaetocerossp.)、衣藻属(chlamydomonassp.)、莱茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)、无硝小球藻(chlorellaanitrata)、南极小球藻(chlorellaantarctica)、金绿小球藻(chlorellaaureoviridis)、卡氏小球藻(chlorellacandida)、包囊小球藻(chlorellacapsulate)、脱水小球藻(chlorelladesiccate)、椭圆小球藻(chlorellaellipsoidea)、浮水小球藻(chlorellaemersonii)、淡褐小球藻(chlorellafusca)、淡褐小球藻空腔变种(chlorellafuscavar.vacuolata)、谷氏小球藻(chlorellaglucotropha)、水溪小球藻(chlorellainfusionum)、水溪小球藻栖海岸变种(chlorellainfusionumvar.actophila)、水溪小球藻增大变种(chlorellainfusionumvar.auxenophila)、凯氏小球藻(chlorellakessleri)、匍扇小球藻(chlorellalobophora)(株系sag3788)、黄绿小球藻(chlorellaluteoviridis)、黄绿小球藻金绿变种(chlorellaluteoviridisvar.aureoviridis)、黄绿小球藻淡黄变种(chlorellaluteoviridisvar.lutescens)、红藻小球藻(chlorellaminiata)、微小小球藻(chlorellaminutissima)、突变小球藻(chlorellamutabilis)、夜间小球藻(chlorellanocturna)、巴夫氏小球藻(chlorellaparva)、嗜光小球藻(chlorellaphotophila)、普氏小球藻(chlorellapringsheimii)、原始小球藻(chlorellaprotothecoides)、原始小球藻耐酸变种(chlorellaprotothecoidesvar.acidicola)、规则小球藻(chlorellaregularis)、规则小球藻小型变种(chlorellaregularisvar.minima)、规则小球藻伞状变种(chlorellaregularisvar.umbricata)、瑞氏小球藻(chlorellareisiglii)、嗜糖小球藻(chlorellasaccharophila)、嗜糖小球藻椭圆变种(chlorellasaccharophilavar.ellipsoidea)、盐生小球藻(chlorellasalina)、简单小球藻(chlorellasimplex)、耐热性小球藻(chlorellasorokiniana)、小球藻属(chlorellasp.)、球形小球藻(chlorellasphaerica)、斯蒂格小球藻(chlorellastigmatophora)、万尼氏小球藻(chlorellavanniellii)、普通小球藻(chlorellavulgaris)、普通小球藻(chlorellavulgaris)、普通小球藻粗皮变种(chlorellavulgarisftertia)、普通小球藻自养变种(chlorellavulgarisvar.autotrophica)、普通小球藻绿色变种(chlorellavulgarisvar.viridis)、普通小球藻普通变种(chlorellavulgarisvar.vulgaris)、普通小球藻普通变种粗皮变种(chlorellavulgarisvar.vulgarisftertia)、普通小球藻普通变种绿色变种(chlorellavulgarisvar.vulgarisfviridis)、黄色小球藻(chlorellaxanthella)、左氏小球藻(chlorellazofingiensis)、他伯氏小球藻(chlorellatrebouxioides)、普通小球藻(chlorellavulgaris)、水溪绿球藻(chlorococcuminfusionum)、绿球藻属(chlorococcumsp.)、绿梭藻属(chlorogonium)、蓝隐藻属(chroomonassp.)、金球藻属(chrysosphaerasp.)、球钙板藻属(cricosphaerasp.)、寇氏隐甲藻(crypthecodiniumcohnii)、隐藻属(cryptomonassp.)、隐蔽小环藻(cyclotellacryptica)、梅尼小环藻(cyclotellameneghiniana)、小环藻属(cyclotellasp.)、杜氏藻属(dunaliellasp.)