本发明属于植物离体无性繁殖技术领域，具体涉及一种铁冬青茎段组织培养方法。
背景技术：
铁冬青(ilexrotunda)为冬青科(ilex)冬青属(holly)常绿乔木或灌木，又名：救必应，龙胆仔、白沉香，高5～20米，胸径达1米；铁冬青树叶厚而密，能形成阴蔽的环境，花果由黄转红，又能产生多层次丰富景色的效果，十分可爱，是理想的园林观赏树种，采取老桩或抑制生长使其矮化，也是制作盆景的好树种。药用部位为树皮或根皮，中药名称救必应，具有清热解毒，利湿，止痛功效，可治感冒发热，扁桃体炎，咽喉肿痛，急慢性肝炎，急性肠胃炎，胃及十二指肠溃疡，风湿关节痛，跌打损伤，汤火伤，是多种中成药的原料，临床上常用于治疗心血管疾病及多种感染性疾患。枝叶作造纸糊原料，树皮可提制染料和栲胶，果实可提取果红色素；木材作细工用材。用火烧叶子，不燃烧会形成黑色圆圈，故可做防火树种。铁冬青为亚热带树种,喜湿润肥沃、排水良好的酸性土壤，适应性较强，耐阴，耐瘠，耐旱，耐霜冻，极具发展前景。
铁冬青繁育的主要方式有播种育苗、扦插育苗和组织培养。刘济详等人报道，采种后种子用湿沙低温储藏一年，铁冬青种子育苗时间长，难以在短时间繁殖大量苗木。温美霞等人报道铁冬青扦插研究，铁冬青为较难生根树种,生根类型为皮部和愈伤组织混合生根，采用当年生半木质化插条,以黄心土为基质,进行低浓度长时间生根剂处理能有效提高铁冬青扦插生根率。通过组织培养获得再生植株，是有效解决铁冬青种苗繁殖的有效途径。国内研究铁冬青组织培养的报道较少，严荣斌等以3a生铁冬青茎段为外植体,探讨不同培养基对铁冬青芽诱导和增殖效果，结果表明：铁冬青采用ms+6-ba1ml/l+iaa0.2ml/l诱导,萌芽天数12天，萌芽条数2，增殖培养基采用1/2ms+6-ba1.5ml/l+iaa0.5ml/l，增殖系数为3.3。杨灿等用红果冬青新出枝条嫩芽为外植体，增殖系数为4.1，生根率达90％。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种铁冬青茎段组织培养方法，该方法可以大大提高继代增殖系数，且无菌苗健壮，生根率高，确保种苗优良性状。
本发明提供的技术方案是一种铁冬青茎段组织培养方法，包括以下步骤：
1)外植体获取：取半木质化枝条消毒，切成茎段，备用；
2)芽诱导：将茎段接种到芽诱导培养基中培养得到出不定芽丛或单芽；所述芽诱导培养基包括以下组分：改良b1培养基、6-ba0.2～0.4mg/l、naa0.1～0.2mg/l、ga30.1mg/l、蔗糖30g/l，琼脂粉4.2g/l，ph5.8；
3)芽增殖：将不定芽丛或单芽剪下，接种到芽增殖培养基中，得到无菌苗；所述芽增殖培养基包括以下组分：改良b1培养基、6-ba0.4～0.8mg/l、naa0.2～0.4mg/l、ga30.1mg/l、活性炭0.1～0.2g/l、蔗糖30g/l，琼脂粉4.2g/l，ph5.8；
所述改良b1培养基以1l计，包含以下组分：
步骤1)中半木质化枝条可以是铁冬青树上直接摘取的半木质化枝条；也可以是从树上摘取的硬枝条(完全木质化)，由于完全木质化硬枝条无法直接培养，需要进行扦插培养，从而获取半木质化枝条。
半木质化枝条的获取方法为：将铁冬青完全木质化的硬枝条剪成插条，插条浸泡在600～800mg/l的abt溶液0.5～1h，然后将其扦插到装有基质的营养袋中，扦插基质由黄心土、泥炭土和沙组成，其重量比为2：2：1。在温度15～25℃、相对湿度60％～80％下，先在光照强度500～2000lux、每天光照12～14h下培养10～15d，待扦插枝条有新芽长出后，保湿温度湿度不变，提高光照强度至2000～6000lux、每天光照12～14h，继续培养10～20d，即得半木质化枝条。
