一种裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物的制备方法与流程

本发明涉及生物技术领域，更具体地说是涉及一种裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物的制备方法及其应用。

背景技术：

金属单质纳米银的粒径大多在25-50nm之间，是尺寸在原子簇与宏观微粒之间的一类纳米颗粒。作为一种纳米材料，纳米银具有许多的优点及特性：尺寸小、化学结构独特、比表面积较大，因此纳米银有宏观量子隧道效应、表面效应和量子尺寸效应等，广泛应用于制作电子元件的电极原料、低温导热材料、太阳能电池、抗菌材料和光学材料等。近年来，纳米银(agnps)逐渐在医药领域被广泛使用，主要归因于其是一种有较高抗菌活性且不易产生细菌耐药性的新型抗菌剂。通过多种手段，目前已经能够制备具有规则外形和良好分散性能的纳米银颗粒，比如物理法，主要有激光烧灼法和真空冷凝法；化学法，主要包括化学还原法和微乳液法；生物法主要指天然材料制备法和微生物体系法。其中，化学法是目前研究纳米银合成领域所使用到的最重要的方法，此方法的优势在于工艺简单易操作、合成过程较易控制，最重要的是，此法制备出的纳米银粒子形貌可调控，易得粒径较小、形态各异的具有面心立方体结构的纳米银。当然，生物方法同样适用于制备纳米银。生物法通常是直接利用植物体、微生物本身或者从植物体中提取的汁液、微生物培养上清液等制备纳米银，这种方法得到纳米银，稳定性较高，生物相容性也很好。

裸花紫珠callicarpanudiflorahooketarn.是马鞭草科(varbenaceae)紫珠属(callicarpa)植物，常以干燥叶和带叶嫩枝入药，最早收录于1977年版的《中国药典》，也是《中国药典》2015年中增补本收录的品种，主要分布在中国海南的黎族地区(五指山，白沙)、广东和广西等地，是海南省道地药材。裸花紫珠的主要成分有黄酮类、苯乙醇苷类、有机酸类等多种化合物。现代药理学研究证明,裸花紫珠提取物具有止血、消炎、抑菌、收敛、解毒等功能。其中，苯乙醇苷类化合物是裸花紫珠中一类含量较高，活性多样的成分类别群。

因此，提供一种裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物的制备方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物的制备方法及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物的制备方法，具体步骤如下：

(1)制备裸花紫珠苯乙醇苷提取液；

(2)制备agno3溶液；

(3)制备裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物：

将步骤(1)制备的4mg/ml裸花紫珠苯乙醇苷提取液与步骤(2)制备的1mmol/lagno3溶液按体积比为1∶10混合，在60℃水浴条件下加热90min，得到裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物。

进一步，所述裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物在抑制金黄色葡萄球菌和4种酵母菌(白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌)中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物的制备方法及其在抑制细菌和真菌中的应用；本发明裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物的制备方法稳定、可行，制备得到的复合物对金黄色葡萄球菌和4种酵母菌(白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌)有很好的抑制作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物的最大吸收波长图；

图2附图为本发明3批样品溶液的紫外可见吸收光谱图；

图3附图为本发明裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物不同放大倍数下的tem图；

图4附图为本发明裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物粒径分布图；

图5附图为本发明裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物粒子分布图；

图6附图为本发明裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物电位图；

图7附图为本发明裸花紫珠苯乙醇苷提取物及其纳米银复合物的ir图；

其中，1为裸花紫珠苯乙醇苷部位提取物；2为裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

裸花紫珠药材采自海南省白沙县，经海南医学院药学院曾念开教授鉴定为马鞭草科紫珠属植物裸花紫珠(callicarpanudiflorahooketarn)的干燥地上部分。

实施例1制备裸花紫珠苯乙醇苷提取液

取300g裸花紫珠叶，置10l圆底烧瓶中，加6l水浸泡2h，加热回流提取1h后过滤，滤渣加蒸馏水4.5l回流提取2次，每次1h，过滤，合并3次滤液后浓缩至600ml，加入ztc1+1ii型澄清剂(成分为a、b组分)絮凝澄清(加入量为8％b+4％a、温度为60℃、搅拌速度为100r/min)，澄清液稀释后得到的溶液含有0.25g生药/ml；称取sp-207大孔树脂装柱，按照树脂与药材量比(g/g)1:0.8上样，先以2bv水洗脱，再以2bv30％乙醇洗脱，继续以4bv50％乙醇洗脱，流速为2bv/h，收集得50％乙醇洗脱液，减压浓缩后真空干燥，得裸花紫珠苯乙醇苷提取物(12.4g)。经hplc测定，该部位中连翘酯苷b、异毛蕊花糖苷和毛蕊花糖苷之和为63％，经uv检测，该提取物中苯乙醇总苷的含量为77％。