、拜尔代维勒杜氏藻(dunaliellabardawil)、双眼杜氏藻(dunaliellabioculata)、颗粒状杜氏藻(dunaliellagranulate)、海洋杜氏藻(dunaliellamaritime)、微小杜氏藻(dunaliellaminuta)、巴夫杜氏藻(dunaliellaparva)、比雷杜氏藻(dunaliellapeircei)、普林莫杜氏藻(dunaliellaprimolecta)、盐生杜氏藻(dunaliellasalina)、陆生杜氏藻(dunaliellaterricola)、特氏杜氏藻(dunaliellatertiolecta)、绿色杜氏藻(dunaliellaviridis)、陆生杜氏藻(dunaliellaterricola)、绿色独球藻(eremosphaeraviridis)、独球藻属(eremosphaerasp.)、椭圆藻属(ellipsoidonsp.)、裸藻属(euglena)、伏氏藻属(franceiasp.)、克罗脆杆藻(fragilariacrotonensis)、脆杆藻属(fragilariasp.)、粘球藻属(gleocapsasp.)、丽丝藻属(gloeothamnionsp.)、膜胞藻属(hymenomonassp.)、球等鞭金藻亲近种(isochrysisaffgalbana)、球等鞭金藻(isochrysisgalbana)、鳞孔藻属(lepocinclis)、微星藻属(micractinium)、微星藻属(micractinium)(utexlb2614)、微小单针藻(monoraphidiumminutum)、单针藻属(monoraphidiumsp.)、微球藻属(nannochlorissp.)、盐生拟微球藻(nannochloropsissalina)、拟微球藻属(nannochloropsissp.)、适意舟形藻(naviculaacceptata)、毕氏舟形藻(naviculabiskanterae)、假卵泡舟形藻(naviculapseudotenelloides)、薄膜舟形藻(naviculapelliculosa)、嗜腐舟形藻(naviculasaprophila)、舟形藻属(naviculasp.)、肾鞭藻属(nephrochlorissp.)、肾藻属(nephroselmissp.)、普通菱形藻(nitschiacommunis)、亚历山大菱形藻(nitzschiaalexandrina)、普通菱形藻(nitschiacommunis)、细端菱形藻(nitzschiadissipata)、碎片菱形藻(nitzschiafrustulum)、汉氏菱形藻(nitzschiahantzschiana)、平庸菱形藻(nitzschiainconspicua)、中型菱形藻(nitzschiaintermedia)、小头菱形藻(nitzschiamicrocephala)、微小菱形藻(nitzschiapusilla)、微小菱形藻椭圆变种(nitzschiapusillaelliptica)、微小菱形藻莫纳变种(nitzschiapusillamonoensis)、四边形菱形藻(nitzschiaquadrangular)、菱形藻属(nitzschiasp.)、掠鞭藻属(ochromonassp.)、小卵胞藻(oocystisparva)、极小卵胞藻(oocystispusilla)、卵胞藻属(oocystissp.)、沼泽颤藻(oscillatorialimnetica)、颤藻属(oscillatoriasp.)、亚短颤藻(oscillatoriasubbrevis)、嗜酸帕氏藻(pascheriaacidophila)、巴夫藻属(pavlovasp.)、噬菌体属(phagus)、席藻属(phormidium)、扁藻属(platymonassp.)、卡氏颗石藻(pleurochrysiscarterae)、齿状颗石藻(pleurochrysisdentate)、颗石藻属(pleurochrysissp.)、魏氏原壁藻(protothecawickerhamii)、雍滞原壁藻(protothecastagnora)、波多黎各原壁藻(protothecaportoricensis)、桑堪形原壁藻(protothecamoriformis)、饶氏原壁藻(protothecazopfii)、塔胞藻属(pyramimonassp.)、桑堪藻属(pyrobotrys)、囊状金藻(sarcinoidchrysophyte)、被甲栅藻(scenedesmusarmatus)、裂壶藻属(schizochytrium)、水绵属(spirogyra)、钝顶螺旋藻(spirulinaplatensis)、裂丝藻属(stichococcussp.)、聚球藻属(synechococcussp.)、四角藻属(tetraedron)、四爿藻属(tetraselmissp.)、亚心形扁藻(tetraselmissuecica)、威氏海链藻(thalassiosiraweissflogii)、和弗雷德鲜绿球藻(viridiellafridericiana)。在一些实施方案中，藻类是衣藻(chlamydomonas)种。在一些实施方案中，藻类是莱茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)。在一些实施方案中，藻类是通过诱变或通过与另一藻类株系交配制备的绿色衣藻(chlamydomonas)株系的衍生物。

