专利名称:一种植物诱抗剂的制作方法
本发明涉及微生物技术，特别提供了一种通过微生物发酵结合一定条件下的酶法降解获得具有寡糖等生物活性成分的植物诱抗剂，并应用于大豆、棉花等作物病害防治技术。
活性寡聚糖是一类由2-15个单糖组成，具一定结构和生物活性的聚合体，一般认为活性寡聚糖具有调控植物生长、发育、繁殖、防病和抗病等方面的功能，能够刺激植物的免疫系统反应，每种活性寡聚糖可发出调节特定功能的信息，激活防御反应和调控植物生长，产生具有抗病害的活性物质，抑制病害的形成，特别是不同来源的寡聚糖可针对不同的病原菌(包括生态小种)，从而可开发出针对各类病害的系列寡聚糖农药，解决基因工程遗传育种也很难解决的病原菌生态变异小种的问题。国际上研究较多的是植物及微生物细胞壁多糖降解的寡糖片断。越来越多的实验结果表明，植物细胞壁不仅起到防御的结构屏障作用，而且受到病菌感染时能起到积极防御反应。在植物与病原相互作用中，一方面分泌β-1，3葡萄糖酶，壳聚糖酶和几丁质酶直接抑制真菌的生长；另一方面又分泌多聚半乳糖醛酸内切酶和内切果胶酶降解植物的细胞壁。用裂解酶能在植物与病原的界面得到这些寡聚糖素证实了这些片段的确在活体中起着作用。在体外这些糖苷键裂解酶能将植物及真菌的细胞壁降解成活性的寡聚糖素，因而植物的调节机制肯定涉及到了抑制这些酶部分活性使之能在更长时间内产生寡聚糖素以利于植物的抗病反应。所以糖苷键裂解酶的抑制剂在寡聚糖诱导调节机制中可能起着一定的作用。此过程中所释放的酶解片段-病原菌及植物的细胞壁寡聚糖，很可能就是寡聚糖素在活体中的生成机制。当诱导物被寄主植物识别后，植物必须产生第二信使来传递膜受体上的信号至细胞核内，以导致基因的转录。抗病或感病植物品种之间的差异并不在它们保卫系统的差异，而在于最初的识别及其后信号分子产生的质或量上的不同，寡聚糖素将能缩小此差异。
现有的含有活性寡聚糖植物诱抗剂的制备，通常采用植物提取或植物组织培养提取的技术，由于受到土地面积、一年四季、生长缓慢等因素的限制，大规模批量化生产几乎是不可能的。
本发明的目的是提供一种植物诱抗剂，其具有较高的诱导植物抗性及促进植物生长发育的活性，并且生产成本低廉，污染小，适合于规模生产。
本发明提供了一种植物诱抗剂，其特征在于该植物诱抗剂主要含有寡聚糖，是通过下述方法得到的(1)以禾谷镰孢菌(F.graminearum Schw)为菌种微生物发酵获得大量的菌丝体；(2)将发酵菌丝体在MgSO4盐溶液中用几丁质酶、纤维素酶、菠萝蛋白酶、溶菌酶、脂肪酶、壳聚糖酶之一种或多种进行酶降解，酶用量0.5-3.0％重量，盐溶液的浓度为0.01-0.5％，pH3.0-7.0，反应温度15-60℃，反应时间1-10小时；(3)升温至80-110℃，热水抽提5-20小时。
本发明中所述菌种禾谷镰孢菌(F.graminearum Schw)是一种常见的小麦真菌病菌，属子囊菌，该菌大分生孢子生于单生的近球形侧生瓶状小梗上或生于繁复分支的瓶状小梗上，小梗10-14um×3.5-4.5um.。大分生孢子镰刀形，腹背明显。分生孢子无色，聚集时粉红色。培养基表面有时产生浅红色至橙色的粘物质(粘分生孢子团)。本发明所用菌种为普通的已知菌种，如实施例中采用的菌种分别来源于江苏省农科院植保所保藏菌株F23禾谷镰孢菌；中国菌种保藏中心ACCC30213禾谷镰孢菌株(F.graminearum Schw)；陕西省农科院植保所的GF禾谷镰孢菌。