精密称取裸花紫珠苯乙醇苷提取物100mg，加水溶解后，过滤得滤液，放置到25ml量瓶中，再用蒸馏水定容到刻度线，得到4mg/ml裸花紫珠苯乙醇苷提取液，4℃条件下保存备用。

实施例2制备agno3溶液

精密称取0.425gagno3，用蒸馏水溶解后置于25ml量瓶中定容，得到100mmol/lagno3溶液储备液。制备裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物时，根据所需不同浓度的agno3溶液，再用蒸馏水将其稀释不同的倍数。

实施例3制备裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物

采用实施例1的方法制备4mg/ml裸花紫珠苯乙醇苷提取液；采用实施例2的方法制备100mmol/lagno3溶液，取适量稀释100倍至1mmol/l；取1ml4mg/ml裸花紫珠苯乙醇苷提取液与10ml1mmol/lagno3溶液混合，60℃水浴条件下加热90min，得到裸花紫珠苯乙醇苷-纳米银复合物。利用紫外-可见分光光度计测定其在300～800nm吸收光谱，记录其最大吸收波长，结果见图1。图1结果显示，裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物的最大吸收波长为420nm。

实施例4重复性试验

制备3份裸花紫珠苯乙醇苷提取液，在60℃条件下分别与1mmol/lagno3溶液按一定体积比混合，静置反应90min，用适量的蒸馏水稀释后得裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物，用紫外可见分光光度计测定其在300～800nm的吸收情况，3批样品溶液的紫外可见吸收光谱图见图2。图2结果显示，3批裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物溶液的吸收曲线并无明显区别；表明本发明制备工艺的稳定性和重复性良好。

实施例5裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物的表征方法

(1)透射电子显微镜(tem)表征法

取少量实施例3制备的裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物溶液，滴加到铜网上，干燥后使用tecnai12型透射电镜，调整合适的放大倍数，观察纳米银复合物的外观形貌和粒径分布，并测量所得纳米银复合物的平均粒径。裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物不同放大倍数下的tem图见图3。由图3可见，通过调整不同放大倍数，得4幅透射电镜图，测得裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物的平均粒径为26nm；且观察发现，不同纳米银黑色粒子外包裹有灰色物质，该物质可能是键合在纳米银表面的裸花紫珠的有效成分。

(2)粒径分析法

吸取1ml实施例3制备的裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物溶液，放于粒径专用比色皿中，用omni高灵敏度zeta电位及粒度分析仪测定所得纳米银的粒度分布；再用malvernzs90纳米粒径电位分析仪测定所得纳米银的电位；结果见图4-图6。由图4-图6可见，在60℃条件下，裸花紫珠苯乙醇苷提取液与1mmol/lagno3溶液按照1∶10体积比混合时，还原制得的裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物较稳定，主要粒径范围为3.50～29.22nm，zeta电位为-15.1mv。

(3)傅立叶变换红外光谱分析法(ftir)

将裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物及苯乙醇苷部位提取物，与kbr按质量比1:100-200混匀，压片，在4000.00～400.00cm^-1处进行红外光谱扫描，比较二者红外光谱吸收峰，考察裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物生成后吸收峰强弱及峰位的变化，结果见图7。图7结果显示，在4000.00～400.00cm^-1的范围内有不同化学键伸缩振动而引起的吸收峰；与裸花紫珠苯乙醇苷提取物红外光谱进行比对，其生成纳米银复合物后1083cm^-1的吸收峰消失，说明裸花紫珠的伯醇的羟基可能与银发生配位反应。

实施例6裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物的抑制细菌效果

(1)菌种培养：于超净工作台，取试管菌种斜面(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)，挑取一环接种于营养肉汤培养基，置摇床150r/min，37℃培养24h。用接种环取菌悬液划线，接种于营养琼脂培养基，培养24h，连续传代。