步骤2)中，所述芽诱导培养条件为：先暗培养7～10d至腋芽萌出，然后置于100～500lux、每日光照10～12h下培养7d，再置于500～5000lux、每日光照10～12h下继续培养10～15d。
步骤3)中，所述芽增殖培养条件为：先置于光照强度500～1000lux、每日光照10～12h下培养5～7d后，再置1000～5000lux、每日光照10～12h下继续培养10～15d。
还包括生根培养步骤，所述生根培养是将无菌苗在20～50mg/l的abt溶液中速蘸1～5s，然后接种到生根培养基上培养，得到生根苗；所述生根培养基包括以下组分：1/2改良b1培养基、abt0.6～0.9mg/l、naa0.2～0.3mg/l、活性炭0.1～0.2g/l、蔗糖20g/l、琼脂粉4.5g/l、ph5.8。
所述生根培养条件为：先置于光照强度100～500lux、每日光照10～12h下培养5～7d，待无菌苗的切口开始长根后，再置于2000～5000lux、每日光照10～12h下培养5～8d。
还包括炼苗，将生根苗移至炼苗棚中，在温度15～30℃，光照强度5000～10000lux，每天光照12～14h，炼苗时间为5～7d。
还包括移栽，将炼苗后的生根苗从炼苗棚中移出，用清水洗去小苗根系的培养基，然后将苗移栽至装有基质的育苗袋内，移栽基质由黄心土、泥炭土和沙组成，其重量比3：5：2；移栽在育苗棚内进行，移栽后要浇透水，用薄膜覆盖保温保湿，10d后逐步通风，20d后移除薄膜。
与现有技术相比，本发明具有以下效果：
1、本发明取材多年生铁冬青良种大树，采用硬枝条作外植体进行组培育苗，难以直接诱导出不定芽，通过将枝条基部浸泡浓度abt溶液,扦插培养后获得半木质化枝条是一种有效外植体，带菌比较少，消毒处理后获得的无菌芽的成功率比较高，无菌芽诱导率达92.7％，萌芽天数7d，萌芽条数2～3条，污染率较低，仅为15.2％。
2、本发明选芽诱导培养基，由改良的b1培养基和生长调节剂6-ba、naa、ga3组成，能在较短的周期内(24～32d)诱导铁冬青的带腋芽茎段分化出有效不定芽，茎段基部无异常愈伤组织产生，通过这种以芽繁芽途径获得的不定芽能有效避免继代增殖过程中出现的变异，更好地保持母株原有的优良性状。
3、本发明选用不定芽继代增殖培养基，由改良的b1培养基和生长调节剂6-ba、naa、ga3组成，因对b1培养基进行了改良，增加了硝酸铵和七水硫酸镁的用量，继代芽苗叶色浓绿，每株芽苗叶片数达6～10张；分化芽多，芽苗健壮、芽苗高、茎粗，一个继代周期芽苗增殖10倍左右。
4、本发明选用生根培养基，由改良的b1培养基和生长调节剂abt、naa组成；选用生根方法是在无菌苗接入生根培养基前，在已灭菌的浓度20～50mg/l的abt溶液中速蘸1～5秒，再接入生根培养基中培养，出根时间快，10～15d生根率达100％，根系发达，每株苗出根4～10条，根粗0.05～0.1cm，根系质量好，生根过程中无愈伤组织形成，为皮部生根，移栽成活率较高，可达98％。诱导生根较困难的植物，生根诱导一般采用二步生根法，第一步，接种在较高浓度生长素的培养基暗培养3～5d，第二步，移入无激素的培养基中发根，整个过程需配2次培养基，培养时间长。本发明选用生根方法是在无菌芽苗接入生根培养基前，在已灭菌的浓度20～50mg/l的abt溶液中速蘸2秒，再接入生根培养基中培养，整个过程只需配1次培养基，培养时间短。
具体实施方式
以下实施例对本发明进行进一步阐述，但不作为对本发明的限定。
下述实施例以及对照例中所述的改良b1培养基，以1l计，包含以下组分：
实施例1