本发明所用菌株可在一般的真菌培养基上生长，如PDA培养基(去皮切片土豆200g，小火煮沸30分钟，过滤，收集滤液，加2.0％葡萄糖及水1000ml)察氏培养基(蔗糖2％，KH2PO40.1％，KCl0.05％，MgSO40.05％，FeSO40.001％，NaNO30.3％，PH6.7)，只是不同的培养基条件下，其生物量有差异。
为了提高生物量，本发明优选的发酵培养基如下蛋白胨0.3-2.0％， 黄豆粉0.5-3.5％，酵母粉0.2-1.5％， 玉米浆0.2-2.0％，蔗糖0.5-2.0％， KH2PO40.6-1.5％，MgSO40.1-1.0％， NaCl 0.01-0.5％。
本发明植物诱抗剂用于防治大豆、烟草、棉花、茄子植物病害时，可以将该产物浸种、叶面喷施或灌根处理，使用浓度为10-2000ppm。
本发明具有如下优点1.采用具有一定细胞壁结构的微生物，通过发酵过程可稳定地获得制备活性的寡聚糖原料。
2.利用生物酶解反应可获得较高生物活性的寡聚糖片段。
3.应用于农作物的病害防治具有高效、无毒、不污染环境及不产生抗药性等特点。
4.在一定程度上能解决病毒病、黄萎病等尚无有效农药防治的农作物病害。
5.原料来源丰富，生产成本较底，有利于实现工业化生产。
下面通过实例对本发明的技术进一步说明实施例1 ACCC30213禾谷镰孢菌在不同培养基上的发酵PDA去皮土豆20％，(w/v)成条，小火煮沸30分钟，八层纱布过滤，收集滤液，加2.0％葡萄糖即可。F1蛋白胨0.3％，黄豆粉2.0％，酵母粉0.2％，玉米浆0.2％，蔗糖2.0％，玉米淀粉1.5％，KH2PO40.6％，MgSO40.1％，NaCl 0.01％。F2蛋白胨0.3％，黄豆粉3.5％，酵母粉0.2％，玉米浆0.2％，蔗糖2.0％，KH2PO40.6％，MgS4 0.1％，NaCl 0.01％。培养10天，25℃，80rpm其培养结果为在培养基PDA、F1、F2中培养的生物量(菌丝干重/发酵液)分别为0.57 1.70 2.13。
实施例2 GF禾谷镰孢菌在不同培养基上的发酵F2培养基蛋白胨0.3％，黄豆粉3.5％，酵母粉0.2％，玉米浆0.2％，蔗糖2.0％，KH2PO40.6％，MgSO40.1％，NaCl 0.01％。F3培养基蛋白胨0.3％，黄豆粉0.5％，酵母粉0.2％，玉米浆0.2％，蔗糖2.0％，玉米淀粉3.0％，KH2PO40.6％，MgSO40.1％，NaCl 0.01％。F4培养基蛋白胨0.3％，黄豆粉0％，酵母粉0.2％，玉米浆0.2％，蔗糖3.5％，玉米淀粉1.0％，KH2PO40.6％，MgSO40.1％，NaCl 0.01％。培养10天，25℃，80rpm。发酵结果表明F2培养基生物量高于培养基F3及F4。
实施例3 F23禾谷镰孢菌发酵放大培养试验在14L的气升式发酵罐中，将800mL的该菌株接种于12L的F2培养基中恒温25℃培养3天，当培养到40小时，生物量可达到1.4％，尤以最初24小时菌的繁殖最快，40小时后增殖缓慢，培养3天比40小时生物量增加很小。这表明，获得同样生物量所需的时间，放大试验比摇床培养大为缩短。但放大试验所能达到的最大生物量却小于摇床培养。这可能是由于供氧情况的不同所致。放大试验连续培养了三批，结果基本重复，未发现有染菌，表明F23禾谷镰孢菌具有很强的竞争生长能力，且生长迅速，适合于工业化生产。
