本发明涉及新型农药组合物技术领域，具体提供了一种特定分子量水溶性壳聚糖和噻霉酮复配的杀菌组合物及其应用。
背景技术：
壳聚糖(chitosan)又称脱乙酰甲壳素，是自然界中唯一的碱性多糖，来源广泛。壳聚糖是氨基葡萄糖与n-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成的阳离子生物多糖，脱乙酰度一般在85％以上。国内外研究表明，壳聚糖除了能够诱导作物产生系统抗性之外，还对多种植物致病性微生物具有明显的抑制或杀灭作用，壳聚糖的抑菌能力与致病菌种属、壳聚糖分子量及脱乙酰度等密切相关。21世纪以来，壳聚糖及其衍生物作为新型抗菌剂受到人们的重视，研究发现其可能的抗菌机理主要包括四种：(1)壳聚糖(或壳寡糖)具有带正电荷的游离氨基，正电荷与病菌细胞膜表面的负电荷相结合而阻碍病菌的增殖，从而起到抑菌作用；(2)壳聚糖(或壳寡糖)使病菌细胞膜的通透性增加造成胞内物质流失，导致细胞活力减弱或死亡；(3)高分子量壳聚糖在病菌细胞表面形成致密外膜，阻止营养物质进入细胞，导致细胞死亡；(4)低分子量壳聚糖(壳寡糖)进入病菌细胞内部，与胞内染色体等物质结合，干扰细胞正常代谢，从而起到抑菌作用。
噻霉酮对植物细菌性角斑病、溃疡病等病害有较好的防治效果，但长期、单独使用噻霉酮杀菌剂，容易使病菌产生抗药性。据报道，壳聚糖、壳寡糖与细菌、真菌化学合成杀菌剂组合使用时具有协同增效作用，能够有效降低杀菌剂用量，克服或延缓杀菌剂的抗药性。同时，壳聚糖能够诱导农作物产生抗性，提高农作物产量。但传统概念的壳聚糖只溶于稀酸，且分子量很大，极大限制了其应用范围和效果。研究表明，只有当壳聚糖的分子量降到一定范围时，更多的生物活性才能显现出来，也更有利于作物的吸收利用，而分子量较低时，如壳寡糖，其促生长作用更好，但是杀菌效果次之。因此，如何获得一种特定分子量水溶性壳聚糖与噻霉酮组合产品来填补本领域的空白，成为本领域技术人员亟待解决的问题之一。
技术实现要素：
本发明针对上述技术存在的不足，提供一种特定分子量水溶性壳聚糖和噻霉酮复配的杀菌组合物及其应用，本发明采用专一性酶制得10～300kda的一系列特定粘均分子量的水溶性壳聚糖，再根据抑菌试验结果筛选出抑菌效果突出的10kda～60kda目标壳聚糖作为复配增效成分，该复配杀菌组合物中有效成份重量百分比为2％～50％，特定分子量水溶性壳聚糖和噻霉酮的重量比为1：20～5：1，可加工成为水悬浮剂、微乳剂、可溶性粉剂、可湿性粉剂、水分散颗粒剂，在其有效浓度下，对姜瘟病原菌和黄瓜角斑病原菌等多种植物病原菌具有良好的抑菌、杀菌效果，且减少了噻霉酮的使用量，实现了化学药剂的减量增效，同时可促进农作物生长，提高农作物抗性、产量及农产品安全。
与现有技术相比，本申请的最大特点就是筛选出了最佳的特定分子量水溶性壳聚糖，然后将其与噻霉酮复配，现有技术中虽然也有采用壳寡糖与噻霉酮复配的技术方案，但是其抑菌效果和生物活性难以令人满意，因此发明人摒弃了现有技术中酸溶性壳聚糖和壳寡糖，选用了特定分子量的水溶性壳聚糖作为原料，获得了意想不到的技术效果，其抑菌效果及其他生物活性均优于酸溶性壳聚糖和壳寡糖。
目前，壳聚糖或壳寡糖的作用机理主要包括四种，如前所述；
噻霉酮的杀菌作用机理主要包括两种：(1)破坏病菌细胞核结构，导致细胞衰竭死亡；(2)干扰病菌细胞的新陈代谢，使其生理紊乱，最终导致死亡。
因此本发明的技术方案中，特定分子量的水溶性壳聚糖除了与壳寡糖有相同的抑菌或杀菌作用机理外(与噻霉酮杀菌机理相似)，还可以在病菌细胞表面形成致密外膜，进而杀死病菌，这也是噻霉酮功效的补充，因此，协同增效效果更好。
本发明提供的具体技术方案是：
一种特定分子量水溶性壳聚糖和噻霉酮复配的杀菌组合物，其中特定分子量水溶性壳聚糖和噻霉酮为有效成分，有效成份重量百分比为2％～50％，特定分子量水溶性壳聚糖和噻霉酮的重量比为1：20～5：1；
其中所述的特定分子量水溶性壳聚糖选自分子量为10kda～60kda的壳聚糖，经过检测，上述分子量的壳聚糖，其抑菌活性明显优于壳寡糖，水溶性明显优于传统概念的壳聚糖，具体可参考下述实验实施例1和表1的内容；
上述杀菌组合物，一方面可以提高噻霉酮对植物病原细菌的抑菌、杀菌活性，减少化学药剂使用量，绿色、安全、环保；另一方面，增加了产品免疫诱抗的功能。本发明具有药肥双重功效，对农产品安全及绿色农业发展具有重要意义，具体可参考下述发明内容中表3的相关数据；
进一步的，发明人提供了所述的有效成份重量百分比为3.5～15％，特定分子量水溶性壳聚糖和噻霉酮的重量比为1：10～4：1；