过量产生血红素的株系的培养方法

用于在液体培养基中培养藻类的方法包括多种选择，其包括池塘、沟渠、小规模实验室系统，和封闭和部分封闭的生物反应器系统。藻类也可以直接在水中生长，例如，在大洋、海、湖泊、河流、水库等。

在一些实施方案中，在本文提供的方法和组合物中有用的的血红素过量产生的藻类在受控培养系统中生长(诸如小规模实验室系统、大规模系统和/或封闭和部分封闭的生物反应器系统)。小规模实验室系统是指体积小于约6升的培养物，并且可以在约1毫升或更低至约6升的范围内。大规模培养是指培养物的体积大于约6升，并且可以在约6升至约200升的范围内，甚至更大规模的系统，其覆盖面积为5至2500平方米或更大。大规模培养系统可包括约10000至约20000升和高达约1000000升的液体培养系统。

与用于产生本文组合物的方法一起使用的培养系统包括封闭的结构(诸如生物反应器)，其中环境受到比开放系统或半封闭系统更严格的控制。光生物反应器是结合了某种类型的光源以向反应器提供光子能量输入的生物反应器。术语生物反应器可以指与环境封闭并且不与环境直接交换气体和/或污染物的系统。生物反应器可描述为封闭的，并且在光生物反应器照射的情况下，设计用于控制液体细胞悬浮培养物的生物质产生的培养容器。

在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中使用的藻类在发酵容器中生长。在一些实施方案中，容器是不锈钢发酵容器。在一些实施方案中，藻类在异养条件下生长，由此向培养物提供一种或更多种碳源。在一些实施方案中，藻类在需氧和异养条件下生长。在一些实施方案中，藻类生长至密度大于或约10g/l、约20g/l、约30g/l、约40g/l、约50g/l、约75g/l、约100g/l、约125g/l或约150g/l。

在一些实施方案中，将藻类从种子罐接种至起始密度大于约0.1g/l、约1.0g/l、约5.0g/l、约10.0g/l、约20.0g/l、约50g/l、约80g/l，或约100g/l。一旦接种，藻类使用需氧发酵方法异养生长。在此方法中，藻类被喂养营养物以维持其生长。在一些实施方案中，这些营养物包括还原性碳源。示例性的还原性碳源包括但不限于乙酸盐、葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油和其他糖类。在一些实施方案中，藻类培养物补充有铁。

在一些实施方案中，藻类在黑暗条件下培养。在一些实施方案中，在黑暗条件下培养的藻类缺乏或减少叶绿素产生。在一些实施方案中，在黑暗条件下生长的藻类补充有一种或更多种营养物。在一些实施方案中，在黑暗条件下生长的藻类在还原性碳源(例如乙酸盐、葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油和其他糖)的存在下生长。在一些实施方案中，在黑暗条件下生长的藻类在铁的存在下生长或以其他方式补充铁。

含血红素的制剂和产品

诸如本文所述的藻类株系和过量产生血红素的培养物可以各种形式和制剂使用。在一些实施方案中，含血红素的组合物由过量产生血红素的藻类培养物制备，其中所述组合物是红色或类似于红色的颜色。

在一些实施方案中，含血红素的组合物由分离自经培养的藻类的生物质制备。在一些实施方案中，进一步对生物质进行分层以除去一种或更多种成分。在一些实施方案中，对生物质进行分层以除去淀粉。在一些实施方案中，对生物质进行分层以除去蛋白质。在一些实施方案中，对生物质进行分层或以其他方式处理生物质以除去类胡萝卜素。在一些实施方案中，将生物质分层或以其他方式处理以富集某些组分。在一些实施方案中，经分层或经处理的生物质富含血红素。在一些实施方案中，经分层或经处理的生物质富含蛋白质或富含蛋白质和血红素。在一些实施方案中，分层或处理增强制剂的红色或类似于红色的颜色。经分层或经处理的生物质可富含蛋白质含量，使得组合物为约10％蛋白质、大于约10％蛋白质，或大于约20％、约30％、约40％或约50％蛋白质。