1)外植体获取：选取多年生铁冬青优良单株硬枝条(完全木质化)，剪成25～30cm长的插条。将插条基部浸泡在浓度600mg/l的abt溶液0.5h，然后将插条扦插在装有基质的营养袋中，基质由黄心土、泥炭土和沙组成，其重量比为2：2：1；在温度15℃、相对湿度60％，光照强度500lux、每天光照12h下，培养10d，扦插枝条有新捎长出，维持温度湿度以及每日光照时间长不变，提高光照强度至2000lux，继续培养10d，新梢伸长至10～20cm的半木质化枝条。将半木质化枝条用洗洁精清洗后，自来水冲洗干净，在超净工作台上将木质化枝条用0.1％hgcl2溶液消毒6min，无菌水冲洗3次，再用0.1％hgcl2溶液消毒6min，无菌水冲洗3～5次，在无菌条件下切成1～1.5cm长的带1～2个芽的茎段。
2)芽诱导：将茎段接种到芽诱导培养基中，先暗培养7d至腋芽萌出，然后置于在100lux、每日光照10h下培养7d，再置于500lux、每日光照10h下继续培养10d，分化不定丛芽丛或单芽；所述芽诱导培养基包括以下组分：改良b1培养基、6-ba0.2mg/l、naa0.1mg/l、ga30.1mg/l、蔗糖30g/l，琼脂粉4.2g/l，ph5.8。
3)芽增殖：将不定芽丛或单芽剪下，接种到芽增殖培养基中，先置于光照强度500lux、每日光照10h下培养5d后，再置1000lux、每日光照10h下继续培养10d，得到无菌苗；所述芽增殖培养基包括以下组分：改良b1培养基、6-ba0.4mg/l、naa0.2mg/l、ga30.1mg/l、活性炭0.1g/l、蔗糖30g/l，琼脂粉4.2g/l，ph5.8。
对照例1
重复实施例1，不同的是，步骤2)和步骤3)中，用常规b1培养基代替改良b1培养基。
常规b1培养基，以1l计，包含以下组分：
对照例2
重复实施例1，不同的是，步骤2)和步骤3)中，用常规ms培养基代替改良b1培养基。
常规ms培养基的配方为：
硝酸铵1650mg/l；硝酸钾1900mg/l；磷酸二氢钾170mg/l；七水硫酸镁370mg/l；二水氯化钙440mg/l；碘化钾0.83mg/l；硼酸6.2mg/l；四水硫酸锰22.3mg/l；七水硫酸锌8.6mg/l；二水钼酸钠0.25mg/l；五水硫酸铜0.025mg/l；六水氯化钴0.025mg/l；乙二胺四乙酸二钠37.3mg/l；七水硫酸亚铁27.8mg/l；肌醇100mg/l；维生素b60.5mg/l；维生素b10.1mg/l；维生素b50.5mg/l；甘氨酸2.0mg/l。
对照例3
重复实施例1，不同的是，步骤1)为：
选取多年生铁冬青优良单株嫩枝条，用洗洁精清洗后，自来水冲洗干净，在超净工作台上将木质化枝条用0.1％hgcl2溶液消毒6min，无菌水冲洗3次，再用用0.1％hgcl2溶液消毒6min，无菌水冲洗3～5次，在无菌条件下切成1～1.5cm长的带1～2个芽的茎段。
实施例2
1)外植体获取：选取多年生铁冬青优良单株硬枝条(完全木质化)，剪成25～30cm长的插条。将插条基部浸泡在浓度800mg/l的abt溶液1h，然后将插条扦插在装有基质的营养袋中，基质由黄心土、泥炭土和沙组成，其重量比为2：2：1；在温度25℃、相对湿度80％，光照强度2000lux、每天光照14h下，培养15d，扦插枝条有新捎长出，维持温度湿度以及每日光照时间长不变，提高光照强度至6000lux，继续培养20d，新梢伸长至10～20cm的半木质化枝条。将半木质化枝条用洗洁精清洗后，自来水冲洗干净，在超净工作台上将木质化枝条用0.1％hgcl2溶液消毒6min，无菌水冲洗3次，再用用0.1％hgcl2溶液消毒6min，无菌水冲洗3～5次，在无菌条件下切成1～1.5cm长的带1～2个芽的茎段。
2)芽诱导：将茎段接种到芽诱导培养基中，先暗培养10d至腋芽萌出，然后置于在500lux、每日光照12h下培养7d，再置于5000lux、每日光照12h下继续培养15d，分化不定丛芽丛或单芽；所述芽诱导培养基包括以下组分：改良b1培养基、6-ba0.4mg/l、naa0.2mg/l、ga30.1mg/l、蔗糖30g/l，琼脂粉4.2g/l，ph5.8。
