本发明涉及细胞培养
技术领域：
，尤其涉及一种人羊膜间充质干细胞冻存液及其冻存方法。
背景技术：
：间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我复制能力和多向分化能力，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为神经、血管内皮、软骨、肌肉、肝脏、心肌等多种组织细胞。mscs因其相对缺少免疫源性，培养技术简单，并可冷冻保存，因此已成为细胞及基因治疗研究的种子细胞，具有潜在的临床应用价值，已成为干细胞研究的热点。细胞在冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有造成生物性损伤的危险。间充质干细胞冻存常用的细胞冻存液是含5％-15％甘油或二甲基亚砜的牛血清，甘油和二甲基亚砜作为保护剂可以降低细胞冻存液的凝固点，同时通过慢冻快融的冻存复苏操作，可以减少细胞内冰晶形成和细胞的损伤，达到较好的细胞冻存效果。和其他来源的干细胞相比，人羊膜间充质干细胞具有低免疫原性和免疫抑制的特点，使得人羊膜干细胞的移植副作用小，人羊膜间充质干细胞移植治疗一些炎症相关的疾病取得了较好的效果。现有的羊膜间充质干细胞冻存液组分主要包括动物源血清和二甲基亚砜，由于血清成分不能稳定控制，存在批间差异大、生产不稳定等问题，还会带来排异反应的风险。dmso冻存的间充质干细胞可能与一些毒性反应有关，比如呕吐、心脏功能失调、过敏和急性肾衰，所以在保证冻存效果的前提下，应尽量降低dmso的浓度。为了解决上述问题，无血清冻存液成为一种可行的替代方案。但是，目前的人羊膜间充质干细胞无血清冻存液冻存后复苏的细胞存活率低，不能满足临床应用的需求。为了进一步提高冻存人羊膜间充质干细胞的存活率，有必要对细胞冻存液做进一步的改进。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种人羊膜间充质干细胞冻存液，在降低二甲基亚枫用量的用时，保证冻存后细胞活性，复苏后的细胞存活率高。本发明的目的之二在于提供一种人羊膜间充质干细胞的冻存方法。本发明的目的之一采用如下技术方案实现：一种人羊膜间充质干细胞冻存液，由以下原料组成：基础培养基、二甲基亚枫、普鲁兰多糖、视黄醇结合蛋白、泡叶藻提取物、γ-谷维素、茶多酚。进一步地，所述基础培养基为dmem/f12培养基，所述dmem/f12培养基和二甲基亚砜的体积比为100:1-1.5，所述普鲁兰多糖、视黄醇结合蛋白、泡叶藻提取物、γ-谷维素、茶多酚在冻存液中的浓度分别为：普鲁兰多糖2.5-3.0mg/ml、视黄醇结合蛋白8.0-8.7μg/ml、泡叶藻提取物1.5-2.3mg/ml、γ-谷维素10.0-12.0μg/ml、茶多酚15.0-18.0μg/ml。进一步地，所述dmem/f12培养基和二甲基亚砜的体积比为100:1.2，所述普鲁兰多糖、视黄醇结合蛋白、泡叶藻提取物、γ-谷维素、茶多酚在冻存液中的浓度分别为：普鲁兰多糖2.7mg/ml、视黄醇结合蛋白8.5μg/ml、泡叶藻提取物2.0mg/ml、γ-谷维素10.5μg/ml、茶多酚17.0μg/ml。进一步地，所述泡叶藻提取物通过下述方法制备得到：取泡叶藻经烘干粉碎后加入8-10体积的蒸馏水浸提，过滤后取滤液，减压浓缩得到水提物；向上述水提物中加入体积分数为55%的乙醇，进行沉淀，离心取沉淀物，加蒸馏水溶解沉淀物后冻干，即得泡叶藻提取物。本发明的目的之二采用如下技术方案实现：一种人羊膜间充质干细胞的冻存方法，采用上述冻存液进行冻存。所述一种人羊膜间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：向基础培养基中加入二甲基亚砜、泡叶藻提取物、γ-谷维素、茶多酚，加入人羊膜间充质干细胞，在4-6℃预冷10-15min，再加入普鲁兰多糖、视黄醇结合蛋白，然后在-40℃下预冻1-2h，最后以2-3℃/min的速率降温至-80℃，在-80℃冻存2-3h，完成后转移至液氮中保存。进一步地，所述人羊膜间充质干细胞加入量为每毫升培养基1.0-1.5×107个。相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种人羊膜间充质干细胞的冻存液，采用dmem/f12培养基为细胞提供营养，在冻存液中添加普鲁士兰多糖和视黄醇结合蛋白，利用普鲁兰多糖的成膜性，在低温冻存前在细胞表面形成保护膜，降低细胞冻存过程中产生的冰晶对细胞带来的损伤，添加视黄醇结合蛋白可以抑制冻存过程中形成冰晶的尺寸，进一步降低在冻存过程中细胞外冰晶对细胞造成的损伤。