一种南瓜单倍体植株的诱导方法及用于该诱导方法的培养基与流程

本发明属于植物离体再生技术领域，尤其涉及一种南瓜单倍体植株的诱导方法及用于该诱导方法的培养基。

背景技术：

南瓜(cucurbitaspp.)耐贫瘠，易栽培，适应性、抗逆性强，产量高，经济效益好，现今我国南瓜播种面积与产量均高居世界首位。我国地广物博，具有丰富的南瓜种质资源，上世纪50年代以来，全国前后开展了三次大的农作物品种资源的调查、搜集工作，其中得到约1100份南瓜种质资源，但是南瓜资源创新与育种研究基础非常薄弱，育种技术相对落后，具有自主知识产权的优质、专用优良品种严重缺乏。南瓜常规育种周期长、工作量大，自交系的获得需要经过大量的、长时间的自交、选择(至少8代)。

远缘杂交利用杂种优势培育新品种是最常用的南瓜育种的手段，但是由于不同南瓜品种间的种间杂交能力不同，经常存在种间杂交不亲和的情况，f1代结实率低或不结实，f2及其后代出现性状的剧烈分离且不易稳定等问题。而利用离体雌核发育技术诱导单倍体可以在1-2年内得到纯合系，稳定远缘杂交新性状，解决f1代结实率低或不结实等问题，大大加快了育种进程，提高了育种效率。另外，单倍体及双单倍体作为永久性群体不仅可以直接作为育种亲本，还可作为转基因载体、构建遗传连锁图、用于对数量性状的遗传分析、用于基因组测序等等，在蔬菜遗传育种中存在极大的应用价值。

邓英(2017)公开一种南瓜未受精子房离体培养诱导雌核发育的培养基及应用，该发明通过在培养基中添加一定浓度的tdz在诱导三个月后成功获得了再生植株，但是存在出胚率低、再生植株数量少且未鉴定其倍性等问题。

因此，研究一种育种效率高、育种年限短的南瓜单倍体植株诱导方法，对本技术领域而言具有十分重要的意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种育种效率高、育种年限短的南瓜单倍体植株诱导方法，以及用于该诱导方法的培养基。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种南瓜单倍体植株的诱导方法，包括如下步骤：将南瓜未受精子房进行表面消毒，切除子房纵向两端无胚珠的部分和子房外皮，然后将其横切成厚度为1mm-2mm的子房薄片，将所述子房薄片消毒后接种到诱导培养基中进行诱导培养，待得到的胚状体具有明显的形态学上端和形态学下端时转移到成苗培养基中进行成苗培养，直至得到再生植株，通过倍性鉴定筛选出南瓜单倍体植株。

上述的诱导方法，优选的，所述南瓜未受精子房是通过以下方法得到：在南瓜雌花开花前一天对其进行套袋处理，在开花当天上午7:00-8:00取带有子房的未受精雌花，用冰盒带回后在流水下冲洗2-3min，去花后得到所述的南瓜未受精子房。

优选的，所述表面消毒的具体操作包括如下步骤：用体积分数为75％的酒精对所述南瓜未受精子房进行表面消毒30s-1min，然后用无菌水冲洗1-3次。

优选的，所述子房薄片消毒的具体操作包括如下步骤：用质量分数为2-3％的次氯酸钠溶液对所述子房薄片进行消毒5-7min，然后用无菌水冲洗4-6次。

优选的，所述诱导培养的具体操作包括如下步骤：将消毒后的所述子房薄片在34-36℃全黑暗条件下热激处理4-5d，待观察到胚珠膨大后将其转到温度24-26℃、光照强度2000lx-2500lx、光照时间14h/d的条件下进行光暗培养。

优选的，所述倍性鉴定采用的方法为流式细胞检测法。

优选的，所述诱导培养基在ms培养基的基础上添加6-苄氨基腺嘌呤或噻苯隆，所述6-苄氨基腺嘌呤在诱导培养基中的浓度为0.2-2mg/l，所述噻苯隆在诱导培养基中的浓度为0.02-0.04mg/l；更优选的，所述诱导培养基在ms培养基的基础上添加6-苄氨基腺嘌呤，所述6-苄氨基腺嘌呤在诱导培养基中的浓度为1mg/l。

优选的，所述成苗培养基为ms培养基。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明的方法，能够利用南瓜未受精子房离体培养得到大量的南瓜单倍体再生植株，操作简单，能在60天内得到单倍体植株，且出胚率和植株再生率较高，缩短育种年限，极大地提高了育种效率，单倍体率高。

2、本发明的培养基为诱导培养基，只添加一种激素6-苄氨基腺嘌呤或噻苯隆，配制方便，价格低廉，能够有效应用于南瓜未受精子房离体培养，得到大量的南瓜单倍体再生植株，在很短时间内得到纯系材料，缩短育种年限，极大地提高了育种效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是南瓜未受精子房离体培养诱导单倍体植株过程(a、膨大胚珠；b、转绿胚珠；c、胚状体；d、再生植株)；