具体应用时，可选的剂型是水悬浮剂、微乳剂、可溶性粉剂、可湿性粉剂、水分散颗粒剂中的任意一种，所需要的助剂均为本领域的常规助剂，发明人在此不再赘述；应用时，当有效终浓度1.0ppm以下，对姜瘟病原菌和黄瓜角斑病原菌就具有很好的杀菌效果。
综上所述，本发明将特定分子量的水溶性壳聚糖和噻霉酮组合，不仅发挥了壳聚糖的特殊功能，增加了免疫诱抗功能，而且提高了噻霉酮对植物病原细菌的杀菌活性，减少其使用量，提高了农产品的安全及产量。同时，较低用量的壳聚糖即可起到协同增效作用，避免了壳聚糖单独使用用量大、成本高的问题，为壳聚糖在农业领域的广泛应用提供了理论依据。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成。
实施例16％噻霉酮·水溶性壳聚糖水悬浮剂
各组分含量(按重量百分比计)分别为噻霉酮3％，特定分子量水溶性壳聚糖3％，硅酸镁铝2％，黄原胶0.2％，萘磺酸盐分散剂5％，乙二醇5％，加蒸馏水补足至100％。将上述各种物质充分混合后，经胶体磨初磨，再经砂磨机研磨3-5小时，使物料粒径均达到5μm以下，即获得成品制剂。
效果实验实施例1
不同分子量水溶性壳聚糖对植物病原细菌的抑菌效果筛选
试验药剂：分子量分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300kda的水溶性壳聚糖；
对照药剂：壳寡糖、市售酸溶性壳聚糖；
供试菌：姜瘟病原菌、黄瓜角斑病原菌；
菌种活化：选取姜瘟病原菌和黄瓜角斑病原菌两种细菌为抑菌对象，将50mllb种子培养基(现有培养基)加入到250ml三角瓶中，接种一环保存于4℃的细菌斜面种子，160r/min，37℃培养过夜。
细菌最适浓度筛选：
取1ml活化好的菌液加入到9ml无菌水中，依次稀释6个梯度，取稀释后的菌液100μl均匀涂布于固体lb培养基的平板上，37℃下培养过夜，根据平板菌落数找出用作抑菌试验的最适菌液浓度。
抑菌效果及最低抑菌浓度测定：
分别配制含不同重量百分比的各壳聚糖样品的lb固体培养基，充分震荡均匀后，倒平板，并做好标记。以不加任何样品的lb培养基作为空白对照，含有不同浓度壳寡糖和市售酸溶性壳聚糖的lb培养基为阳性对照。分别取浓度1.5*106cfu/ml的姜瘟病原菌和黄瓜角斑病原菌菌液100μl均匀涂布于平板上，每个处理三个重复，37℃下培养，培养24h，分别计数。比较抑菌效果，筛选出抑菌效果较好的特定分子量壳聚糖，确定其最低抑菌浓度。结果见表1和表2。
最低抑菌浓度mic(minimuminhibitoryconcentration)，是指在特定环境下孵育24小时后，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最低抑菌浓度。
最低杀菌浓度mbc(minimumbactericidalconcentration)，即杀死99.9％的供试微生物所需的最低药物浓度。
表1不同分子量水溶性壳聚糖抑制效果
由表1可知，终浓度为0.03％或0.04％时，不同分子量水溶性壳聚糖抑菌效果差异较大，与酸溶性壳聚糖(传统概念的壳聚糖)和壳寡糖相比，对姜瘟病原菌和黄瓜角斑病原菌抑制效果均较好的为分子量10kda～60kda水溶性壳聚糖。
表2不同分子量水溶性壳聚糖最低抑菌浓度和最低杀菌浓度
分子量10kda～60kda水溶性壳聚糖的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度如表2所示，可见抑菌效果最好的为50kda水溶性壳聚糖。
效果实验实施例2
特定分子量水溶性壳聚糖和噻霉酮组合物杀菌效果
试验药剂：分子量50kda水溶性壳聚糖：噻霉酮＝1：10
对照药剂：中生菌素、酸溶性壳聚糖+噻霉酮组合物、壳寡糖+噻霉酮组合物
供试菌：姜瘟病原菌、黄瓜角斑病原菌
杀菌效果测定：分别配制含不同浓度组合物的lb固体培养基，充分震荡均匀后，倒平板，并做好标记。以不加任何样品的lb培养基作为空白对照，含有不同浓度噻霉酮(见表3)和中生菌素的lb培养基为阳性对照；取适当浓度的姜瘟病原菌或者黄瓜角斑病原菌菌液2μl点于平板上，每点细菌数约为1.5*104cfu，形成直径为5～8mm的菌斑。每个处理两个重复，37℃下培养，培养48h，以菌斑生长情况为依据，比较杀菌效果。结果见表3。
表3特定分子量水溶性壳聚糖和噻霉酮组合物杀菌效果
表4特定分子量水溶性壳聚糖与噻霉酮协同增效作用
由表3和表4可知，特定分子量水溶性壳聚糖和噻霉酮组合物杀菌效果及协同增效效果明显，mic/mbc较单独使用噻霉酮下降20％以上，有助于减少农药用量。