在一些实施方案中，含血红素的组合物是由经培养的藻类的培养基制备的含血红素的液体。在一些实施方案中，含血红素的组合物由在藻类培养物中细胞外发现的血红素制备。在一些实施方案中，裂解或以其他方式处理藻类培养物以从细胞释放血红素。在一些实施方案中，进一步对含血红素的液体进行分层以除去一种或更多种组分。在一些实施方案中，对含血红素的液体进行分层以除去淀粉。在一些实施方案中，对含血红素的液体进行分层以除去蛋白质。在一些实施方案中，对含血红素的液体进行分层或以其他方式处理含血红素的液体以除去类胡萝卜素。在一些实施方案中，对含血红素的液体进行分层或以其他方式处理含血红素的液体以富集某些组分。在一些实施方案中，经分层或经处理的含血红素的液体富含血红素。在一些实施方案中，分层或处理增强制剂的红色或类似于红色的颜色。

可以进一步处理含血红素的组合物，其包括生物质、液体和经分层的制剂。这种处理可包括浓缩、干燥、冻干和冷冻。在各种实施方案中，含血红素的组合物可与另外成分和配料组合。在一些实施方案中，将含血红素的组合物与另外配料组合以产生可食用产品。在一些实施方案中，含血红素的组合物赋予可食用产品红色或类似于红色的颜色。在一些实施方案中，含血红素的组合物赋予可食用产品类似肉的特征(诸如类似肉的味道、香气和/或质地)。

在一些实施方案中，含血红素的组合物与另外配料组合以产生类似肉的制品。这种类似肉的制品可包括清洁的肉或经培养的肉(由在实验室中或其它在动物外部生长的动物细胞制成)、基于植物的肉和基于非动物的肉(由植物配料和/或非动物源配料制成)。在一些实施方案中，将由过量产生的藻类制成的含血红素的组合物与另外的配料组合以产生类似肉的制品，凭借添加含血红素的组合物赋予类似肉的制品红色或类似于红色的颜色、类似肉的香气、类似肉的味道和/或类似肉的质地。在一些实施方案中，将含血红素的组合物赋予的类似肉的特征赋予生的或未烹饪的产品。在一些实施方案中，将含血红素的组合物赋予的类似肉的特征赋予经烹饪的产品。

实施例

实施例1：过量产生血红素藻类的鉴定

通过它们不能产生叶绿素来鉴定过表达血红素的藻类(莱茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii))株系。另外，这些株系表现出红色、棕色、橙色或所列颜色的一些变体。鉴定的株系表现出光敏感性，并且不能在大于10μem^-2s^-1的直接光下长时间生长。

其中一种经鉴定的株系在流加培养需氧发酵条件下生长，其中乙酸盐用作培养物营养物的还原性碳源。株系在发酵罐中生长，其中最低限度的光可以到达培养物。使株系生长至大于50g/l的密度并通过离心收获。收获的株系是红色的并且可以添加到组合物(准入股食品)中以赋予红色、橙色或棕色。图3是显示在需氧发酵条件下生长的血红素过量产生者的株系的细胞重量的图。

实施例2：分层

从发酵培养物中收获来自莱茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)的过量产生血红素的株系的细胞。通过超声破碎已收获的细胞，然后通过10000×g离心分离样品。这将样品分离成类胡萝卜素、淀粉和蛋白质/血红素生物质组分。然后将蛋白质/血红素生物质重新悬浮在ph7.4的磷酸盐缓冲盐水中。图2中显示离心后的分层(左)和含血红素组分的重悬物(右)。

实施例3：血红素产生的表征

可以使用许多血红素试验来确定血红素的浓度。在一个实施例中，血红素的量可以通过下述方法定量确定：将藻类生物质混合到碱性水溶液中，从而使血红素转化成均匀的颜色。可以通过400nm处的吸光度测量颜色强度，其与样品中的血红素浓度成正比。然后可以将这些测量值与由已知浓度的血红素产生的标准进行比较，以确定藻类样品中血红素的量。

实施例4：富含血红素的可食用产品的制备

富含血红素的样品可用于制备由基于植物的材料和富含血红素的藻类产生的类似肉的制品的组合物。在该实施例中，将20克椰子油、20克组织化小麦蛋白、53克水、5克富含血红素的藻类生物质、1茶匙的魔芋胶、1茶匙黄原胶和1克酵母提取物混合并形成一个圆盘状的基于藻类植物的汉堡。烹饪后，基于藻类植物的汉堡会像基于肉的汉堡一样出血。