图2是正常二倍体南瓜(2n)的流式细胞仪检测结果；

图3是单倍体再生南瓜的流式细胞仪检测结果；

图4是n+2n嵌合体再生南瓜的流式细胞仪检测结果；

图5是二倍体再生南瓜的流式细胞仪检测结果；

图6是四倍体再生南瓜的流式细胞仪检测结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

一种本发明的南瓜单倍体植株的诱导方法，包括如下步骤：

1、材料准备：以雪峰密本南瓜为材料，此品种为湖南雪峰种业有限责任公司提供的f1代杂交种，种植于湖南农业大学园艺园林学院蔬菜学基地，株行距、水肥管理按照一般水平进行管理；培养基中基本培养基为ms培养基，ph为5.8，用口径为9cm左右的培养瓶分装，置于高压灭菌锅中121℃灭菌20min。

ms培养基的配方如下：硝酸钾1900mg/l；硝酸铵1650mg/l；磷酸二氢钾170mg/l；硫酸镁370mg/l；氯化钙440mg/l；碘化钾0.83mg/l；硼酸6.2mg/l；硫酸锰22.3mg/l；硫酸锌8.6mg/l；钼酸钠0.25mg/l；硫酸铜0.025mg/l；氯化钴0.025mg/l；乙二胺四乙酸二钠37.3mg/l；硫酸亚铁27.8mg/l；肌醇100mg/l；甘氨酸2mg/l；盐酸硫胺素0.1mg/l；盐酸吡哆醇0.5mg/l；烟酸0.5mg/l；琼脂7000mg/l；蔗糖30000mg/l。

2、取材：待开第二朵雌花时在开花前一天套袋，在开花当天早上8:00左右摘取前一天套袋处理的未受精的带有子房的南瓜雌花并用冰盒带回，在流水下冲洗2min，去花备用。

3、消毒：在超净工作台上先用体积分数为75％的酒精消毒30s，然后用无菌水冲洗2次；在无菌滤纸上切除纵向子房两端不含胚珠部分，去除子房外皮，然后将子房横切成2mm左右的薄片；将子房片置于质量分数为3％的次氯酸钠溶液中消毒5min，最后用无菌水冲洗5次备用。

4、诱导培养：将子房片接种到培养基(i1～i11，如表1所示，其中i1～i7为诱导培养基)后在35℃全黑暗条件下进行热激处理，每瓶培养基接种子房片8片，每个处理至少接种5瓶，重复3次；热激处理5d后可明显观察到胚珠膨大后转到25℃，2000lx-2500lx、14h/d条件下进行光暗培养。

5、出胚率统计：大约第30天时有愈伤形成，分化出胚后每三天记录一次出胚情况，第60d时统计总胚状体数。

6、成苗培养：待胚状体分化出子叶和胚根，具有明显的形态学上端和形态学下端后，转入成苗培养基(成分见表1)中继续生长、发育，获得完整的再生植株，一般培养30天左右可以得到再生植株。

表1：南瓜未受精子房离体培养的培养基成分及实验数据

由表1可知，当ms培养基中添加1.0mg/l6-ba时(i3培养基)出胚率最高，最有利于南瓜未受精子房离体培养。

上述南瓜单倍体植株的诱导过程如图1所示：a、膨大胚珠；b、转绿胚珠；c、胚状体；d、再生植株。

7、再生植株倍性鉴定

流式细胞检测法(流式细胞仪检测)：

由于细胞核g1期的dna含量反应一个细胞的倍性，因此常用dna含量来估计细胞的倍性。流式细胞术(flowcytometry)是通过测定叶片单个细胞核内dna含量，根据dna含量的曲线图来推断细胞的倍性，从而快速鉴别植株的染色体倍性水平。流式细胞测定法特别是在离体培养过程中，试管中的芽或小植株很小和很嫩时，该方法仅用1cm²的样品就很容易鉴定其材料倍性，而且准确率高。其特点是制样简单，测试速度快，灵敏度、分辨率及准确性较高，所以流式细胞测定法特别适合于样品较多的倍性检测分析。

本次实验使用的仪器是sysmexpartec品牌的cyflowspace，试剂盒是sysmexpartec的cystainuvprecisep试剂盒。

实验原理如下：首先游离细胞核，然后用dapi染液将细胞核染色体上的at碱基染色，然后用仪器检测细胞核里被染色的at碱基发出的荧光强度。比如二倍体的荧光强度是200(横坐标)，那么单倍体的荧光强度就是100(横坐标)。结果的纵坐标是细胞数量的显示，通常来说，信号峰高说明信号比较好，杂质少。

具体操作步骤如下：

(1)取再生植物的新鲜待测植物叶片0.5cm²，置于培养皿中。

(2)取parteccystainuvprecisep裂解液400ul加于植物叶片周围，用刀片将叶片切碎，以充分提取出完整的细胞核，提取时间取决于样本性质，一般为10s。

(3)将培养皿中的液体用30um滤网过滤至样品管中。

(4)向样品管中加入parteccystainuvprecisep染液1600ul，染色时间取决于样本性质，一般为10秒。

(5)上机测试，检测结果如图2-6所示。

本实施例以南瓜未受精子房为材料离体培养获得了大量南瓜再生植株，经鉴定27份再生植株中13株为单倍体，2株为非整倍体，11株为二倍体，1株为四倍体。本方法操作简单，能在60天内得到单倍体植株，极大的提高了育种效率。