(2)菌悬液制备：于超净工作台，取吸管吸取5ml无菌生理盐水，反复洗吹菌种第四代营养肉汤培养基，洗下菌苔。转移洗下的菌液，加生理盐水稀释菌悬液浓度至10⁵cfu/ml，4℃保存待用，4h内使用。

(3)牛津杯抑菌法

将事先配好的琼脂培养基煮融，稍冷却后放到恒温箱中，60℃恒温2-3h。把琼脂培养基放到恒温箱后开超净工作台的紫外线杀菌20min。灭菌前把经过高压灭菌的牛津杯、镊子、培养皿、移液枪等需用的工具放进工作台，紫外线可以将表面的菌杀死。将琼脂培养基置于工作台上，摇匀，然后倒平板，待培养基凝固成型，均匀涂上菌液。马上用镊子将牛津杯竖直插入到培养基上面，静置。用移液枪分别吸取200μl稀释好的裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物，裸花紫珠提取液，硝酸银溶液到牛津杯的孔中。做好标记，将培养皿放到恒温箱中培养48h，观察抑菌情况。如果溶液有抑菌活性，牛津杯周围会形成一个透明圈，用直尺量直径并记录。3种溶液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径见表1。

表13种溶液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径

牛津杯抑菌法(大肠杆菌48h)未观察到明显的抑菌圈。

上述效果表明，裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物对于革兰氏阳性菌抑制效果更显著。

(4)裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银提取物的最小抑菌浓度

第1孔至第10孔加入100μl稀释的裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物：按原液(浓度为2mg/ml)稀释0、5、10、20、40、80、160、320、640、1280倍(对半稀释)，和100μl金黄色葡萄球菌菌液(菌悬液浓度为10⁵cfu/ml)；第11孔为阴性对照，加100μl金黄色葡萄球菌菌液(菌悬液浓度为10⁵cfu/ml)和100μl肉汤；第12孔为空白对照，只加200μl肉汤，共加4排。用涡旋混匀器混匀；密封后置37℃恒温培育箱中，培育48h后用多功能酶标仪测定。测定结果见表1。

表1抑菌活性吸光度值测定结果(600nm48h)

注：平均差值为纳米银复合物不同稀释倍数的吸光度平均值与空白平均值的差。

以培养48h后各孔吸光度减去对应空白板各孔吸光度得差值，将阴性对照组的平均差值计为100％的生长率，其值的1/2计为50％的抑制率，实验组中平均差值最接近50％抑制率的对应浓度计为该药液的mic值。根据测定结果，mic值为0.1mg/ml。

实施例7裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物的抑制真菌效果

4种酵母菌:白假丝酵母菌(candidaalbicans，ca)、热带假丝酵母菌(candidatropicalis，ct)、克柔假丝酵母菌(candidakrμseis，ck)、近平滑假丝酵母菌(candidaparapsilosis，cp)，由海南医学院科学实验中心提供。

(1)mh琼脂培养皿的制备：称取mh琼脂36g，溶解于1l超纯水中，121℃高压灭菌15min，冷至50～60℃，倾入无菌培养皿，放冷置4℃冰箱保存备用；供培养用mh琼脂培养皿中在配制时另取20g葡萄糖与mh琼脂一同溶解于1l超纯水中，121℃高压灭菌15min，冷至50～60℃，倾入无菌培养皿，制成含2％葡萄糖的mh琼脂培养皿，放冷置4℃冰箱保存备用。

(2)工作用菌的准备：取各供试菌菌种，划线于2％葡萄糖的mh琼脂培养基平面第一次活化，置37℃培养箱培养48h后刮取单菌落划菌于2％葡萄糖的mh琼脂培养基平面进行二次活化，置37℃培养箱培养培养48h后作为工作用菌，置4℃冰箱保存备用。

(3)菌悬液的配制：采用麦氏比浊法，量取4.9ml1％硫酸溶液和0.1ml0.5％氯化钡溶液入试管中充分混匀制成0.5#麦氏比浊管，用时新制；刮取工作用菌落，用无菌生理盐水配制成与0.5#麦氏比浊管浊度相近的溶液，即得近似浓度为1.5×10⁸cfu/ml的菌悬液，用时新制。配制均在无菌条件下进行。