本发明的冻存液中还添加泡叶藻提取物、γ-谷维素、茶多酚，一方面清除冻存过程产生的自由基，具有抗氧化的效果，另一方面，使细胞保持活性，有助于提高细胞复苏的存活率，上述组分在细胞冻存过程中协同作用，无需添加外缘源血清，在降低二甲基亚枫用量的用时，保证冻存后细胞活性，复苏后的细胞存活率高。本发明还提供了一种人羊膜间充质干细胞的冻存方法，在冻存过程中先加入二甲基亚砜、泡叶藻提取物、γ-谷维素、茶多酚，其中二甲基亚枫可以渗透至细胞内部，减少细胞内冰晶的形成，泡叶藻提取物、γ-谷维素、茶多酚帮助细胞保持活性，随着温度的降低再加入普鲁兰多糖、视黄醇结合蛋白，降低细胞外冰晶对细胞造成的损伤，采用上述冻存方法，使人羊膜间充质干细胞保持活性，复苏后细胞存活率高，方法简便，易于操作。具体实施方式下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。下述实施例1至3中所用的泡叶藻提取物采用下述方法制备得到：取泡叶藻经烘干粉碎后加入9倍体积的蒸馏水浸提，过滤后取滤液，减压浓缩得到水提物；向上述水提物中加入体积分数为55%的乙醇，进行沉淀，离心取沉淀物，加蒸馏水溶解沉淀物后冻干，即得泡叶藻提取物。实施例1至3中所用的人羊膜间充质干细胞通过以下方法制备：（1）无菌条件下剥离胎盘上的羊膜，放入玻璃培养皿中，去除损伤严重的部位，用4℃预冷的d-hanks液多次冲洗，剪成1mm×1mm×1mm的块状，加入3倍羊膜体积的0.25％胰蛋白酶消化30min，每隔10min取出摇晃；（2）消化结束后采用d-hanks液清洗，加入1.5倍羊膜体积的0.50g/lⅱ型胶原酶于37℃震荡消化2h，300目滤网过滤，收集细胞滤液，2000r/min离心10min，弃上清，用含10％fbs的dmem/f12培养基重悬细胞，接种于细胞培养瓶中，于37℃、5％co2及饱和湿度条件培养，每3天更换1次培养基；（3）待细胞融合率达到约80％时，加入0.25％胰酶于37℃消化1min，使贴壁细胞脱落，然后加入等体积dmem/f12培养基终止消化，1500r/min离心5min，弃上清液，用含10％fbs的dmem/f12培养基重悬细胞，以1.2×105个/ml细胞浓度种于75cm2培养瓶中进行传代培养，分别取传至第3代、第4代、第5代的细胞进行试验。实施例1一种人羊膜间充质干细胞冻存液，由以下原料组成：dmem/f12培养基、二甲基亚枫、普鲁兰多糖、视黄醇结合蛋白、泡叶藻提取物、γ-谷维素、茶多酚。其中dmem/f12培养基和二甲基亚砜的体积比为100:1.2，普鲁兰多糖、视黄醇结合蛋白、泡叶藻提取物、γ-谷维素、茶多酚在冻存液中的浓度分别为：普鲁兰多糖2.7mg/ml、视黄醇结合蛋白8.5μg/ml、泡叶藻提取物2.0mg/ml、γ-谷维素10.5μg/ml、茶多酚17.0μg/ml。一种人羊膜间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：向dmem/f12培养基中加入二甲基亚砜、泡叶藻提取物、γ-谷维素、茶多酚，加入p3代人羊膜间充质干细胞，每毫升培养基中加入细胞1.0×107个，在4℃预冷15min，再加入普鲁兰多糖、视黄醇结合蛋白，在-40℃下预冻1h，最后以2℃/min的速率降温至-80℃，在-80℃冻存2h，完成后转移至液氮中保存。实施例2一种人羊膜间充质干细胞冻存液，由以下原料组成：dmem/f12培养基、二甲基亚枫、普鲁兰多糖、视黄醇结合蛋白、泡叶藻提取物、γ-谷维素、茶多酚。其中dmem/f12培养基和二甲基亚砜的体积比为100:1，普鲁兰多糖、视黄醇结合蛋白、泡叶藻提取物、γ-谷维素、茶多酚在冻存液中的浓度分别为：普鲁兰多糖2.5mg/ml、视黄醇结合蛋白8.0μg/ml、泡叶藻提取物1.5mg/ml、γ-谷维素10.0μg/ml、茶多酚15.0μg/ml。一种人羊膜间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：向dmem/f12培养基中加入二甲基亚砜、泡叶藻提取物、γ-谷维素、茶多酚，加入p4代人羊膜间充质干细胞，每毫升培养基中加入细胞1.2×107个，在6℃预冷10min，再加入普鲁兰多糖、视黄醇结合蛋白，在-40℃下预冻1h，最后以3℃/min的速率降温至-80℃，在-80℃冻存3h，完成后转移至液氮中保存。