3)芽增殖：将不定芽丛或单芽剪下，接种到芽增殖培养基中，先置于光照强度1000lux、每日光照12h下培养7d后，再置5000lux、每日光照12h下继续培养15d，得到无菌苗；所述芽增殖培养基包括以下组分：改良b1培养基、6-ba0.8mg/l、naa0.4mg/l、ga30.1mg/l、活性炭0.2g/l、蔗糖30g/l，琼脂粉4.2g/l，ph5.8。
实施例3
1)外植体获取：选取多年生铁冬青优良单株半木质化枝条，用洗洁精清洗后，自来水冲洗干净，在超净工作台上将半木质化枝条用0.1％hgcl2溶液消毒6min，无菌水冲洗3次，再用用0.1％hgcl2溶液消毒6min，无菌水冲洗3～5次，在无菌条件下切成1～1.5cm长的带1～2个芽的茎段。
2)芽诱导：将茎段接种到芽诱导培养基中，先暗培养8d至腋芽萌出，然后置于在250lux、每日光照11h下培养7d，再置于2500lux、每日光照11h下继续培养12d，分化不定丛芽丛或单芽；所述芽诱导培养基包括以下组分：改良b1培养基、6-ba0.3mg/l、naa0.15mg/l、ga30.1mg/l、蔗糖30g/l，琼脂粉4.2g/l，ph5.8。
3)芽增殖：将不定芽丛或单芽剪下，接种到芽增殖培养基中，先置于温度26℃、光照强度750lux、每日光照11h下培养6d后，再置3000lux、每日光照11h下继续培养12d，得到无菌苗；所述芽增殖培养基包括以下组分：改良b1培养基、6-ba0.6mg/l、naa0.3mg/l、ga30.1mg/l、活性炭0.15g/l、蔗糖30g/l，琼脂粉4.2g/l，ph5.8。
4)生根培养：剪取生长旺盛，高2～3cm，有4片叶以上的无菌苗在20mg/l的abt溶液中速蘸1s，然后接种到生根培养基上，先置于100lux、每日光照10h下培养5d，待无菌苗的切口开始长根后，再置于2000lux、每日光照10h下培养5d培养，得到生根苗；所述生根培养基包括以下组分：1/2改良b1培养基、abt0.6mg/l、naa0.2mg/l、活性炭0.1g/l、蔗糖20g/l、琼脂粉4.5g/l、ph5.8。
5)炼苗：将生根苗移至炼苗棚进行炼苗驯化，温度15℃，光照强度5000lux、每天光照12h下培养5d。
6)移栽：将生根苗从培养瓶中取出，用清水洗去小苗根系的培养基，然后将小苗移栽至装有基质的育苗袋内，移栽基质选用黄心土：泥炭土：沙：(3：5：2)，移栽在育苗棚内进行，移栽后要浇透水，用薄膜覆盖保温保湿，10d后逐步通风，20d后移除薄膜。
对照例4
重复实施例3，不同的是，步骤4)中，剪取的无菌苗不经速蘸处理，直接接种到生根培养基上。
实施例4
重复实施例3，不同的是，步骤4)为：
剪取生长旺盛，高2～3cm，有4片叶以上的无菌苗在50mg/l的abt溶液中速蘸5s，然后接种到生根培养基上，先置于500lux、每日光照12h下培养7d，待无菌苗的切口开始长根后，再置于5000lux、每日光照12h下培养8d培养，得到生根苗；所述生根培养基包括以下组分：1/2改良b1培养基、abt0.9mg/l、naa0.3mg/l、活性炭0.2g/l、蔗糖20g/l、琼脂粉4.5g/l、ph5.8。
实施例5
重复实施例4，不同的是，步骤5)为：
炼苗：将生根苗移至炼苗棚进行炼苗驯化，温度30℃，光照强度10000lux、每天光照14h下培养7d。
实施例6
将实施例1的无菌苗按照实施例3的方法进行生根培养、炼苗和移栽。
实施例7
将实施例2的无菌苗按照实施例4的方法进行生根培养、炼苗和移栽。
下表为对上述实施例及对比例培育得到继代芽苗及生根苗的性状对比：