(4)纸片扩散法抑菌试验

①试液准备：取裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物加水稀释至浓度为2mg/ml的溶液；称取裸花紫珠苯乙醇苷提取物，溶解于10.0ml超纯水中摇匀，配制成浓度为2mg/ml的溶液；作为抑菌溶液，置于4℃冰箱中贮存，备用。再精密称取毛蕊花糖苷对照品20mg置10ml量瓶中，超纯水溶解并定容，得2mg/ml的对照品药液，4℃冰箱贮存，备用。

②纸片的制备：将粗滤纸制成直径6mm的圆型纸片，置西林瓶中，封口121℃高压灭菌20min，干燥，密封保存。

③试验分为4组，分别为毛蕊花糖苷阳性对照组、超纯水空白组、裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物组、裸花紫珠苯乙醇苷提取物组。无菌条件下，取mh琼脂培养皿加菌悬液300μl，涂布均匀，吸出多余菌液，放置片刻，夹取圆形纸片，展平，置于培养皿中央，轻轻按压，吸取药液10μl滴加于纸片中央，盖上培养皿，做好标记，37℃培养，48h后观察并记录抑菌圈直径，每组重复3次。结果见表2。

表2裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物对4种真菌的抑菌圈(mm)

纸片法试验结果表明，裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物对4种假丝酵母菌均具有敏感性，对ck表现出高度敏感性，对其他3种酵母菌(ca、ct、cp)表现为中敏感性。

(5)微量稀释法抑菌试验

①rpmi-1640培养基的制备：分别称取10.4grpmi-1640，34.5gmops，2.0gnahco3，置1000ml容量瓶中，加超纯水适量使溶解，以1mol/lnaoh调节培养基ph至7.0±0.1，超纯水定容至刻度。无菌条件下，以0.22μm微孔滤膜滤过，置4℃冰箱中保存，备用。

②试液的准备：临用前新配，分别精密称取裸花紫苯乙醇苷提取物及裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物，按生药量计算，分别以超纯水配制成4096μg/ml的药液，高压灭菌后分别用rpmi-1640液体培养基进行对倍稀释配制，得浓度为2048μg/ml，1024μg/ml，512μg/ml，256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml，16μg/ml，8μg/ml，4μg/ml的药液；再精密称取毛蕊花糖苷对照品以超纯水配制成浓度为1024μg/ml的药液，高压灭菌后用rpmi-1640液体培养基对倍稀释得浓度为512μg/ml，256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml，16μg/ml，8μg/ml，4μg/ml，2μg/ml，1μg/ml的毛蕊花糖苷对照品溶液，放入离心管架中，置4℃冰箱保存备用。

③菌悬液分两步稀释1000倍作为试验用菌液，试验设置分为毛蕊花糖苷阳性对照组，裸花紫珠苯乙醇苷提取物组、裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物组、空白组及阴性对照组，无菌条件下，取96孔板按组别分别加入相应溶液，其中毛蕊花糖苷组、裸花紫珠苯乙醇苷提取物组组及裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物组分别加入先前配制好的相应药液100μl及100μl试验用菌液，空白组加入200μlrpmi-1640液体培养基，阴性对照组加入100μlrpmi-1640液体培养基及100μl试验用菌液，加好药液和菌液后，适度振摇均匀，用多功能酶标仪在波长为450nm条件下进行测定，记录数据为空白板吸光度，放入37℃培养箱中培养48h后再进行测定，记录数据为培养48h后吸光度，计算mic值。

④mic的计算：以培养48h后各孔吸光度减去对应空白板各孔吸光度得差值，将阴性对照组的平均差值计为100％的生长率，其值的1/2计为50％的抑制率，实验组中平均差值最接近50％抑制率的对应浓度计为该药液的mic值。结果见表3。

表3裸花紫珠苯乙醇苷提取物-纳米银复合物对4种真菌的mic浓度(μg/ml)

微量稀释法试验结果表明，裸花紫珠苯乙醇醇苷纳米银复合物对4种假丝酵母菌均具有较为明显的抑制作用，其中对ca及ct的mic值为32μg/ml和64μg/ml，对ck及cp的mic值为128μg/ml。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。