实施例4 GF禾谷镰孢菌及ACCC30213禾谷镰孢菌酶解产物制备在250mL三角瓶中加入100mL培养液，分别将GF禾谷镰孢菌及ACCC30213禾谷镰孢菌的液体菌种接种到F2培养基中，接种量10mL，在25℃下，80rpm摇床培养10天，分别离心、收集菌丝体，用水冲洗干净，然后真空抽滤，烘干后粉碎过筛，获得菌粉。将所得菌粉分别加入0.6M的硫酸镁中，按1.0％(对底物)加入几丁质酶、壳聚糖酶、纤维素酶复合酶酶，40℃下反应，反应结束后，在100℃的水浴中加热10分钟灭活，70℃浸提，4000rpm离心去沉淀，分别得到GF禾谷镰孢菌和ACCC30213禾谷镰孢菌的酶解产物。
实施例5 F23禾谷镰孢菌发酵菌粉酶降解放大试验在25L的搅拌式反应釜中，投发酵菌粉260克，几丁质酶、壳聚糖酶、纤维素酶、菠萝蛋白酶、脂肪酶的复合酶26克和适量的0.6M硫酸镁，搅拌速度100rpm，温度37℃，酶解3小时。发现放大试验所得酶解液诱导小麦PAL(苯丙氨酸解氨酶)活性(表征植物抗病性指标)与100mL反应瓶中一致(表1)，这表明F23禾谷镰孢菌粉酶解反应的放大效应较小。
表1酶解放大试验与摇瓶反应的PAL活性酶解反应PAL活性增加/对照(％)放大试验 39.7100mL摇瓶 41.4实施例6 F23禾谷镰孢菌酶降解物对植物PAL抗性酶生物活性的影响将小麦、大豆种子清洗干净后，加8％NaC10消毒10min，无菌水冲洗3遍后待用。棉花种子用浓硫酸脱绒后，用水清洗干净8％NaC10消毒30min，无菌水冲洗3遍后，55℃温水中浸泡30min，晾干备用。
取酶提液0.4ml于干净的试管中，加2ml冷的0.1M硼酸缓冲液(PH8.8，内含巯基乙醇5mmol/L)。提取液加1ml20mM的L-苯丙氨酸，对照加1ml水，充分混合后，在35℃的水浴中反应45分钟后灭活测定，以反应产物-反式-肉桂酸(t-cinnamic acid)每小时的OD290为0.01为一个活性单位(U)。
不同浓度处理小麦、大豆、棉花种子催芽生长后，其幼苗体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性与对照相比有了不同程度的提高。F23禾谷镰孢菌酶降解物六个浓度处理小麦PAL活性均比对照高，其中以20ug/ml和40ug/ml浓度效果最好。F23禾谷镰孢菌酶降解物三种浓度处理大豆PAL，以50ug/ml效果最佳，所以PAL活性与对照相比增幅不大，但是活性浓度范围应在10-100ug/ml之间。
实施例7 GF禾谷镰孢菌酶解产物在棉花黄萎病防治中的应用实验每处理种量800g，加1600ml药液浸泡棉种24小时，对照用清水浸种24小时，浸种期间搅拌2次，以便处理均匀。处理后捞出种子沥尽水，播种于营养钵内，每钵3粒种子，每处理1000个营养钵，按5个处理设置小区，调查各处理的出苗情况。将营养钵苗移至棉花黄萎病重发田内，每处理小区面积为50平方米，4次重复，随机排列。4月中旬调查出苗和对苗病的防治情况，9月上旬调查黄萎病发病情况。