实施例3一种人羊膜间充质干细胞冻存液，由以下原料组成：dmem/f12培养基、二甲基亚枫、普鲁兰多糖、视黄醇结合蛋白、泡叶藻提取物、γ-谷维素、茶多酚。其中dmem/f12培养基和二甲基亚砜的体积比为100:1.5，普鲁兰多糖、视黄醇结合蛋白、泡叶藻提取物、γ-谷维素、茶多酚在冻存液中的浓度分别为：普鲁兰多糖2.5mg/ml、视黄醇结合蛋白8.7μg/ml、泡叶藻提取物2.3mg/ml、γ-谷维素12.0μg/ml、茶多酚18.0μg/ml。一种人羊膜间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：向dmem/f12培养基中加入二甲基亚砜、泡叶藻提取物、γ-谷维素、茶多酚，加入p5代人羊膜间充质干细胞，每毫升培养基中加入细胞1.5×107个，在6℃预冷10min，再加入普鲁兰多糖、视黄醇结合蛋白，在-40℃下预冻2h，最后以3℃/min的速率降温至-80℃，在-80℃冻存3h，完成后转移至液氮中保存。对比例1对比例1提供一种人羊膜间充质干细胞冻存液，和实施例1的区别为省去普鲁兰多糖，其余均和实施例1相同。对比例2对比例2提供一种人羊膜间充质干细胞冻存液，和实施例1的区别为省去视黄醇结合蛋白，其余均和实施例1相同。对比例3对比例3提供一种人羊膜间充质干细胞冻存液，和实施例1的区别为省去泡叶藻提取物，其余均和实施例1相同。对比例4对比例4提供一种人羊膜间充质干细胞冻存液，和实施例1的区别为省去γ-谷维素，将茶多酚的用量调整为27.5μg/ml，其余均和实施例1相同。对比例5对比例5提供一种人羊膜间充质干细胞冻存液，和实施例1的区别为省去茶多酚，将γ-谷维素的用量调整为27.5μg/ml，其余均和实施例1相同。对比例6对比例6和实施例1的冻存方法不同，对比例6的冻存方法为：向dmem/f12培养基中加入二甲基亚砜、泡叶藻提取物、γ-谷维素、茶多酚、普鲁兰多糖、视黄醇结合蛋白，加入p3代人羊膜间充质干细胞，每毫升培养基中加入细胞1.0×107个，在4℃预冷15min，在-40℃下预冻1h，最后以2℃/min的速率降温至-80℃，在-80℃冻存2h，完成后转移至液氮中保存。实施例1至3、对比例1至6中的细胞在液氮中分别冻存1个月、3个月和6个月后取出进行复苏，每次取三管，在37℃的水浴中迅速复苏，用台盼兰染色进行细胞计数（重复三次计数），计算细胞存活率，结果如表1所示。表1样品冻存前细胞存活率（%）冻存1个月存活率（%）冻存3个月存活率（%）冻存6个月存活率（%）实施例199.3295.8793.2492.89实施例299.1495.3293.0992.85实施例398.9095.0492.9992.03对比例198.9580.3276.4170.56对比例299.2182.3478.8772.45对比例399.3283.7379.4974.52对比例498.7384.1080.2175.22对比例599.1583.8979.8574.20对比例699.1184.3280.6475.31由表1可以看出，实施例1至3中冻存后复苏的细胞存活率高于对比例1至5，对比例1至5和实施例1的区别为调整了冻存液的组成，由此可知，本发明的冻存液中通过添加普鲁兰多糖，利用其成膜性较好的特点，在低温冻存前在细胞表面形成保护膜，降低细胞冻存过程中产生的冰晶对细胞带来的损伤，同时结合视黄醇结合蛋白可以有效减小冻存过程中形成冰晶的尺寸，进一步降低在冻存过程中细胞外冰晶对细胞造成的损伤。添加泡叶藻提取物、γ-谷维素、茶多酚，一方面清除冻存过程产生的自由基，具有抗氧化的效果，另一方面，使细胞保持活性，有助于提高细胞复苏的存活率，上述组分在细胞冻存过程中协同作用，无需添加外缘源血清，在降低二甲基亚枫用量的用时，保证冻存后细胞活性，复苏后的细胞存活率高。对比例6中调整了冻存过程，直接将p3代人羊膜间充质干细胞加入至冻存液中，然后进行降温，冻存后细胞的存活率低于实施例1，实施例1采用先取部分冻存液成分混合，加入p3代人羊膜间充质干细胞，然后再加入剩余成分，冻存的细胞复苏后存活率较高，这是因为实施例1在冻存过程中先加入二甲基亚砜、泡叶藻提取物、γ-谷维素、茶多酚，其中二甲基亚枫可以渗透至细胞内部，减少细胞内冰晶的形成，泡叶藻提取物、γ-谷维素、茶多酚帮助细胞保持活性，随着温度的降低再加入普鲁兰多糖、视黄醇结合蛋白，降低细胞外冰晶对细胞造成的损伤，采用上述冻存方法，有助于人羊膜间充质干细胞保持活性，复苏后细胞存活率较高。上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。当前第1页12