试验结果表明，GF禾谷镰孢菌粉酶提液对棉花黄萎病有一定的防效，施药方式及浓度不同，防治效果不同。喷药的方式以50ug/ml处理苗期调查防效63.99％最高，甲基拖布津800倍药液防效为43.98％。剖杆调查分别为65.82％和50％。浸种方式，苗期调查，以50ug/ml处理防效100％最高，甲基拖布津800倍药液防效为55.5％。剖杆调查分别为81.8％和63.65％。浸种方式效果优于喷药方式的防效。
实施例8禾谷镰孢菌(ACCC30213)酶解液制剂对大豆花叶病的防治作用本实施例采用禾谷镰孢菌(ACCC30213)为发酵菌株，按F23禾谷镰孢菌的发酵条件，所获得的菌丝体的酶解液制剂在黑龙江省植保站进行了大豆花叶病的标准化田间实验，其防效达70％，增产13％。
实施例9 F23禾谷镰孢菌酶降解物对植物内生菌的影响将经过硫酸脱绒的棉种，播于直径15厘米的营养钵中，待棉花出苗后用F23禾谷镰孢菌酶降解物(稀释200倍)喷雾，每隔3天喷一次。连续喷5次。最后一次喷完后，分不同时间取棉茎分离。待对照出现大量死苗后调查。以喷清水为对照。选用牛肉蛋白胨培养基，采用梯度稀释平板法进行分离。实验结果如下F23禾谷镰孢菌酶降解物对棉茎体内细菌群落的影响
由表可知，喷寡聚糖后棉茎体内细菌群落数量显著下降，等到后期又有回升。
权利要求
1.一种植物诱抗剂，其特征在于该植物诱抗剂主要含有活性寡聚糖，是通过下述方法得到的(1)以禾谷镰孢F.graminearum Schw为菌种微生物发酵获得大量的菌丝体；(2)将发酵菌丝体在MgSO4盐溶液中用几丁质酶、纤维素酶、菠萝蛋白酶、溶菌酶、脂肪酶、壳聚糖酶之一种或多种复合进行酶降解，每种酶所占比例为1％--51％，酶用量0.5-3.0％重量，盐溶液的浓度为0.01-0.5％，pH3.0-7.0，反应温度15-60℃，反应时间1-10小时；(3)升温至80-110℃，热水抽提5-20小时。
2.按照权利1所述植物诱抗剂，其特征在于所述菌株接种于如下配方的发酵培养基蛋白胨0.3-2.0％， 黄豆粉0.5-3.5％，酵母粉0.2-1.5％， 玉米浆0.2-2.0％，蔗糖0.5-2.0％， KH2PO40.6-1.5％，MgSO40.1-1.0％， NaCl 0.01-0.5％。
3.权利要求
1所述植物诱抗剂用于防治大豆、烟草、棉花、茄子植物病害，其特征在于将该产物浸种、叶面喷施或灌根处理，使用浓度为10-2000ppm。
专利摘要
一种植物诱抗剂，其特征在于该植物诱抗剂主要含有寡聚糖，是通过下述方法得到的以禾谷镰孢(F.graminearum Schw)为菌种微生物发酵获得大量的菌丝体；将发酵菌丝体在盐溶液中酶降解，酶用量0.5-3.0%重量，盐溶液的浓度为0.01-0.5%，pH3.0-7.0，反应温度15-60℃，反应时间1-10小时；升温，热水抽提。本发明具有较高的诱导植物抗性及促进植物生长发育的活性，并且生产成本低廉，污染小，适合于规模生产。
文档编号A01N63/00GKCN1122445SQ99122582
公开日2003年10月1日 申请日期1999年12月1日
发明者杜昱光, 白雪芳, 余露, 张铭俊, 刘晓, 林晓蓉, 李曙光, 曲天明, 虞星炬 申请人:中国科学院大连化学物理研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan